本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速鉴定鱼类出血病的分子生物学方法。
背景技术：
随着人口的快速增长，鱼类等水产品作为较为安全的蛋白质来源得到社会的广泛认同，水产养殖业也成为我国快速发展的新型产业。爆发性疾病是阻碍水产养殖发展的重要障碍，气单胞菌属是可引起人、动物、鱼的条件性致病菌，并且在我国广泛的流行，常引起鱼类的大量死亡，为水产养殖行业带来严重的经济损失。因此，快速分离鉴定鱼出血败血症气单胞菌致病因子，并且及时控制制止该病在鱼体间的爆发，找到最佳防治方案是为重中之重，是摆在广大研究者面前的艰巨任务，也已成为近年来养殖鱼类疾病防控等相关研究的热点。国外一些学者将气容素的应用作为研究目标，相比之下我国尚处空白阶段。
毒力基因是气单胞菌属良好的标记，鉴定病原菌的致病性。如今，很难在致病过程中明确或定义其作用，通过测定分离株气单胞菌中几种毒力相关因子的存在对了解气单胞菌的发病机制和流行病学至关重要。气单胞菌感染草鱼并致病是由多种毒力因子共同决定的，气溶素、肠毒素、外膜蛋白等是气单胞菌属中重要的毒力基因，其中，气溶素是维氏气单胞菌主要的毒力因子之一，具有溶血性、细胞毒性和肠毒性，并将气溶素认定为气单胞菌属是否有毒性的依据。而带有肠毒素的病原菌，在宿主体内定植并分泌大量的毒素与细胞不可逆结合，从而导致宿主死亡。外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜的主要结构，是重要的黏附因子和保护性抗原，与细菌的毒力也密切相关。我们检测出了病原菌的气溶素、肠毒素和外膜蛋白三种毒力基因，毒力因子刺激后使鱼类大面积发生炎症，造成病鱼的死亡。
气单胞菌分泌一系列外毒素和胞外蛋白酶等毒力因子，如具有溶血性的气容素、溶血素和外膜蛋白等，这些毒力因子与细菌的致病性相关，相互协同致病且机理极其复杂。christophery.f.wong等人通过删除气单胞菌基因、插入外源基因的方法致溶血素和气溶素的基因沉默后，证明溶血素和气容素联合作用产生溶血和细胞毒性。王春林从24株致病性嗜水气单胞菌中发现，其中22株能够产生胞外蛋白酶，并对2株无毒菌株对比发现，非致病性气单胞菌不能产生胞外蛋白酶，并且具有温敏胞外蛋白酶基因的菌株较仅具有丝氨酸蛋白酶基因的菌株更容易产生消化蛋白酶。汪开毓从杀鲑气单胞菌中提纯了溶血素，并对南方鲇腹腔注射，发现气容素对南方鲇具有很强的致病性及致死性。溶血素具有较广泛的组织损伤性，最终致使多器官衰竭甚至死亡。
白鲢(hypophthalmichthysmolitrix)和草鱼(ctenopharyngodonidellus)，属于鲤形目，鲤科，隶属四大家鱼成员。草鱼是典型的草食性鱼类，生长迅速、个体硕大、鱼肉白嫩、骨刺少、价格低廉，是农贸市场的销售的主要鱼类，含有丰富的不饱和脂肪酸，对血液循环有利，是心血管病人的良好食物；对于身体瘦弱、食欲不振的人来说，草鱼肉嫩而不腻，可以开胃滋补。草鱼性温，具有暖胃和中、平降肝阳、祛风、益肠明眼目的功效；对体虚、头痛、高血压、头痛等疾病的缓解和调养大有益处。鲢鱼内含有的蛋白质、多种维生素、矿物质及氨基酸是人体必需的营养物质，对胃寒腹痛、肺寒咳嗽、皮肤粗糙无光泽均有治疗作用，妇人产后因气血不足而缺乳，常食用大有益处。有健脾补气、温中暖胃、散热的功效，尤其适合冬天食用；可治疗脾胃虚弱、食欲减退、瘦弱乏力、腹泻等症状；还具有暖胃、补气、泽肤、乌发、养颜等功效。在养殖品种日益多样化的今天，白鲢仍以其生长迅速、饲养方便、成本低等优点，在水产养殖中占有不可替代的地位。正是由于这一点，鱼类养殖带来巨大的经济利益，而对水产养殖中疾病的防治无疑具有重要的意义。养殖过程中化学药物和抗生素药物的使用，对水产品质量的影响极大，同时对水质和环境也造成了很大的危害，同时也危害人类的健康。因此通过对病原菌的研究，探究病原菌的发病机理，为提高对病原菌感染的防御能力，控制其对鱼类甚至人类的感染奠定了基础。由于出血病发病快，规模大，并发症较严重，所以怎样快速简单高效的识别出鱼类发病原因，快速找到病原成为制约鱼类疾病控制的先决条件。
本发明从患有爆发性疾病的草鱼、鲤鱼、白鲢等多种经济鱼体内分离得到15种病原菌，其中气单胞菌属有10种，根据气单胞菌的基因序列设计气溶素、肠毒素、外膜蛋白3种毒力基因的特异性引物进行pcr扩增，结果显示80％的菌株都能检测出这3种基因。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题是提供了一种快速鉴定鱼类出血病的分子生物学方法，该方法利用3对气单胞菌特异性引物序列对待鉴定的病鱼体内病原菌毒力基因进行温度梯度pcr扩增，进而实现快速检测出鱼类疾病类别。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种快速鉴定鱼类出血病的分子生物学方法，其特征在于具体步骤为：
(1)通过病鱼尾部静脉取血提取待测病原菌基因组dna；
(2)以待测病原菌基因组dna为模板，利用3对特异性引物对进行pcr扩增反应，该3对特异性引物对序列分别为：
上游引物：5’-cctatggcctgagcgagaag-3’，
下游引物：5’-ccagttccagtgccaccact-3’；
上游引物：5’-agatggtgaccaccaccaagaaca-3’，
下游引物：5’-aactgacatcggccttgaactc-3’；
上游引物：5’-gctgaattcatgaaactcaaattggctc-3’，
下游引物：5’-gcgaagcttttactgttgtacttgc-3’；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，若3对特异性引物对均得到扩增条带，则为气单胞菌感染导致鱼类爆发性出血病。
进一步优选，步骤(2)的具体过程为：以待测病原菌基因组dna为模板进行温度梯度pcr扩增，反应体系组成为：2×easytaqpcrsupermix12.5μl，上游引物和下游引物各1μl，ddh2o9.5μl和dna模板1μl；pcr扩增反应循环程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，50-58℃退火1min，72℃延伸1.5min，共34个循环，最后72℃延伸10min。
本发明提供的气单胞菌毒力基因特异引物能够快速准确地识别出病鱼的病原菌类别，该发明操作简单，无需太多的精密仪器，完全适合在常规条件下进行检测，且可重复性强。
附图说明
图1为利用3对特异性引物序列对8株气单胞菌毒力相关基因的pcr扩增情况，m为dl2000标准分子量。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
表1气单胞菌毒力基因特异性引物序列和片段长度
1、待测病原菌基因组的pcr验证
(1)通过病鱼尾部静脉取血提取待测病原菌基因组dna；
(2)以待测病原菌基因组dna为模板，利用3对特异性引物对进行pcr扩增反应，该3对特异性引物对序列如表1所示；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，若3对特异性引物对均得到扩增条带，则为气单胞菌感染导致鱼类爆发性出血病。
根据genbank中的外膜蛋白ompii、气溶素aer、肠毒素act基因的保守序列，应用软件primer5.0设计引物，由华大基因引物合成。通过温度梯度pcr快速检测气单胞菌毒力基因，反应体系组成为：2×easytaqpcrsupermix12.5μl，上游引物和下游引物各1μl，ddh2o9.5μl和dna模板1μl；pcr扩增反应循环程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，50-58℃退火1min，72℃延伸1.5min，共34个循环，最后72℃延伸10min。
2、不同养殖基地病鱼气单胞菌感染导致鱼类爆发性出血病的快速鉴定
如图1所示，1-3号分别为基因ompii、act、aer毒力基因pcr扩增条带，以此类推，分别为从三个不同养殖基地提取8条病鱼血液中待测病原菌dna扩增情况；图中第4、5、6条鱼中检测到一或两个毒力基因，而第1、2、3、7、8条鱼中能检测三个毒力基因，由此可以鉴定第1、2、3、7、8条鱼为气单胞菌感染导致鱼类爆发性出血病。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
序列表
<110>河南师范大学
<120>一种快速鉴定鱼类出血病的分子生物学方法
<130>2017
<141>2017-12-26
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
cctatggcctgagcgagaag20
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
ccagttccagtgccaccact20
<210>9
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
agatggtgaccaccaccaagaaca24
<210>10
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
aactgacatcggccttgaactc22
<210>11
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>11
gctgaattcatgaaactcaaattggctc28
<210>12
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>12
gcgaagcttttactgttgtacttgc25