牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法。本方法根据靶序列的1个区域设计2条引物和一条探针，该试剂盒包括2×PremixExTaqTM缓冲液、阳性对照、阴性对照和灭菌去离子水。本发明只需要两步法扩增法及简单的反应条件就可以快速、高效、特异性、高灵敏度地检测目的靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，对操作人员没有技术上的要求，检测成本低，检测时间短。
【专利说明】牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测 用引物、试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物病毒分子生物学检验方法领域，具体涉及一种牛疙瘩皮肤病病毒 Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 牛挖瘡皮肤病（Lumpy skin disease, LSD)又称牛结节疫病或牛结节性皮肤病，是 由牛挖瘡皮肤病病毒（Lumpy skin disease virus, LSDV)引起的一种牛的急性、亚急性传 染病，各种牛均易感，被世界动物卫生组织（0ΙΕ)列为必须通报的动物疫病。该病的感染率 为5%?85%，病死率为10% ;其主要临床特征为病牛皮肤表面出现大量疙瘩样结节，体温升 高至40°C以上，消瘦，产奶量聚减约50%。同时，还可致原发性和继发性肺炎，感染的患畜 四肢因患滑膜炎和腱鞘炎而引起跛行，患病母畜流产，公畜暂时或永久不育，严重时导致死 亡；皮张鞣制后具有凹陷或空洞而造成巨大的经济损失，对养牛业危害较大。
[0003] 该病于1929年在非洲的赞比亚地区首次发现，随后50年里LSD在非洲大陆广泛 传播。1943年传播至波扎那，然后传入南非，引起800万头牛只发病，造成了重大的经济损 失。1957年的肯尼亚出现该病并大流行。1971年苏丹出现此病后，LSDV跳过撒哈拉沙漠， 1974年在乍得、尼日尔和尼日利亚被发现；1976年到达象牙海岸，接下来LSDV -直在非洲 大陆周期性的爆发。1977年毛利塔尼亚、加纳、利比里亚均有该病的报道。1981?1986年， 坦桑尼亚、肯尼亚、津巴布韦、索马里、喀麦隆均发生该病，死亡率在20%左右。1989年LSD 在以色列爆发流行，同年以色列建立了非洲外第1个LSD实验室。2006年，埃及爆发LSD，从 2006年1月7日到4月9日294, 576头牛感染该病，其中死亡771头。2006年9月4日， 以色列农业部首席兽医官Moshe Chaimovitz博士宣布以色列发生LSD疫情，共有4000头 牛发病。2007年莫桑比克发生LSD疫情，从1月6?17日，共有2856头牛发病。上述报 道表明，在非洲之外的其他地区也有爆发LSD的危险性。如今，随着国际贸易的日益频繁， 该病毒破击的范围也越来越大，对养殖业的危害也越来越严重。近年来，我国大量从国外引 进种畜，而国内对该病毒还未见有相关研究，因此，为了防止该病毒通过从国外引进种畜或 者进口肉制品而进入我国，在进境时加强对肉制品中牛疙瘩皮肤病病毒的检测显得尤为重 要。
[0004] 荧光定量PCR技术是一种能够快速、准确的检测方法，且具有高灵敏度、高特异 性、较高的稳定性。而TaqMan-MGB是一种新型的探针，3'端经特殊处理的高特异性探针，能 检测模板结合区甚至1个碱基的突变基因，且本底荧光信号低，准确率高。本研究建立了针 对TaqMan-MGB探针的优点，通过对牛疙瘩皮肤病病毒特异保守序列进行设计探针，建立了 高度特异性、高灵敏度，并且稳定性好的检测方法。
[0005] TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团链接在探针的5'末端，淬灭基团则在 3'端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3'端的淬灭基团接近而被淬灭。在 进行延伸反应时，聚合酶的5'外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射 荧光。一分子的产物生成就会伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加， 释放出来的荧光基团不断的积累。因此，TaqMan探针检测的是积累荧光。目前，水解探针 已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具 有高特异性与高敏感性。
[0006] TaqMan-MGB探针是近年来的一种新型探针，它的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基 团，本身不会发生荧光，这样就降低了 PCR反应荧光本底信号的强度，进一步提高了其敏感 性。
[0007] 中国发明专利（申请号为：200710030435. 0、200710030437· Χ、200710132320· 2、 200710026389.7,200810052321.0,200810015001. 8,200810093986. 6,200910041358. 8, 200910251055. 9、200910090037· 7、201010555073· 9、201110339104· X 等）分别公开了采用 荧光定量PCR扩增技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用TaqMan-MGB探针 荧光定量PCR扩增技术检测牛疙瘩皮肤病病毒的试剂盒及检测方法的报道。
【发明内容】
[0008] 为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种牛疙瘩皮肤病病毒 TaqMa-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，第二个目的是提供使用该引物用于牛疙瘩 皮肤病病毒TaqMa-MGB探针实时荧光定量PCR检测的试剂盒，第三个目的是提供使用上述 检测用引物的试剂盒的检测方法。
[0009] 为了实现上述第一目的本发明采用如下技术方案：本检测用引物包括牛疙瘩皮肤 病病毒上游引物，其DNA序列为SEQ ID NO. 1;牛疙瘩皮肤病病毒下游引物，其DNA序列为 SEQ ID N0. 2 ;牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针，其DNA序列为SEQ ID N0. 3。
[0010] 为了实现上述第二目的本发明采用如下技术方案：一种牛疙瘩皮肤病病毒 Taqman - MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性 对照管和灭菌去离子水管，其中： 所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成： DNA序列为SEQ ID NO. 1的10 μ mol/L的牛疙瘩皮肤病病毒上游引物1 μ L ; DNA序列为SEQ ID NO. 2的10 μ mol/L的牛疙瘩皮肤病病毒下游引物1 μ L ; DNA序列为SEQ ID NO. 3的10 μ mol/L的牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针0. 4 μ L ; 2XPremix Ex Taq?缓冲液 8yL; 灭菌去离子水8. 6μ L ; 合计19 μ L,为单次反应的用量； 所述阳性对照管，管内为牛疙瘩皮肤病病毒阳性重组质粒DNA，体积为20μ L ; 具体地，该阳性重组质粒DNA的制备为：核苷酸序列为SEQ ID NO. 4的PCR上游引物和 核苷酸序列为SEQ ID NO. 5的PCR下游引物按常规方法进行PCR扩增，将PCR扩增产物与 PMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA; 所述阴性对照管，管内为无牛疙瘩皮肤病病毒感染的牛组织基因组DNA，体积为 20 μ L ； 所述灭菌去离子水管lmL?2mL。
[0011] 为实现上述第三目的本发明提供一种牛疙瘩皮肤病病毒Taqman - MGB探针实时 荧光定量PCR检测方法：包括如下步骤： 1) 制备待检模板DNA :选用商品化的细胞培养液DNA提取试剂盒，提取待测样品中DNA， 获得待检模板DNA ; 2) 扩增反应体系为：19 μ L扩增反应液；1 μ L待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反 应体系的总体积为20 μ L; 3) 牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增：将步骤2)配制好的扩增反应体系进行PCR扩 增，反应条件：预变性95°C 30s;95°C 5s，60°C 34s (使用ABI 7500议采用34s) 40个循 环；在60°C 34s进行荧光信号的采集。
[0012] 4)结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳 性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
[0013] 本发明的原理是：针对一段靶序列保守区域设计2条引物和一条MGB探针，利用 探针只与模板特异性地结合，其结合的位点在两条引物之间。探针的5,端标记有报告基团 VIC，3,端标记有非淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本低信号的强度。同时探针上 还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，可 以将MGB探针设计的更短，既降低了合成车成本，也使得探针设计的成功率大为提高。这种 实验方法所使用的仪器比较简单，同时克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检 测成本等缺点、此外，该检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简单，不 需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。
[0014] TaqMan-MGB探针荧光定量PCR扩增技术是一种简便、快速、高度特异性的基因扩 增方法。将此基因扩增技术与普通PCR或普通的TaqMan探针技术进行比较，可发现该技术 在灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于上面的技术，且不依赖于任何专门的仪器设备 即可实现现场高通量快速检测。现有的60°C 34s的检测周期较长，约1天，操作繁琐，而本 发明的试剂盒仅需50min左右。
[0015] 本发明的优点是（1)、不需要特殊试剂与设备；（2)、高特异性：应用保守区段， 二条引物及一条MGB探针，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于 99. 6%，假阳性率小于0. 1% ; (3)、快速、高效扩增：检测时间50min左右；（4)、灵敏度高：最 低检测极限达到1. 48拷贝/uL ; (5)、鉴定简便：通过最后的扩增曲线就可以进行结果的精 确的，无需电泳等其他任何分析步骤；（6)、用途：可用于畜产品及其相关产品的快速检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为特异性试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数； 图2为灵敏度试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数； 图3为稳定性试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数； 图4为标准曲线的建立。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1，引物的设计及筛选 牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增引物及探针，其设计是根据GenBank公布的牛疙 瘩皮肤病病毒的参考序列，用MEGA5进行比对，分析序列并在其保守区域进行引物与探针 的设计。采用探针设计软件Primer Express 3.0,设计2套突光定量引物，由英骏(上海)有 限公司合成，利用ABI 7500 FAST PCR仪对反应进程中的扩增情况进行实时监控，对不同引 物组扩增的起始时间、进入最大扩增速率的时间、最大扩增速率及达到平台期所需时间等 参数进行分析，筛选出扩增速率最高、特异性好的一组荧光定量PCR扩增引物，分别标记为 SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 3。其中引物组中牛疙瘩皮肤病病毒上游引物：SEQ ID NO. 1 ; 牛疙瘩皮肤病病毒下游引物：SEQ ID NO. 2;牛疙瘩皮肤病病毒探针：SEQ ID NO. 3 ;SEQ IDN0·l?SEQIDN0·3的浓度分别为10μmol/L，10μmol/L，10μmol/L，体积比为 1:1:1。同时，利用PCR引物软件设计阳性重组质粒DNA的PCR引物，其核苷酸序列分别为： PCR上游引物：SEQ ID NO. 4 ;PCR下游引物：SEQ ID NO. 5 ;它们的体积比为1:1。
[0018] SEQ ID NO. 1 代表的序列为：5' - CCACCCCAATATTCTGCTGC -3' SEQIDN0·2代表的序列为：5'-ACATTAGGGAATCATGTGCAGTGA-3' SEQIDN0·3代表的序列为：5'VIC-TCTTGCTAAAATgCCA-MGB3' SEQIDN0·4代表的序列为：5'-TTGTCAGAAACGAGG-3' SEQIDN0·5代表的序列为：5'-ATGCCTCACTTGTATTTGG-3' 实施例2,阳性对照品的制备 用试剂盒提取牛疙瘩皮肤病病毒细胞培养物的核酸，将其核酸进行PCR及电泳鉴定， 采用PCR上游引物SEQ ID N0. 4和PCR下游引物SEQ ID N0. 5进行扩增，并使用胶回收试 剂盒回收扩增的条带。按照1 :10的比例和PMD19-T载体进行连接反应，4°C连接过夜，转化 DH5 α菌，经抗性选择和PCR鉴定阳性后，再测序验证，利用分光光度计测定其核酸的0D值， 使其260/280的比值在1. 8?2. 0之间。
[0019] 实施例3，阴性对照品的制备 用试剂盒提取无牛疙瘩皮肤病病毒感染的牛组织的DNA，进行PCR及电泳鉴定。
[0020] 实施例4,牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增快速检测方法：包括如下步骤： 1) 制备待检模板DNA :选用商品化的DNA提取试剂盒，提取样品中的DNA，获得待检模 板 DNA ; 2) 扩增反应体系为：19 μ L扩增反应液；1 μ L待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反 应体系的总体积为20 μ L; 3) 牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增：将步骤2)配制好的扩增反应体系进行PCR扩 增，反应条件：预变性95°C 30s;95°C 5s，60°C 34s (使用ABI 7500建议采用34s) 40个 循环；在60°C 34s进行荧光信号的采集。
[0021] 4)结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳 性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
[0022] 实施例5,牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增的特异性试验 采用实施例4的反应体系及反应条件进行特异性的试验，所采用的模板分别是牛疙瘩 皮肤病病毒DNA，绵羊痘病毒DNA，山羊痘病毒DNA，牛痘病毒DNA，羊口疮病毒DNA，阴性对 照。
[0023] 参见图1的结果显示：只有牛疙瘩皮肤病病毒有扩增曲线。图中两条曲线均表示 牛疙瘩皮肤病病毒DNA扩增结果。
[0024] 实施例6,牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增的灵敏度试验 将所建立的牛疙瘩皮肤病病毒质控标准品进行10倍倍比稀释（1.48X 109拷贝/ μ L~l. 48拷贝/ μ L)，采用实施例4的反应体系及反应条件进行灵敏度试验，结果显示出， 建立的该方法最低能够检测出1. 48拷贝/ μ L的DNA样品。
[0025] 参见图2的结果显示：图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的模板浓度，依 次分别为1.48\10 7拷贝/^1^、1.48\106拷贝/^1^、1.48\105拷贝/^1^、1.48\10 4拷贝 /^1^、1.48\103拷贝/^1^、1.48\102拷贝/^1^、1.48\10 1拷贝/^1^、1.48拷贝/^1^。
[0026] 实施例7,牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增的重复性试验 以重组质粒标准品1.48Χ106拷贝/yL与1.48Χ105拷贝/yL为模板，采用实施 例4的反应体系及反应条件进行重复性试验，组内与组间重复试验变异系数为0. 45% ?1. 72%，表明该方法具有较好的重复性。
[0027] 参见图3的结果显示。
[0028] 实施例7,牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增的标准曲线的建立 把重组质粒的标准品进行五个倍比稀释，进行标准曲线的制作，以荧光强度的对数值 为横坐标，循环数为纵坐标作图，得到标准曲线，相关系数R2=〇. 999,扩增效率达到108 %， Y= -3. 141X+38. 54。由此可见本实验所建立的标准曲线的扩增效率较好，其荧光曲线与所 检测的靶基因浓度之间的相关性较好，准确度较高。
[0029] 参见图4的结果显示。
【权利要求】
1. 牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物及探针，其特征在 于：包括牛疙瘩皮肤病病毒上游引物，其DNA序列为SEQ ID NO. 1; 牛疙瘩皮肤病病毒下游引物，其DNA序列为SEQ ID NO. 2 ; 牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针，其DNA序列为SEQ ID NO. 3。
2. 牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于： 包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中： 所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成： DNA序列为SEQ ID NO. 1的10 μ mol/L的牛疙瘩皮肤病病毒上游引物1. 0 μ L ; DNA序列为SEQ ID NO. 2的10 μ mol/L的牛疙瘩皮肤病病毒下游引物1. 0 μ L ; DNA序列为SEQ ID NO. 3的10 μ mol/L的牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针0. 4 μ L ; 2XPremix Ex Taq 缓冲液 8μ?; 灭菌去离子水8. 6μ L ; 合计19 μ L,为单次反应的用量； 所述阳性对照管，管内为牛疙瘩皮肤病病毒阳性重组质粒DNA，体积为20μ L ; 所述阴性对照管，管内为无牛疙瘩皮肤病病毒感染的牛组织基因组DNA，体积为 20 μ L ； 所述灭菌去离子水管lmL?2mL。
3. 根据权利要求2所述牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用 试剂盒，其特征在于：所述阳性重组质粒DNA由如下反应获得； 核苷酸序列为SEQ ID NO. 4的PCR上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO. 5的PCR下游 引物按常规方法进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳 性重组质粒DNA。
4. 根据权利要求2所述牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用 试剂盒，其特征在于：所述DNA序列为SEQ ID NO. 3的牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针的5'端 标记有报告基团VIC，3'端标记有非淬灭基团，同时还连接有MGB修饰基团。
5. 利用权利要求2所述试剂盒进行牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量 PCR检测的非疾病诊断目的的检测方法：包括如下步骤： 1) 制备待检模板DNA :选用商品化的细胞培养液DNA提取试剂盒，提取待测样品中DNA， 获得待检模板DNA ; 2) 扩增反应体系为：19μ L扩增反应液；1 μ L待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反 应体系的总体积为20 μ L; 3) 牛疙瘩皮肤病病毒荧光定量PCR扩增：将步骤2)配制好的扩增反应体系进行PCR扩 增，反应条件：预变性95°C 30s;95°C 5s，60°C 34s 40个循环；在60°C 34s进行荧光信号 的米集； 4) 结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35 个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
【文档编号】C12R1/93GK104152582SQ201410394038
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】聂福平, 杨俊 , 王昱, 李应国, 王国民, 李贤良 申请人:重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心