猪圆环病毒1型感染性克隆及其所拯救的病毒和应用的制作方法

专利名称：：猪圆环病毒1型感染性克隆及其所拯救的病毒和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种病毒的感染性克隆，尤其涉及猪圆环病毒1型感染性克隆以及由该感染性克隆拯救得到的重组猪圆环病毒1型病毒，本发明还涉及该感染性克隆的构建方法以及其用该感染性克隆拯救的病毒在诊断技术中的应用，属于病毒分子生物学及兽医免疫学领域。
背景技术：
：根据猪圆环病毒(Porcinecircovirus,PCV)的致病性、抗原性及核苷酸序列，可以将其分为两个基因型，即PCV1和PCV2。PCVl由德国学者Tischer等(1974)首次从污染的猪肾传代细胞系(PK-15)分离获得，通过人工感染猪试验证实，该病毒没有引起显著临床症状和病理变(TischerI,GelderblomH,VetteermannW,etal.Averysmallporcineviruswithcircularsingle-strandedDNA[J].Nature,1982，295:64-66;TischerI,MieldsW,WolffD,etal.Studiesonepidemiologyandpathogenicityofporcinecircovirus[J].ArchVirol,1986，91:271-276.)。PCV2从断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)患猪分离获得，证实对猪具有致病性(AllanG,MeehanB,ToddD,etal.Novelporcinecircovirusesfrompigswithwastingdiseasesyndromes[J].VetRecord,1998,142:467-468.)。猪圆环病毒是一种圆形小颗粒病毒，直径17nm，呈二十面体对称，无囊膜，基因组由单股负链闭合环状DNA组成，PCVl含有1759bp，PCV2含有1767或1768bp。病毒基因组包括两个大的开放阅读框架(0RFs)，0RF1基因编码病毒复制酶相关蛋白(R印)，0RF2基因编码病毒结构蛋白(Cap)(CheungAK.Transcriptionalanalysisofporcinecircovirustype2[J].Virology,2003,305:168-180.)。PCV1和PCV2全基因组序列的同源性为67%，在0RF1区段同源性为86X，而0RF2区段同源性仅为51%(MeehanBM,CreelanJL，McNultyMS,etal.SequenceofporcinecircovirusDNA:affinitieswithplantcircoviruses[J].JGeneralVirol,1997,78:221-227.)。两种病毒在0RF1所编码的蛋白抗原存在交叉，而0RF2所编码的蛋白抗原不存在交叉(Mah6D,BlanchardP,TruongC，etal.DifferentialrecognitionofORF2proteinfromtype1andtype2porcinecircovirusesandidentificationofimmunorelevantepitopes[J].JGeneralVirol,2000,81:1815-1824.)。因此，PCVl与PCV2之间存在有一定亲缘关系，但也发生了较大的遗传变异。由于PCV2感染猪会导致P丽S或其它症候群成为研究热点，而PCV1的研究报道较少。为深入了解PCV1与PCV2遗传变异，探讨PCV1与其它病原混合感染的致病性，调查我国兽用疫苗中PCV1污染情况，需要开展该病毒的研究。近年来，国内外学者采用不同方式构建了PCV2的感染性克隆，但拯救的毒株均无分子耙标设计，其获得的毒株也无法与亲本病毒相鉴别(FenauxM，OpriessingT,HalburPG，etal.Achimericporcinecircovirus(PCV)withtheimmunogenicPCVtype2(PCV2)clonedintothegenomicbackboneofthenonpathogenicPCVlinducesprotectiveimmunityagainstPCV2infectioninpigs[J].JVirol,2004,78:6297-6303.)。PCV1来源于PK-15细胞污染物，由于该病毒不能够引起细胞病变，分离或克隆该病毒十分困难，给研究工作带来一定影响。迄今为止，对PCVl研究报道相对较少，原因可能与该病毒对猪无致病性有关，没有能够引起研究者关注。然而，PCVl作为PK-15细胞源污染病毒存在，对该病毒的起源与演化，分子遗传变异机制等问题所知甚少；PCVl在疫苗生物制品中污染情况，以及在临床病例中由多种病原混合感染的条件下的致病性如何尚不清楚。通过构建PCV1感染性克隆技术，获得带有分子靶标的克隆毒株，为深入开展该病毒基础研究将具有重要推动作用。
发明内容本发明的目的之一是提供一种PCVl感染性克隆；本发明的目的之二是提供一种构建上述PCVl感染性克隆的方法；本发明的目的之三是提供一种由上述PCVl感染性克隆拯救得到PCVl重组毒株；本发明的目的之四是提供一种用所拯救的重组病毒株用于制备检测猪圆环病毒血清抗体的试剂。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种PCV1感染性克隆，该感染性克隆的一个载体上顺式连接两个PCV1病毒基因组，构成顺式基因功能区；该序列中含有SWI酶切位点。一种构建上述PCV1感染性克隆的方法，包括(1)提取PCVl病毒基因组；以所提取的PCV1病毒基因组为模板，以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2为引物进行PCR扩增；(2)PCR产物经SdI酶切处理及凝胶电泳纯化，插入到相同处理的质粒载体pUC19SaiI酶切位点，得到含PCV1全长基因组质粒；(3)将含PCVl全长基因组质粒先行ScaI完全酶切，再进行Sa』I部分酶切，纯化含病毒全长基因组与载体长臂和短臂的两条泳带，用T4连接酶连接，即得。本研究沿用了构建PCV2感染性克隆的技术路线，首先将PCV1单基因组线性化克隆，再进行双基因组顺式连接，在重组质粒上形成一个完整的病毒基因组调控单元，经质粒转染细胞获得感染性病毒。在构建病毒感染性克隆时，引物设计是关键环节。设计原则一般应避开病毒基因转录区、启动子区和蛋白翻译起始密码子等重要调控元件，尽量不改变基因编码阅读框架和氨基酸编码序列，从而保证了克隆病毒复制酶的功能和对细胞的感染性。本发明在PCV1基因组0RF1编码区末端区设计一对引物，通过计算机软件程序分析，在引物序列中替换两个碱基，形成一个SaiI酶切位点，目的是利用PCR-RFLP法将克隆毒株与亲本野生型病毒相鉴别，证明所获得的克隆病毒的真实性和可靠性。用本发明所构建的感染性克隆成功地拯救出重组病毒，该重组病毒命名为PCV1/G株，其微生物保藏号是CGMCCNO.2658;分类命名是猪圆环病毒l型(Porc化ecir，i潔加ei);保藏时间是2008年8月29日;保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。用本发明PCV1/G株同步接种PK-15细胞后连续带毒传代试验证明，该毒株能够感染细胞，但不产生明显细胞病变(CPE);病毒增殖性能稳定，分子耙标能够稳定遗传；第10代病毒培养物病毒测定为10"TCID5。/mL，基本与亲本病毒相似。通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)在病毒感染细胞中检出病毒抗原，其抗原性仅与PCV1/Cap蛋白单价特异性抗体发生反应，而与抗PCV2/Cap蛋白抗体无交叉本发明克隆毒株带有SWI酶切位点；而野生型亲本病毒不含Sa]I位点。用PCR结合限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)可以将本发明克隆的PCV1/G株与亲本病毒相鉴别从病毒形态学、抗原性、细胞感染性等方面进行分析表明，本发明所构建的PCV1克隆毒株与其亲本病毒相似，通过细胞连续传代，分子靶标能够稳定遗传，且病毒适应性增强，病毒繁殖能力稳定，为今后探讨该病毒的致病性、遗传变异规律、分子诊断等方面奠定了重要的基础。采用免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法，本发明拯救的重组PCV1/G株可应用于检测猪圆环病毒1型(PCV1)血清抗体。本发明对IPMA抗原反应板的制备、被检血清稀释倍数、酶标抗体及底物显色液等进行了系统试验。用IPMA法对已知PCV1和PCV2参考阳性血清进行试验表明，血清稀释倍数21:100可消除两种病毒间存在的低水平交叉反应。该方法与用昆虫杆状病毒表达的PCVl-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA检测符合率为88.9。/。,与其它几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应。对来自黑龙江、吉林、河北、上海、辽宁等地猪场送检的257份血清样品进行检测，PCV1和PCV2血清抗体阳性检出率分别为19.1%、80.5%。PCV1抗体阳性猪中有95.9。/。为PCV2阳性，表明我国猪群已存在PCV1感染，在临床上PCV1与PCV2多以混合感染形式存在。本发明建立的PCV1-IPMA方法具有操作简便、特异和敏感等特点，可为PCV1流行病学调查及血清抗体检测提供了一种技术手段。图1重组质粒SamHI与ffi;idIII酶切反应鉴定1:单基因组加载体；2:双基因组加载体；3:空载体；M:DNAmarkers。图2PCV1/G株病毒抗原检测与血清学交叉反应；A:PCV1/G株加anti-PCVl/Cap血清；B:PCV2加anti-PCVl/Cap血清；C:阴性对照；D:PCV1/G株加anti-PCV2/Cap血清；E:PCV2加anti-PCV2/Cap血清；F:阴性对照。图3PCR-RFLP法鉴别PCV1/G克隆毒株与PCV1亲本病毒；1:克隆病毒的PCR产物的SaJI酶切结果；2:亲本病毒的PCR产物的SdI酶切结果。图4PCV1/G株免疫电镜形态学观察。图5PCV1和PCV2毒种的PCR鉴定结果。图6用IPMA方法检测猪血清中PCV1抗体试验。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1感染性克隆的构建、重组病毒的拯救、传代与测定1材料和方法1.1病毒、细胞、抗体、菌株及载体从污染的猪肾传代细胞系(PK-15)获得PCV1病毒基因组；基因克隆所用的大肠杆菌菌株(Top10)、载体(pUC19)及限制性内切酶类为宝生物工程(大连)有限公司产品；转染试剂Lipofectamine2000和RPMI1640培养液为Gibco产品；PCV1-free猪肾传代细胞系(PK-15)由国外引进。兔抗PCV1/Cap和PCV2/Cap重组蛋白单因子血清自制。1.2引物设计与PCR扩增根据GenBank提供的PCV1序列NC001792设计引物PCV1-F907:5'-GTCGACGGAAGTACCCGAAGGCCGATTTGA-3，(SEQIDNO.1)，对应序列为907936;PCV1-R912:5，-GTCGACTGTTCTCCAGCAGTCTTCCA-3，(SEQIDNO.2)，对应序列为887912。下划线斜体字母表示替换的碱基，构成SaJI酶切位点。病毒DNA按文献(LiuC，WeiY，ZhangC,etal.Constructionandcharacterizationofporcinecircovirustype2carryingageneticmarkerstrain[J].VirusResearch,2007,127:95-99.)方法提取，TaKaRaExTaqPCR试剂盒进行扩增，条件为预变性94。C2min，35个循环[94。C30s，60°C30s，72°C1.5min]，延伸反应72。C7min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.3病毒基因组克隆与测序PCR产物经SaI酶切处理及凝胶电泳纯化，插入到相同处理的质粒载体pUC19Sa』I酶切位点，操作程序按文献(LiuC,WeiY,ZhangC,etal.Constructionandcharacterizationofporcinecircovirustype2carryingageneticmarkerstrain[J].VirusResearch,2007，127:95-99.)。采用373A型DNA序列仪测序(Perkin-Elmer试剂盒)，DNAsis软件进行序列分析。1.4感染性分子克隆构建及鉴定含PCV1全长基因组质粒先行SeaI完全酶切(pU19载体上单酶切位点)，再进行SWI部分酶切(插入基因组两侧酶切位点)。凝胶纯化含病毒全长基因组与载体长臂和短臂的两条泳带，用T4连接酶连接获得一个载体上顺式连接的两个病毒基因组，构成顺式基因功能区，获得PCV1感染性克隆。用插入位点两侧的Ba/HHI与//kefIII进行酶切反应鉴定。1.5重组质粒细胞转染用6孔培养板接种1.5X105个细胞/孔，置37°C5%0)2培养在24h达到6080%单层时用于转染试验。用无血清0ptiMEM培养液(GibcoBRL)洗涤细胞1次，将1.2l^g纯化的感染性克隆质粒转染PK-15细胞，用Lipofectamine2000试剂进行转染，按说明书进行。转染后细胞置37°C5%0)2条件下培养至72h，收获转染细胞培养物上清。1.6病毒拯救与传代按5%接种量将收获的上清液同步加入到新消化的细胞悬液中，混合后置37°C5%0)2条件下静置培养24h形成单层，按文献(TischerI,PetersD,RaschR，etal.Replicationofporcinecircovirus:inductionbyglucosamineandcellcycledependence[J].ArchVirol，1987,96:39-57.)方法进行D-氨基葡萄糖处理。培养72h后收取病毒培养物，经3次冻融后同步接种细胞进行传代。1.7病毒抗原性及含量测定用兔抗PCV1/Cap单因子血清进行免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)(LiuC,IharaT，NunoyaT，etal.DevelopmentofanELISAbasedonthebaculovirus-expressedcapsidproteinofporcinecircovirustype2asantigen[J].JVetMedSci，2004，66:237-242.)测定病毒的抗原反应活性。将病毒液作10倍系列稀释测定病毒含量，取各稀释度分别接种96孔板，每个稀释度设4L(100"L/孔)，同步加入新消化的PK-15细胞(100uL/孔)，置37。C5%(:02培养72h，甩掉细胞培养液，用PBS(pH7.4)浸洗一次，固定细胞后进行IPMA测定。用IPMA法对几种猪病毒参考血清进行抗原交叉反应试验。1.8病毒形态学观察取病毒感染后72h细胞，用PBS洗涤细胞3次，预留0.5mLPBS冻融3次，12000r/min离心20min取上清，加入终浓度为1%的PCV1阳性血清混合，4。C感作过夜，12000r/min离心20min，沉淀用0.lmLPBS溶解，2%磷钨酸液(pH6.8)负染制样，进行免疫电镜观察。1.9克隆毒株与亲本病毒鉴别根据GenBank提供的PCV1序列NC001792设计引物。PCV1-F42:5，-TGMMTGCCAAGCAAGMAAGCGG-3，(SEQIDNO.3)对应序列为4771;PCV1-R1102:5，-ACAGCCCAMATTATGTGGTAAGGC-3，(SEQIDN0.4)对应序列为10771102。扩增目的基因片断长为1061bp，PCR反应条件同1.2项，获得的PCR产物进行Sa]I酶切鉴别克隆毒株与亲本病毒。2试验结果2.1基因克隆与序列分析PCV1基因组PCR扩增产物约1.7kb，经SdI酶切消化，克隆到pUC19载体(2686bp)。取3个阳性克隆进行序列测定，结果一致，未发现碱基错配和缺失。PCV1基因组全长1759bp，含0RF1和0RF2编码区，测序结果与GenBank登录的PCV1序列AF071879，NC001792和Y09921进行比较，核苷酸序列同源性大于99.9%。2.2感染性克隆的构建对含PCV1单基因组重组质粒进行SeaI完全酶切消化，然后用SaiI进行部分酶切消化，凝胶电泳回收含单基因组的长臂(基因组1759bp+部分载体1747bp)和另一含单基因组短臂(基因组1759bp+部分载体939bp),将两者连接后获得含双基因组顺式排列的重组质粒(双基因组3518bp+载体2686bp)，获得的重组质粒命名为pUC/PCVl。2.3重组质粒酶切鉴定对纯化的含PCV1双基因组重组质粒进行Sa/nHI和//i;^III酶切鉴定。如图1所示，泳道1为含单基因组重组质粒酶切反应，获得单基因组与载体两条带，分别为1759bp和2686bp;泳道2为含双基因组重组质粒酶切反应，获得双基因组与载体两条带，分别为3518bp和2686bp;泳道3为空质粒对照。2.4克隆病毒检测与血清学交叉反应用兔抗PCVl/Cap抗体进行IPMA法检测拯救病毒，如图2所示，克隆的病毒感染细胞呈棕红色(图2A)，对照细胞无着色(图2C);病毒感染的阳性细胞呈点式分布，抗原主要聚中在细胞浆和细胞核内。结果表明，用构建的感染性克隆成功地拯救出重组病毒，命名为PCV1/G株。用兔抗PCV2/Cap单因子血清与PCV1/G株进行抗原交叉试验结果显示，两种病毒无血清学交叉反应(图2B、2E);同时与其它几种猪病毒参考血清(PRRSV、PPV、PRV、CSFV)也无交叉反应。2.5克隆毒株与亲本病毒鉴别从PCV1/G株第10代培养物提取DNA为模板，连同与亲本病毒基因组一起，用PCV1-F42和PCV1-R1102引物分别进行PCR扩增，其产物预测为1061bp。由于克隆毒株带有SWI酶切位点，用SdI酶切其PCR产物，获得195bp和866bp两个片段；而野生型亲本病毒不含Sa〗I位点，酶切后片段不变。用PCR结合限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)将克隆的PCV1/G株与亲本病毒相鉴别(图3)。2.6克隆毒株形态学观察免疫电镜形态学观察显示，克隆病毒粒子与特异性抗体结合后，形成了巨大的免疫复合物(图4)，其中单个病毒呈圆形颗粒，直径约17nm，与文献(TischerI,GelderblomH,VetteermannW，etal.Averysmallporcineviruswithcircularsingle-strandedDNA[J].Nature,1982,295:64-66.)报道的PCVl形态一致，未发现有其它外源病毒污染。2.7克隆病毒细胞感染特性用PCV1/G株同步接种PK-15细胞后连续带毒传代试验证明，该毒株能够感染细胞，但不产生明显细胞病变(CPE);病毒增殖性能稳定，分子靶标能够稳定遗传；第IO代病毒培养物病毒测定为1048TCID5。/mL，基本与亲本病毒相似。试验例11材料和方法1.1病毒、抗体、细胞PCV1/G株为本发明实施例1所构建。PCV1和PCV2阳性血清及阴性血清由本方面人实验室提供；几种猪病毒参考阳性血清由申请人相关课题组提供。PK-15细胞系由国外引进，经PCR检测无PCV1污染，用于病毒增殖，细胞培养液为RPMI1640，添加10%犊牛血清(FCS)和青霉素、链霉素；辣根过氧化物酶-葡萄球菌A蛋白标记物(服P-SPA)为Zymed产品；3_氨基-9-乙基咪唑(AEC)为Sigma产品；其它化学试剂为国产分析纯试剂。1.2PCR鉴别试验根据GenBank发表的PCV1序列(NC001792)和PCV2序列(AF201311)设计引物。PCV1-F:5，-TTGCTGAGCCTAGCGACACC-3，；PCV1-R:5，-TCCACCTGCTTTCAMTCGGCC-3，用于扩增PCV1片段为349bp。PCV2-F:5，-TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT-3,和PCV2-R:5，-CCGCACCTTCGGATATACTG-3，用于扩增PCV2片段为263bp。按常规方法提取病毒DNA，TaKaRaExTaqPCR试剂盒进行基因扩增。PCR反应条件预变性94°C2min，35个循环[94。C30s，60°C30s，72°C1.5min]，延伸反应72°C7min。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，用于PCV1和PCV2种毒的鉴别。1.3病毒增殖与毒价测定用PCV1/G株第18代作为毒种，按10%同步接种于新消化的PK-15细胞悬液(2X10VmL)，病毒维持液为含2%FCSRPMI1640,病毒培养物于37'C培养120h，经三冻融后收获，经3000r/min离心10min，取上清小量分装于-8(TC保存，用IPMA方法测定毒价，达到lX105TCID5。/mL以上用于制备IPMA反应板。1.4IPMA反应板的制备按5%、10%和15X种毒剂量同步接种PK-15细胞悬液，以100叱/孔分注于96孔板中，同时设未接种病毒细胞对照。置37'C5%0)2条件下培养形成单层，用丙酮-PBS固定，干燥后置-2(TC保存备用。1.5IPMA操作程序取IP區反应板置室温预热，用PBS浸洗一次，用PBS将待检血清按1:25起进行2倍系列稀释，同时作阳性血清、阴性血清和未接毒细胞对照，加样量为100叱/孔。置37。C湿盒孵育lh。PBS洗3次，加入l:3000稀释的HRP-SPA(100叱/孔)，置37。C湿盒孵育lh，PBS洗3次，加入AEC底物液显色30min，用光学显微镜观察判定结果。1.6PCV1与PCV2血清学交叉反应测定将已知PCV1和PCV2阳性参考血清分别做l:251:12800系列稀释，分别进行两种病毒的IPMA交叉反应试验，同设未接毒细胞对照。1.7PCV1-IPMA特异性、敏感性和重复性试验用己知猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)参考血清进行交叉反应试验。将PCV1阳性血清进行1:1001:12800系列稀释，进行IPMA敏感性试验。制备三批IPMA反应板，选用阳性和阴性血清各5份，用相同批次和不同批次三个IPMA反应板进行批内和批间重复性试验。1.8PCV1-IPMA与ELISA符合试验用IPMA与昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白作抗原建立的间接ELISA方法，进行符合试验。1.9临床血清样品的检测对来自黑龙江、吉林、河北、上海、辽宁等地猪场送检的257份血清样品进行PCV1-IPMA和PCV2-IPMA检测。2试验结果2.1PCV1和PCV2毒种鉴定对试验使用的PCV1和PCV2毒种及PK-15细胞系进行了PCR交叉反应鉴定。如图5所示，泳道13为PCV1特异性引物进行的PCR反应；泳道46为PCV2特异性引物进行的PCR。第2、5泳道为PCV1提取的核酸，PCV1-PCR扩增出349bp片段(2泳道)；第3、4泳道为PCV2提取的核酸，PCV2-PCR扩增出263bp片段(4泳道)；第1、6泳道为PK-15细胞系对照。PCR鉴定结果证明，用感染性分子克隆分别构建的PCV1/G株与PCV2株制备的种毒纯净，无交叉污染；所用的PK-15细胞系也无这两种病毒污染。因此，上述2个毒株和细胞系可用于IPMA反应板的制备。2.2PCV1-IPMA反应条件的测定用PCV1/G株培养物病毒含量为1.3X105TCID5。/mL制备IPMA反应板。按10%接种量同步接种PK-15细胞，培养至72h固定；被检血清样品以1:25起进行2倍系列稀释；HRP-SPA的工作浓度为1:3000稀释；AEC底物液显色30min。PCV1阳性血清与病毒感染细胞染色呈棕红色(图6A)，与对照健康细胞染色无着色(图6B)，作为IPMA阳性判定标准；PCV1阴性血清与病毒感染细胞和健康细胞对照孔染色均无着色反应判为阴性。2.3PCV1与和PCV2血清抗体交叉反应测定以己知PCV1和PCV2标准毒株制备IPMA反应板，分别与系列稀释的PCV1和PCV2参考阳性和阴性血清进行交叉反应，结果见表1。IPMA检测结果表明，在血清稀释倍数为1:25和1:50，两种病毒存在低水平的血清抗体交叉反应;但血清稀释度大于l:100以上，完全消除了这种低水平的抗体交叉。因此，用PCV1和PCV2建立的IPMA方法均可用于检测各自病毒产生的特异性抗体。表1用IPMA法检测PCV1与PCV2血清抗体交叉反应试验结果IPMA检测255010020040080016003200640012800PCV1阳性血清+++++++++—PCV1抗原PCV2阳性血清+阴性血清PCV1阳性血清+±PCV2抗原PCV2阳性血清++++++++++阴性血清2.4PCV1-IPMA特异性、敏感性和重复性试验对几种猪病毒参考血清(PPV、PRV、TGEV、PEDV、CSFV和PRRSV)进行的IPMA交叉反应试验结果表明，除PCV1阳性血清呈阳性反应外，其他几种猪病毒参考血清均呈阴性反应，证明对这几种病毒无血清学交叉反应。敏感性试验结果表明，当PCV1阳性血清稀释至1:6400，还能检测到阳性反应结果，证明该方法敏感性较高。用同批次和不同批次进行的PCV1-IPMA试验结果表明，该方法获得的结果重复性良好。2.5IPMA与ELISA符合试验用PCVl-IPMA与用昆虫杆状病毒表达的PCVl-Cap重组蛋白抗原包被ELISA方法，对54份临床血清样品进行了平行检测试验。结果表明，PCV1-Cap/ELISA13检测样品中有35份阳性和19份阴性，而IPMA法检测有40份阳性和14份阴性。这两种方法总符合率为88.9%，其中阳性符合率为97.1%，阴性符合率为73.7%。2.6对临床样品检测结果用PCV1-IPMA和PCV2-IPMA对来自黑龙江、吉林、河北、上海、辽宁等地9个猪场送检的257份血清样品进行检测(表2)。结果表明，PCV1-IPMA血清抗体阳性检测率为19.1%，其中已知备母猪血清样品阳性检出率为35.9%(28/78),仔猪血清样品阳性检出率为9.8%(10/102)。PCV2-IPMA抗体阳性检测率为80.5%，显著高于前者，其中PCVl抗体阳性猪中有95.9y。(47/49)为PCV2抗体阳性。试验结果表明，我国猪群已存在PCV1感染，且PCV1和PCV2在临床上多以混合感染形式存在。表2用IPMA法对现地临床送检血洁中:PCV1和K:V2抗体检测结果猪场别血清样本PCV1-IPMAPCV2-IPMA阳性数阴性数检出率(％)阳性数阴性数检出率(％)TN3092130.029196.7DZ2962320.722775.9SFH2361726.119482.6TY20101050.019195.0JMS101910.06460.0AC3260.03260.0见3843416.3191950.0WJ4363714.035881.4HB594556.855493.2总计2574920819.12075080.5序列表<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所<120>猪圆环病毒l型感染性克隆及其所拯救的病毒和应用<130>KLPI0788<160>4<170〉Patentlnversion3.1<210〉<211〉<212><213〉30Porcinecircovirus<咖>1gtcgacggaagtacccgaaggccgatttga<210〉2〈211〉26<212>DNA<213〉Porcinecircovirus<400>2gtcgactgttctccagcagtcttcca<210〉3<211>25<212>腿<213〉Porcinecircovirus3026<400>3tgaaaatgccaagcaagaaaagcgg<210>4<211>25<212>DNA<213>Porcinecircovirus25<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>权利要求1、一种猪圆环病毒1型的(Porcinecircovirus1)感染性克隆，其特征在于该感染性克隆的一个载体上顺式连接两个PCV1病毒基因组，构成顺式基因功能区。2、按照权利要求l所述的感染性克隆，其特征在于PCV1感染性克隆中含有Sa〗I酶切位点。3、按照权利要求l所述的感染性克隆，其特征在于所述载体是pUC19质粒载体。4、一种构建权利要求1-3任何一项所述感染性克隆的方法，包括(1)提取PCVl病毒基因组；以所提取的PCV1病毒基因组为模板，以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2为引物进行PCR扩增；(2)PCR产物经SdI酶切处理及纯化，插入到相同处理的质粒载体pUC19Sa_ZI酶切位点，得到含PCV1全长基因组的质粒；(3)将含PCVl全长基因组的质粒先行ScaI完全酶切，再进行Sa〗I部分酶切，纯化含病毒全长基因组的产物以及载体长臂和短臂的产物，用l连接酶连接获得。5、由权利要求1-3任何一项所述感染性克隆拯救获得的重组猪圆环病毒1型毒株。6、按照权利要求5所述的重组猪圆环病毒1型毒株，其特征在于所述重组猪圆环病毒1型毒株的基因组带有-一个SaH内切酶位点。7、按照权利要求6所述的重组猪圆环病毒1型毒株，其特征在于其微生物保藏号是CGMCCNO.2658。8、权利要求5所述的重组猪圆环病毒1型毒株在制备检测猪圆环病毒抗体的试剂或药物中的用途。全文摘要本发明公开猪圆环病毒1型感染性克隆及其所拯救的病毒和应用。本发明将猪圆环病毒1型2个基因组顺式连接插入到载体中构建得到感染性分子克隆。该感染性分子克隆中插入SalI酶切位点作为分子靶标，所拯救出的重组病毒(PCV1/G株)带有分子标记，其保藏号是CGMCCNO.2658。本发明重组病毒的抗原性仅与PCV1/Cap蛋白单价特异性抗体发生反应，而与抗PCV2/Cap蛋白抗体无交叉。可用PCR结合RFLP将其与亲本病毒相鉴别。本发明毒株体外培养增殖性能稳定，病毒滴度高，所拯救的毒株可用于检测该病毒抗体。本发明为今后开展猪圆环病毒的起源与演化、遗传变异规律、分子鉴别诊断等研究奠定了基础。文档编号C12N7/01GK101423836SQ20081017365公开日2009年5月6日申请日期2008年11月5日优先权日2008年11月5日发明者刘长明,危艳武,张朝霞,婧袁,陆月华,黄立平申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所