B-raf激酶抑制剂易感性的诊断检测的制作方法

专利名称：B-raf激酶抑制剂易感性的诊断检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测BRAF中的突变的方法和试齐搶。
背景技术：
6藩基因编码B-Raf， 一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其用于耦f^人激舌RAS 至下游MAPK激酶的信号传导(Wellbrocke^/., C朋cer他乂 64: 2338-2342， 2004)。 B-Raf中的癌基因突变将导致激酶功會紛皮获得(gain-of-kinase-fimction)， 从而导致在典型生长因子缺乏情况下Raf-MEK-ERK途径的组成性激活。该组 成性激活与转移性黑素瘤预后较差相关(Houben " W.， 2004，滞/7ra)。说MF 中的激活突变在多种恶性肿瘤中已有报道。例如，说MF中的突变在多达70% 的人黑素瘤病例中被发现。外显子15第600密码子核苷酸位置1799的单 突变(》A)，导致缬氨輕谷氨酸取代(V600E)，该取代在85 %以上的具有B-Raf 中的突变的黑素瘤中存在(Davies"a/., Atow陀417: 949-954， 2002; Gamettand Marais， Q cerCe//6: 313-319， 2004; Gray陽Schopferefa/., C朋ce7-她toto57》7 ev. 24: 165-183， 2005; Houben etal.， 2004)。不太常见的是，V600E突变由核苷 酸位置1799-1800的两石JIS突变TG〉AA产生(Houbenef, JCara"og， 3: 6， 2004)。
许多激W^制剂是己知的，包括抑制B-Raf的那些抑制剂。这样的抑制剂 包括？1^4032，其选择性抑制8-1131^60(^激酶活性。本发明提供了鉴定￥600￡-阳性患者以选择用于采用B-Raf激,制剂，例如PLX4032进行的治疗的方法。

发明内容
本发明提供了对可用B-Raf激謝卬制剂进行治疗的候选患者进行检观啲方 法和组合物。因此， 一方面，本发明提供了鉴定癌细M B-Raf抑制剂敏感性 的方法，该方法包括(i)提供来自癌症患者的癌细胞的核酸样品；(ii)用扩增 靶多核苷 歹啲弓嫩对，对核酸样品中的靶多核苷齢列进行扩增，其中所述耙多核苷酸序列包括说MF中的V600E突变位点，并且所述扩增在标记的寡
核苷酸探针存在下进行，其中所述标记的寡核苷酸探针包括SEQ ID NO: 1所 示序列的至少15个B比连的(contiguous)核苷酸，其检测说MF中V600E突变 位点上的突变序列的存在；以及(iii)检测S，中V600E突变是否存在；由此 确定该癌症对B-Raf抑制剂的敏感性。在某些实施方式中，^^针具有如SEQID NO: 1所示的核苷,列。扩增可以在第二探针存在的情况下进行，所述第二 探针检测在V600E突变位点的野生M^歹啲存在。在某些实施方式中，第二探 针包括SEQIDNO: 2的至少15个核苷酸。在某些实施方式中，第二探针具有 SEQIDNO: 2所示的核苷,列。在某些实施方式中，^^针可以用荧光标记予 以标记。探针也可以用两种标记予以标记，其中一种标记为荧光染料，另一种 标记则为淬灭部分。
在某些实施方式中，用于扩增反应的引物对的两个引物，都与SiMF的外 显子15杂交。在某些实施方式中，用于扩增反应的引物对中的一个引物，包括 SEQIDNO: 3所示核苷酸序列的至少15个耻瞎的核苷酸，例如引物对中的一 个引物具有SEQ ID NO: 3所示的核苷辦列。在进一步的实施方式中，弓嫩 对中的一个引物包括SEQ E)NO:4所示核苷,列的至少15个舭连的核苷酸。 例如，该引物可具有SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列。在进一步的实施方式 中，用于扩增的引物对包括具有SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示核苷酸 序列的引物。
在某些实施方式中，扩增反应步骤包括RT-PCR。
本方法可用于检测在B-Raf氨基酸位置600上具有突变，例如V600E突变 的癌症。在某些实施方式中，癌症为黑素瘤。在其他实施方式中，癌症为结肠 癌或甲状腺癌。在某些实施方式中，用于本发明方法以检测突变的核酸样品可 获自皮肤活检。在其他实施方式中，样品获自结肠活检。样品也可获自石蜡-包 埋组织。本发明方法可进一步包括记录这样的诊断患者对B-Raf抑制剂敏感， 例如突变体特异性B-Raf抑制齐收t!PLX4032。在某些实施方式中，本方法进一 步包括对患者给予B-Raf抑制剂。B-Raf抑制剂可以是突变体特异性B-Raf抑制 剂(mutant specific B-Raf inhibitor),如PLX4032。
在另一方面，本发明提供了 PLX4032治疗候选患者的鉴定方法，该方^ 括提供获自个体(subject)的样品；从样品中检测含^MF V600E突变的生物^T，从而鉴定PLX4032治疗候选患者。在某些实施方式中，所述生物分子
是核酸。在其他实施方式中，生物分子是多肽。多肽可以获自例如来自患者的 含癌细胞的样品。在某些实施方式中，多肽可用免疫分析进行检测。该方法也
包括将PLX 4032给药至所述个体。
在另一方面，本发明提供了检测用B-Raf抑制剂治疗的{|魏患者的试剂盒， 其中所述试剂盒包括第一等位基因特异性探针，其中所述第一探针检测说MF 中的V600E突变，并且其包含SEQIDNO: 1所示序列的至少15个耻旌的核苷 酸。在某些实施方式中，所述探针具有SEQIDNO: l所示的核苷fr游列。本 发明试剂盒可进一步包括第二等位基因特异性探针，其中所述第二探针检测野 生型S^4F序列，并且其包含SEQIDNO: 2所示核苷li^列的至少15个耻旌 的核苷酸。在某些实施方式中，第二^^针具有SEQ ID NO: 2所示的核苷, 列。
在进一步实施方式中，本发明试剂盒进一步包括扩增含V600E突变位点的 ^MF靶区域的引物对。例如，弓I物对可以包括含有SEQK)NO: 3所示核苷酸 序列至少15个fflt涟核苷酸的弓嫩。在某些方面，弓嫩具有SEQIDNO: 3所示 的核苷& 列。在其他实施方式中，引物对可以包括含有SEQ IDNO: 3和SEQ ID NO: 4所示核苷,列的至少15个耻旌核苷酸的引物。在某些实施方式中， 引物对包括具有SEQIDNO: 3和SEQ ID NO: 4所示核苷酸序列的引物。
因此，在某些实船式中，本发明的试剂盒包括具有SEQ ID NO: l所 示核苷,歹啲探针；具有SEQ ID NO: 2所示核苷鹏列的探针；具有SEQ ID NO: 3所示核苷,歹啲引物；和具有SEQH)NO: 4所示核苷辦列的引物。


图1显示了B-RafV600E扩增子(SEQIDNO: 5)与染色体X相应区(SEQ ID NO: 6)的比对。B-RafV600E引物位置以箭头显示。扩增子包括外显子15 (大写字母)和内含子15 (小写字母)的部分。垂13^接线，^^F和染色 体X序列同一性的位置。密码子600被框起来；GTG对应缬氨酸(V)。探针 结合区以阴影高亮显示；突变(MU)探针t徵生型(WT)探针要长两个核苷 酸(在高亮区的5'-CT)，两个探针都结合此处所示序列的互补序列。
图2显示了围绕编码子600 (箭头)的B-Raf外显子15区(SEQ IDNO: 7)与A-Raf (SEQIDNO: 8)和C-Raf (SEQIDNO: 9)同源区的比对。星号标 示了相对B-Raf序列的氨基酸差异(例如，Mercer &Pritchard，历oc/ /w说b/ / ， Jctol653: 25-40， 2003)。
图3显示了B-RafV600E扩增子(SEQIDNO: 5)与^4P (编码A-Raf) (SEQK)NO: 11)和i^4W (编码C-Raf) (SEQIDNO: 10)基因相应序列的 比对。小写核苷酸不同于万7MF序列。
具体实施方式
定义
在本申请上下文中，"V600E"是指SiMF中的突变(在核苷酸位置1799 !>八的突变)，其在B-Raf氨基酸位置600导致谷氨翻安取代缬氨酸。"V600E" 在先前计数系统中，也称为"V599E" (1796T>A) (Kumar " a/. ， C證r版 9: 3362-3368， 2003)。
在本发明上下文中，"B-Raf激,制剂"抑制B-Raf激酶的活性。这样的 抑制齐吔可抑制包括其他raf激酶在内的其他激酶的活性。
用在本文中的"突变体特异性B-Raf激酶抑制剂(mutant-specific B-Raf kinase inhibitor)",是指对突变体B-Raf,例如与野生型B-Raf相比在氨基酸位置 600有缬氨^^基上的突变如V600E突变的突变体B-Raf，有选择性的B-Raf 抑制剂。与野生型相比，这样的抑帝跻树突变体B-Raf，例如具有V600E突变 的B-Raf，有至少两倍、JEffi常至少三倍、或者更多倍数的抑制效能。例如，在 某些实施方式中，"突变体特异性B-Raf抑制剂"对V600EB-Raf有约30nM的 激WU制活性IC50 (生化分析)，而对野生型B-Raf的相应ICso约为100nM。效 能也可根据细胞分析的IC50值进行比较，例如对生长抑制进行测量的细胞分析。 本发明内容中的"突变##异性B-Raf抑制剂"，也可抑制除B-Raf之外的激酶， 例如其他的raf激酶。
术语"杂交"是指因互,喊基M而由两个单链核酸形成双链结构。杂交 可以在完全互补的核酸链之间形成，也可以在含少量错配区域的核MI连之间形 成。在本文中，术语"基本上互补"是指除少量错配区域外互补的序歹ij。典型 地，对长度约15个核苷酸的序列，杂交区错配的核苷酸总数不超过3个核苷酸。 仅允许完全互补的核酸链杂交的条件，被称为"严谨"或"序列特异性"的杂2
交条件。基本上互补核酸的稳定双链，可在严谨度更低的杂交斜牛下取得。核 酸技术领域的技术人员，可以从经验上考虑多种可变因素，包括例如寡核苷酸 的长度和碱基对浓度，离子强度，以及错配碱基对的存在频率，来确定双链的
稳定性。例如，计算双链稳定性的计算机软件，可从National Biosciences, Inc.(Plymouth， Mnn.)商业获得，例如OLIGO第5版；或者从DNA Software (Ann Arbor， Mchigan)商业获得，例如Visual OMP6。
允许寡核苷酸仅与完全互补耙序列杂交的严谨的序列特异性的杂交斜牛是 本领域公知的(参见例如，常规参考内繊供在检测核辦歹哆态性的部分)。 严谨斜牛是序列依赖性的并且随着瞎况不同而不同。通常，严谨^f牛选择为在 确定离子强度和pH值下，低于特定序列热熔点(thermal melting point) (Tm)约 5°C。 Tm是50X碱基对解离的温度(在所确定的离子强度和pH下)。对杂交条 件的严谨程度进行放松，将允许容忍序列错配；容忍的错配程度，可通过适当 调整杂交斜牛来调控。
术语"引物"是指在诱导与核酸!赶补的弓嫩延伸产物的合成的条件下， 即，在合适的温度下、在合适的缓冲液中、在存在四种不同核苷三磷酸和聚合 剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)的情况下，作为DNA合成的引发位点的寡核 苷酸。引物4继是单链的寡脱氧核糖核苷酸。引物包括完全或基本上与耙序列 互补的"杂交区"，其长劍雄大约15个至约35个核苷酸。引物寡核苷酸可以 完全由杂交区组成，或者可以包括允许扩增产物检测、固定或操作、但不改变 该引物作为DNA合鹏始物质的能力的其他特征。例如，核f游列尾可包括在 杂交俘获寡核苷酸的弓l物的5'端。
用在本文中的"等位基因特异性"引物，尉^S样的引物，其与耙序列杂 交由此所述弓嫩的3'端，通常为3'核苷酸与感兴趣的位点对准，例如核苷酸1799
5i^4F密码子600的第二位置，在该感兴趣的位点，与野生型等位基因或者 与突翅等位基因完全互补。在本文中，引物，对在3'端例如3'核苷酸駄端
倒数第二个核苷酸，与其完全互补的等位基因具有"特异性"。通常，当引物3' 端出现错配时，引物延伸被抑制。等位基因特异性引物，当杂交于完全互补的 等位基因时，将以更大效率延伸。同样的引物，当杂交于其他等位基因时，由 于杂交双链中引物3'端的错配，例如3'核苷酸或3'端倒数第二个核苷酸的错配，
而不能很容易地延伸。因此，基于形成的不同延伸产物，使用等位基因特异性弓嫩可区别等位基因。
术语"探针"是指在合适条件下，选择性杂交耙核酸的寡核苷酸。 "等位基因特异性"探针包含与耙序歹院全或基本上互补的"杂交区"，其 在感兴趣的位点处与革巴序列完全互补，例如在万iMF密码子600的核苷酸位置
1799处。因此，例如V600E等位基因特异性探针选择性检测V600E突辦列， 而野生型说MF等位基因特异性探针选择性检测野生型序列。在充分严谨的杂 交条件下，用探针进行杂交分析，可选择性地检测包含感兴趣的位点的特定革巴 序列。探针杂交区，雌长度为约10个约35个核苷酸，更雌长度为约15 个-约35个核苷酸。JOT本领域公知的、能影响杂交稳定性的{針布 或5|^类 似物，可以实现使用更短或更长的具有可比较的稳定性的探针。探针寡核苷酸 可以完全由杂交区组成，也可以包含允许探针的检测或固定、但不显著改变其 杂交区杂交特性的其他特征。
术语"耙序列"或"靶区域"是指待分析并且包含感兴趣的多态性位点的 核酸区域。
在本文中，术语"核酸"，"多核苷酸"和"寡核苷酸"是指引物，探针， 和寡聚物片段。这些术语不受长度限制，通常为多脱氧核糖核苷酸(包含2-脱 氧-D-核糖)，多核糖核苷酸(包含D-核糖)，以及嘌呤或嘧啶 或者修饰的嘌 呤或嘧啶碱基的任何其他N-糖苷的线性聚合物。这些术语包括双链和单链 DNA，以及双链和单链的RNAo本发明的寡核苷酸可用作弓l物和/或探针。
核酸，多核苷酸或寡核苷酸，可以包括磷酸二酯键或各种{針布的键，其包 括但不限于磷酸三酯键，磷酸醐安键，硅fl^键(siloxane)，碳酸酯键，羧基甲 基酯键，乙醐安键，氨基甲酸键，硫M，桥接磷酸酰胺键，^!妾亚甲基磷酸 键，硫代磷酸酯键，甲基磷酸酉旨键，二硫代磷酸酯键(phosphorodithioate)，桥 ^^代磷酸酯键，或者砜键，以及上述各种键的组合。
核酸，多核苷酸或寡核苷酸，可以包括五种生物形成5麟(腺嘌呤、鸟嘌 呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)和/或除这五种生物形成碱基以外的其他碱基。 这些M可用于多种目的，例如用于稳定或去稳定杂交；用于j腿或抑制探针 的P賴 ；或者作为检测部分或淬灭部分的连接位点。例如，本发明的多核苷酸 可以包含一种或多种修饰的、非标准的、或衍生化的碱基部分，包括但不限于， N6-甲基-腺嘌呤，N6-叔丁基-苯甲基-腺嘌呤，咪唑，取代的咪唑，5-織嘧啶，5-繊嘧卩定，5-fCM嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧
基羟甲萄尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2"^尿苷，5-羧甲基氨基甲基尿嘧咬，二
,嘧啶，P-D-半孚L糖基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)，肌苷，N6-异J^J;希 基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，l-甲基肌苷，2,2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤， 5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧P定，卩-D-甘露糖基Q核苷
(beta-Dmamiosylqueosine)， 5，-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基 硫-N6-异I^希基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)， wybutoxosine，作观嘧啶，Q核苷
(queosine)， 2-硫胞嘧啶，5-甲基-2^[尿嘧啶，2^l尿嘧啶，4^[尿嘧啶，5-甲 基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙萄尿嘧啶，(acp3)w， 2,6-二氨基嘌呤，以及5-丙炔基嘧啶。其他修饰的、非标准的、或衍生化的M部 分的实例，可见于美国专利号6,001,611; 5，955,589; 5,844,106; 5,789,562; 5,750,343; 5,728,525;和5,679,785。
此外，核酸，多核苷酸或寡核苷酸，可以包括一种或多种{針布的糖部分， 包括但不限于阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖，和己糖。
介绍
本发明提供了在筛选癌症患者中应用的V600E诊断分析方法，所述癌症患 者例如黑素癌患者、结肠癌患者、甲^S;I癌患者、以及低级浆性卵巢癌患者， 他们为B-Raf抑制剂，例如选择性的突变体B-Raf抑制剂，如PLX4032治疗的 候M象。因此，该诊断i&验可根据患者对PLX4032治疗应答的概率来归类患者。
典型地，使用包括确定外显子15密码子600中核苷酸位置1799上的单碱 基突变(T>A)是否存在的方法，对V600E突变(也称为V599E (1796T>A)) 进行检测。该突变也可由核苷酸位置1799-1800的两碱基突变TG〉AA产生。两 碱基突变也可由评估位点1799来检测。在某些实施方式中，核酸也可由位置
1800上是否存在取代^e平估。
其他的突变也可在密码子600处发生。这些突变包括V600K， V600D，和 V600R。在某些实施方式中，检测V600E突变的探针，也可用于检测其他密码 子600的突变，例如V600D， V600K和/或V600R。在某些实施方式中，探针也可对密码子601上的突变进行检测。
V600E突变是否存在，典型地，通过评估核酸，例如基因组DNA或mRNA， 在位置1799处是否存在碱基取代而确定。可以使用多种分析方法。在某些实施 方案中，分析方法是5'核酸H^析。
V600E也可M31检测突变的V600EB-Raf是否存在，例如使用免疫分析， 鄉行检测。
V600E存在，表示该患者为B-Raf抑制剂，例如突变体特异性B-Raf抑制 剂的治疗候选对象。因此，本发明也包括已确定具有V600E突变的患者，用B-Raf 抑制剂，例如突变^^寺异性B-Raf抑制齐咖PLX4032治疗的方法。
生,品
V600E突变可在多种癌症中检测到，包括黑素瘤；结肠:ffl癌；甲状腺癌， 例如乳突甲状腺癌；以及卵巢癌，例如低级浆性癌。在某些实方tt式中，V600E 突变可在肺癌，神经M瘤，前列腺癌，乳腺癌，肉瘤，肝癌，垂体癌，以及 发生在大肠、胆管、眼睛、胰腺、胃、中枢神经系统、造血以及淋巴组织的癌 中检测到。
V600E突变在患者的生物样品中检测。生物样品典型地包括癌细胞。例如， 样品可以是诸如恶性黑素细胞瘤、结肠M瘤、或甲状腺瘤的肿瘤活检样品； 或者可以是来自转移部位的组织样品。在其他的实施方式中，生物样品可以是 血或另一种包括癌细胞的流体。在其他的实施方式中，生物样品可以包括循环 (无细胞)的核酸。
突变通常在获自生物样品的核酸中进行检测。被评估突变是否存在的核酸， 可以是RNA或DNA。在某些实施方式中，突变在基因组DNA中进行检测。
生物样品可用本领域多种方法中任意一种来获得。此外，生物样品可用固 定试剂，例如甲醛处理，并用石蜡包埋、切片〗顿。可选地，可用新鲜或冷冻 组织。在其他实施方式中，可用细针抽吸物。
核,列中的V600E突变的，!l
评估核酸是否存在V600E突变的检测技术，涉及^T遗传学领域公知的操 作步骤。而且，多种方法涉及核酸的扩增。在本领域中提供有进行这些方法的大量指导。示例性的参考文献包括操作手册例如PCRTechnology: Princroles and Applications for DNA Ampl迅cation (ed H. A. Erlich， Freeman Press, NY， N.Y， 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (eds. Innis， etal.， Academic Press, San Diego, Calif. ， 1990); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel， 1994-1999，包括直至2004年4月的补充更新内容;Sambrook & Russell, 爿Zv"Zwroto^v A/朋wa/ (3rd Ed ， 2001)。 虽然本方法通常利用PCR步骤，但其他扩增方法也可使用。合适的扩增方 fe^括，连接^!连反应(参见例如\^11& Wallace, Gemwn&4: 560-569， 1988); 链替换分析(参见例如Walker "a/.,尸rac. Ato/.爿cW 89: 392-396， 1992;
U.S. Pat. No. 5,455,166);和多种基于转录的扩增系统，包括美国专利号 5,437,990， 5，409，818和5,399,491中记载的方法，转录扩增系统(TAS) (Kwoh 尸rac. Ato/. 86: 1173-1177, 1989)以及自维持序列复制
(self-sustained sequence replication) (3SR) (Guatelli 6 /.，尸rac. Ato/. Jafti
1874-1878， 1990; WO 92/08800)。备选地，可以使用扩增lt针至可检 测水平的方法，例如Q(3-复制酶扩增(Kramer &Lizardi， Atow陀339: 401402， 1989; Lomeli d C/z . C77e肌35: 1826-1831， 1989)。例如，Abramson和 Myers在CwreW(9/wwow/"投otec/wo/ogy 4: 4147， 1993中，Jl供了王见有己知 扩增方法的综述。
典型地，V600E的检测M31在含寡核苷酸引物和/或探针的分析逸验中，评
估来自患者的核酸而进行。寡核苷酸可以用任何合适的方法制备，通常为化学 合成。寡核苷酸可以4吏用商业可获得的试剂和仪器合成。可选地，寡核苷酸可
ilil商业^^g购买。合成寡核苷酸的方法是本令页域公知的(参见例如Narang" a/., A/eA. E^ymo/. 68: 90-99， 1979; Browne a/., A/e欲.五^ymo/. 68: 109-151， 1979; Beaucage^a/.， T^ra/ o/ra"丄故22: 1859-1862， 1981;以及美国专利号 4,458,066中公开的固相支持法)。此外，对上^i^记载的合成方法进行修饰，可 用于理想地影响酶对合成的寡核苷酸的行为。例如，在寡核苷酸中整合入修饰 的磷酸二酯键(例如硫代磷酸酯键，甲基磷酸酯键，磷酸,安键，或硼磷酸酉旨 键)或除磷酸衍生物以外的其他键，可用于阻止所选位点处的裂解。此外，使 用2'-氨基斷布的樹顷向于4妙万據核苷酸在与作为新核酸链合成模板的核酸相 杂交时，有利于被^换而不是被酶切(In addition, the use of 2'-amino modifiedsugars tends to favor displacement over digestion of the oligonucleotide when hybridized to a nucleic acid that is also the template for synthesis of a new nucleic acid strand.)。
在核酸水平上检测V600E突变的大多数分析方法需要采用下列几种常用
方法中的一种用等位基因特异性寡核苷酸的杂交，引物延伸，等位基因特异
性连接，测序，或者电泳分离技术，例如单链构象多銜SSCP)及彌双链分析。 示例性的分析方法包括5'核酸^^析，模板指导的染料-终止子整合，分子信标 等位基因特异性寡核苷酸分析，单碱基延伸分析，以iHOT实时焦磷酸测序的 突变分析。对扩增序歹啲分析可用多种技术进行，例如微芯片，荧光偏振分析， 以及基质辅助激光脱附电离(MALDI)质谱。可用的其他两种方法为，基于Flap 核酸謝受^^解的分析法和利用扣锁探针(padlockprobes)的分析方法。
确定V600E等位基因的存在与否，通常Mil分析获自含待分析患者癌细胞 的生物样本的核酸样品而进行。通常，核酸样品包括基因组DNA。基因组DNA 通常获自肿瘤样本，但也可获自其他细胞或组织，例如获自转移部位或血液。
待分析的核酸样品也可以是RNA。例如，可以分析来自生物样本的mRNA， 来确定V600E突变是否存在。核酸样品获自^ii耙核酸的细胞，例如获自原发 肿瘤或转移部位的组织。这样的分析可以通过例如j顿病毒逆转录酶，先逆转 录耙RNA然后扩增戶万获得的cDNA而进行；或者4OT联合高 显逆转录聚合酶 链反应(RT-PCR)而进行，该方法记载在美国专利号5,310,652; 5,322,770; 5,561,058; 5,641,864;和5,693,517中。
上文简单介绍了分析核酸样品以检测核苷酸替换的常用方法。然而，本领 域已知的任何方法，都可用于本发明以检测核苷酸替换是否存在。
等位基因特异性探针
等位基因特异性杂交依赖于区分差别至少一个 的两种DNA M，这 ^!过将对某变异序列特异的寡核苷酸与获自扩增核酸样品的扩增产物进行杂 交而进行的。等位基因特异性分析也可包括两种等位基因特异性寡核苷酸，例 如针对第一种变体的等位基因特异性探针和针对第二种变体的等位基因特异性 探针，其中相对于另一变体而言，所述探针可区分地与一种变体杂交。等位基 因特异性杂交通常采用短的寡核苷酸，例如长度为15-35个核苷酸的寡核苷酸。设计这些探针的原则和指导可在本领域，例如本文所弓间的参考文献中获得。 杂交i:f牛应该足够严谨，以使等位基因在杂交强度上有显著区别，杂交条《愤 选为基本二元反应，由此探针仅与等位基因其中之一杂交。某些探针被设计为
与耙DNA片段进行杂交，以致感兴趣的位点即B7UF外显子15密码子600的 核苷酸位置1799与探针的中心位置进行比对(例如在15碱基寡核苷酸中的第7 位置；在16M^寡核苷酸中的第8或第9位置)，但是该设计并不是必需的。
等位基因的数量和/或是否存在通过观懂与样品杂交的等位基因特异性探 针的数量来确定。典型地，寡核苷酸用某种标签，例如荧光标签进行标记。例 如，在可导致优先杂交等位基因的杂交劍牛下，将对V600E核苷酸取代特异的 等位基因特异性探针，与获自生物样品的核酸进行杂交。测定荧光强度以确定 该特异性寡核苷酸是否已杂交。
在一个实施方式中，用与含V600E突变位点的突变(鹏生型)S，序 歹皖全互补的寡核苷酸探针，辦列特异性杂交^f牛下fflil杂效鉴定V600E 位置出现的核苷酸。选择探针杂，歹,序列特异性杂交斜牛，以使突变位点 的单^N昔配导致杂交双链体不稳定，足以使双链不能有效形成。因此，在序列 特异性杂交条件下，仅在探针与完全互补的等位基因序列之间育^形成稳定双链 体。因此，与含突变位点的区域的等位基因序列完全互补的，长度约10个约 35个核苷酸的寡核苷酸， 长度约15个-约35个核苷酸的寡核苷酸，在本发
明的范围内。
在可选的实施方式中，在足够严谨的杂交条件下，用在包含突变4立点的区 域处，与突变型或野生型等位基因基本上互补并且在突变位点处与该等位基因 完全互补的寡核苷酸，通过杂交来鉴定突变位点出现的核苷酸。因为在非突变 位点中存在错配，在两种等位基因序列中都存在错配，所以此时，与靶等位基 因序列形成的双链体和与相应非靶等位基因序列形成的双链#*错配数量上的 差异，与使用与靶等位基因序列完全互补的寡核苷酸时盼瞎况相同。在该实施 方式中，杂交条件被放宽，足以允许与革巴序列形成稳定的双链体，同时保持足 够的严谨度以排除与一哮E序列形成稳定^l链体。在该足够严谨的杂交条件下， 稳定的双链糊每仅在探针与靶等位基因之间形成。因此，在包含突变位点的区 域处，与等位基因序列基本上互补、并且在突变位点处与该等位基因序列完全 互补的，长度约10个-约35个核苷酸的寡核苷酸，j，长度约15个-约35个核苷酸的寡核苷酸，在本发明的范围内。
在杂交条fHfc化被限制的逸验模式下，4顿基本上互补的寡核苷酸，而不 是完全互补的寡核苷酸可能是令人期待的。例如，在多靶固定探针逸验模式中，
各耙的探针被固定于单一固相支持物。杂交逝3t将固相支持物与含靶DNA的溶 液接触而同时展开。当所有杂交在相同的条件下进行时，杂交条件不能独立地 对各每种探针进行优化。在该试验模式阻止调整杂交条件的情况下，在探针中 弓l入错配可用于调整双链体的稳定性。弓l入的特定错舰双链体稳定性的效果 是公知的，双链体的稳定性可如上所述的常规估算和经验确定。合适的杂交条 件，取决于探针的实际大小和序列，可用本领域公知的以及本文提供的指导经 验腿择。f柳寡核苷酸探针检测序列的单^^对差异，在例如Conner ^ /9W，A^/. WS4 80: 278-282和美国专利号5,468,613和5,604,099
中有描述。
完全匹配与单i!S错配杂交双链体之间的稳定性改变比例，取决于杂交寡 核苷酸的长度。形成双链的探针序列越短，错配存在导至文不稳定的比例就越高。 在实践中，长度约15个核苷酸至哟35个核苷酸的寡核苷酸，是序歹鹏异检测 优选的。此外，由于杂交寡核苷酸末端因热能而经历连续随机的解离与退火， 所以，在任一末端的错配所导致的杂交双链的不稳定性，要低于序列内部发生 的错配。,地，为区分耙序列的单iSM^t改变，应选择杂交耙序列以致突 变位点形成于探针内部区域的探针序列。
选择与^MF杂交的探针序列的战标准，也适用于探针的杂交区，即涉 及与耙序列杂交的探针部分。探针可结合有不显著改变探针杂交特性的额外核 fr游列，例如用于固定探针的聚-T尾。本领域技术人员会意识到，为用于本发 明方法，结合有与耙序歹杯互补由此不涉及杂交的额外核,列的探针，基本 上等同于未结合客妙卜序列的探针。
5'-核酸H^析
在某些实施方式中，用"TaqMarT'或"5'-核酸酶分析"评估核酸样品中是否 存在V600E突变，该分析方法在美国专利号5,210,015; 5,487,972;和5,804,375; 和Holland 7，S，尸rac. Ato/. y4o^i &z. WS4 88: 7276-7280中有记载。在
TaqMaif分析中，在扩增反应中存在有与扩增区杂交的标记的检测探针。探针被修饰，以阻止探针作为DNA合成的引物。用具有5'至3'外切核酸酶活性的
DNA聚合酶进行扩增。在每个扩增合成步骤中，在延伸弓胸下游与耙核麟交 的任一探针，都将被DNA聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性卩絲 。因此，新靶 链的合成，也将导致探针的P絲军，由此，糊军产物的累积提供了革巴序列合成的 检测手段。
在分析中4顿的杂交探针，可以是在V600E突变位点处区分^MF突翅 和野生型等位基因的等位基因特异性探针。可选地，该方法可用等位基因特异 性弓l物和结合扩增产物的标记探针进fi1。
适于检测,率产物的任何方法都可用于5，核酸^3、析。通常，检测探针用 两种荧光染料标记，其中一种荧光染料能淬灭另一种荧光染料的荧光。染料附 着于探针，雌一个附着在5'端而另一个附着在内部位点，使得当探针处于未 杂交状态时发生淬灭，并且DNA聚合酶的5'到3'外切核酸酶活f，探针的切 害拨生在两种染料之间。扩增导致探针在染料间断裂，由此伴随产生淬灭消失 以及来自初始淬灭的染料的可观察到的荧光增加。卩賴率产物的积累通过检测反 应荧光的增力口来监测。美国专利号5,491,063和5,571,673记载了伴随扩增所发 生探针,的其他检测方法。
在一个实施方式中，用于评估患者样品中是否存在^^FV600E突变的5'
核酸齡析，用下列弓l物或者与下列弓胸基本相同的序列进行
TTS068-BRAF一F1: 5， CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTE 3， (E^-丁基苯甲基dA)(SEQIDNO: 25)
RLBRAF—R5: 5，TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA3, (SEQ ID NO: 4)
与引物序列基本上相同的序列，包括与相同互补序列杂交的那些序列。因 此，在某些实施方式中，用于本发明的引物序列包括TTS068-BRAF—Fl或 RL—BRAF—R5的至少15个舭连的核苷酸，有时至少16， 17， 18， 19， 20， 21， 22， 23， 24， 25，或26个毗连的核苷酸。在某些实施方式中，引物具有 TTS068-BRAF—Fl至少27， 28， 29，或30个fflt琏的核苷酸。在其他的实施方 式中，用于本发明的引物与TTS068-BRAF—Fl或RL—BRAF—R5具有至少80% 的同一性，在某些实施方式中，具有至少85%的同一性，在其他实施方式中， 具有至少90%或更高的同一性。在某些实施方式中，正向引物为TTS068-BRAF—Fl ，反向弓l物为允许区分X染色体假基因、但不与RL—BRAF—R5 ，或者与RL_BRAF_R5交叠少于10个MS对的引物。在某些实施方式中， 反向弓胸可以结合包括RL一BRAF—R5结合位点下游20个核苷酸或更少核苷酸 的位点。例如，也可利用下列序列的反向引物
5, AAAT AGC CTC AAT TCT TAC CAT CCACAAAA 3' (SEQ ID NO: 12) 5， TAG CCT CAATTC TTACCATCC ACAAAA3， (SEQ ID NO: 13) 5'TAGCCTCAATTCTTACCATCCACA AAE3，(SEQIDNO.- 14) 5，AGGGCCAAA AATTTAATCAGTGGA AAA A3，(SEQIDNO: 15) 5'CAGTGGAAA AATAGCCTCAATTCTTACCA3,(SEQIDNO: 16) 在某些实施方式中，正向引物可以结合包括BRAF一F1结合位点上游20个 的位点。在某些实施方式中，正向引物可以是.-
5，TTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAArE3，(SEQIDNO: 17);或 5，ATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAE 3，(SEQ IDNO: 18)。 V600E突变在RNA为起始模板的情况下，也可被检测。这样的分析检测 可以包括反向引物，例如含下列序列的引物
5'ATGACTTCTGGT GCC ATC CAC AA3， (SEQ IDNO: 19)。
可4OT的其他反向引物包括
5， AAA AAT AGC CTC AAT TCT TAC CAT CCA CAA AA 3， (SEQ ID NO:
20);
5，GCCATCCACAAAATGGATCCAGACA3，(SEQIDNO: 21);或者 5'CAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAA3,(SEQIDNO: 22)。 在本发明的一个实 式中，用下列一个或两个等位基因特异性探针，进 行5'核酸酶分析，所述探针用于检测突变型(TTS155-BRAF一MU)或野生型 (TTS148-BRAF_WTs)序列
TTS155-BRAF一MU 5, QCTACAIMFAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3， (SEQ ID NO: 23)
TTS148-BRAF—WT 5， QACArrGEAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3， (SEQ ID NO: 24)
(E=HEX报告染料，F=FAM报告染料，1=脱,肌苷，Q=BHQ2淬灭染料，P=3'-磷酸)。将染料(F或E)插入dI和dA之间(TTS155-BRAF—MU)，或者dG和dA之间(TTS148-BRAF—WT)。
本领域可以理解，TTS155-BRAF—MU或TTS148-BRAF—WT探针也可以 包括不同于上文所记载的修饰，例如特别的荧光染料，淬灭剂，和/或染料的位 置。
在某些实施方式中，检测V600E的探针，例如TTS155-BRAF一MU，也可 检测V600D (1799—1800TG〉AT)和V600K(1798—1799G。AA)。在某些实施方式 中，检测V600E突变的探针，也检测K601E (1801AX3)禾B V600R (1798_1799GT>AG)。
在某些实施方式中，也可使用与探针序列基本上相同的序列。与探针序列 基本上相同的序列，包括与所述探针的相同互补序列杂交的那些序列。因此， 在某些实施方式中，用于本发明的探针序列包括TTS155-BRAF—MU或 TTS148-BRAF—WT的至少15个舭连的核苷酸，有时至少16， 17， 18， 19， 20， 21， 22， 23， 24， 25， 26， 27， 28， 29，或30个田比连的核苷酸。在某些实施方 式中，探针具有TTS155-BRAF—MU或TTS148-BRAF—WT的至少27， 28， 29， 或30个毗连的核苷酸。在其他的实施方式中，用于本发明的探针与 TTS155-BRAF—MU或TTS148-BRAF—WT具有至少80%的同一性，在某些实 施方式中，具有至少85%的同一性，在其他实施方式中，具有至少90%或更高 的同一性。
用于检测S^4F中的V600E突变的5'核酸^^析，可4顿具有5'至3'外 切核酸酶活性的任何聚合酶。因此，在某些实施方式中，具有5'-核酸酶活性的 聚合酶为热稳定且具有热活性的(thermoactive)核酸聚合酶。这样的热稳定聚 合酶包括但不限于，来自真细菌属一嗜热菌CThermus)，热袍菌CThermatoga:) 和高温套管斷Thermosipho)的多个物禾中的聚合酶的天然和重组形式、以及它们 的嵌合形式。例如，可用于本发明方法的嗜热菌属(Themms)物种的聚合酶，包 括水生嗜热菌(7^e，w ^M加'o/力(Taq) DNA聚合酶，极端嗜热菌(77 e，船 ^emK 一/te)(Tth)DNA聚合酶，嗜热菌物种Z05 (Z05) DNA聚合酶，嗜热菌物 种spsl7株(spsl7)，以及嗜热菌物禾中Z05(Thermus species Z05)(例如记载在美 国专利号5,405,774; 5,352,600; 5,079,352; 4,889,818; 5,466,591; 5,618，711; 5，674,738;禾口 5,795,762中)。可用于本发明方法的热袍菌属(Thermatoga)的聚合 ,括，例如海栖热袍菌(7^簡ato伊m諮"m力DNA聚合酶和新阿波罗热袍菌(772e，atoga脱apo/zto^)DNA聚合酶，可用于本发明的高温套管菌属 (Theraiosipho)的聚合酶的实例为， 一 夂洲高温套管菌(772em a^/20 q/hcara ) DNA 聚合酶。海栖热袍菌(Thermatoga mantima)和非洲高温套管菌(Thermosipho afiicaniis)的DNA聚合酶序列，公开在国际专利公开WO92/06200中。新阿波 罗热袍菌(Thermatoganeapolitana)的序歹!j，也可见于国际专利
发明者L·吴, R·兰兰德, S·威尔, T·夏普 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司