本发明涉及用于裂解包含酰胺基团的有机分子中的酰胺键的方法。此类方法在多种有机合成应用中找到用途，例如用于脱乙酰化(deacetylation)。
发明背景
经由皂化或水解来裂解酰胺键的传统方法是严苛的过程，需要强碱性条件(即浓naoh或类似物)或强酸性条件(即浓hcl或类似物)在升高的温度持续长的时间段。由于所需的严苛条件，这些方法具有关于保护基团和在反应期间保留手性中心的主要化学相容性问题。
其中在更近期提出的方法是肼解。肼允许酰胺键在几乎无水的条件下裂解。肼由于α效应，是一种强有力的亲核试剂，并且相比于naoh，肼的降低的碱度允许酰胺键在其他保护基团的存在下裂解，并保留某些手性中心。这最近在来自ohshima等人的两篇高知名度的出版物中被强调(angew.chem.int.ed.2012,51,8564-8567和chem.commun.,2014,50,12623-12625)。在这两篇通讯中，ohshima分别使用乙二胺和肼在铵盐的存在下，在微波辐照下来裂解酰胺键，同时保持其他敏感性保护基团和手性中心。
尽管鉴于ohshima等人的最近发现，在本领域中对于允许裂解酰胺键同时保留保护基团和手性中心的改进方法仍然存在需求。
发明概述
本发明的目的是提供用于裂解酰胺键的方法，所述方法可以减轻现有技术中的问题中的至少某些。
本发明的目的是提供用于裂解酰胺键的方法，所述方法允许裂解酰胺键，同时保留保护基团和/或手性中心。
本发明的另外的目的是提供用于裂解酰胺键的方法，所述方法不需要在高温、强碱性条件(即浓naoh或类似物)或强酸性条件(即浓hci或类似物)持续长时间段。
根据本文阐明的方面，提供了用于裂解酰胺键的方法，所述方法包括：
a)提供包含酰胺基团的分子；
b)使包含酰胺基团的分子与羟胺(nh2oh)或其盐反应以裂解酰胺基团的酰胺键。
该方法优选地涉及羟胺盐的使用。
本发明人已经令人惊讶地发现，当使用羟胺盐替代羟胺本身时，可以以明显较低的试剂的摩尔浓度和/或较低的ph实现相同的或甚至更高的反应速率。这意味着羟胺盐允许酰胺键在比羟胺本身较不苛刻的反应条件下裂解，这导致在包含酰胺基团的化合物中的降解或不希望的副反应的较小的风险。在实践中，这允许裂解不同类型的酰胺键，包括通常难以裂解的酰胺中的酰胺键，例如仲酰胺基团中的酰胺键。其还允许裂解在各种“敏感”基质(substrate)中的酰胺基团，即包含在更苛刻的反应条件下将容易被裂解的其他键的基质。实例包括包含ph敏感保护基团(phsensitiveprotectinggroup)或ph敏感手性中心(phsensitivechiralcenter)的基质。
如本文提到的“酰胺基团”是具有官能团rne(o)xnr′2(其中r和r′指的是h或有机基团)的化合物。最常见的是羧酰胺类(carboxamides)(有机酰胺)(n＝1，e＝c，x＝1)，但其他重要类型的酰胺是已知的，包括磷酰胺类(n＝2，e＝p，x＝1和许多相关的式)和磺酰胺类(e＝s，x＝2)(iupac，compendiumofchemicalterminology，第二版(“金皮书(goldbook)”)(1997))。术语酰胺指的是化合物的类别和那些化合物中的官能团rne(o)xnr′2两者。酰胺基团中的氮原子和e之间的键在本文中被称为“酰胺键”。酰胺不应与酰亚胺混淆，酰亚胺包含两个连接到相同氮原子上的酰基基团，并且相对容易裂解。
因此，在某些实施方案中，“酰胺基团”是羧酰胺基团、磺酰胺基团或磷酰胺基团。已经发现本发明的方法特别地可用于裂解通常较难以裂解的酰胺，例如羧酰胺类或磺酰胺类。因此，在某些实施方案中，“酰胺基团”是羧酰胺基团或磺酰胺基团。在优选的实施方案中，“酰胺基团”是羧酰胺基团。羧酰胺类衍生自羧酸和胺。
本发明基于本发明的认识，即羟胺(nh2oh)且特别是其盐可以被有利地用于在温和的反应条件下裂解包含酰胺基团的分子中的酰胺键。这允许裂解酰胺键，同时避免不期望的分子降解并保留保护基团和/或手性中心。反应通常通过反应方案i来图示。
反应方案i
例如，多糖并且特别是糖胺聚糖，例如透明质酸、软骨素和硫酸软骨素通常倾向于主链在严苛的反应条件(例如非常高或低的ph或高温)下降解。因此，本发明的方法特别地可用于裂解此类多糖中的酰胺键。本发明的方法例如可用于获得至少部分脱乙酰化的糖胺聚糖，其中起始材料的很大部分的分子量被保留。已经发现使用羟胺或其盐用于脱乙酰化允许在温和的条件下n-脱乙酰化，这导致透明质酸的聚合物主链的仅少量降解。因此，使用羟胺或其盐用于脱乙酰化允许产生具有保留的高分子量的脱乙酰化的透明质酸。这与先前已知的方法例如使用肼或naoh作为脱乙酰化剂的脱乙酰化形成对比，在先前已知的方法中，高度的脱乙酰化已经不可避免地伴随有聚合物主链的严重降解。
本发明的方法可用于裂解伯酰胺基团、仲酰胺基团和叔酰胺基团中的酰胺键。伯酰胺指的是其中酰胺氮被结合至一个碳原子的酰胺。仲酰胺指的是其中酰胺氮被结合至两个碳原子的酰胺。叔酰胺指的是其中酰胺氮被结合至三个碳原子的酰胺。该方法特别有利于裂解较受阻的酰胺即仲酰胺基团和叔酰胺基团中的酰胺键，因为此类键通常更难以使用常规的方法裂解。因此，根据实施方案，酰胺基团是伯酰胺基团、仲酰胺基团或叔酰胺基团，优选地是仲酰胺基团。
本发明的方法还可以特别地可用于包含酰基基团或乙酰基基团的分子的脱酰基化，特别是脱乙酰化。因此，根据实施方案，酰胺基团是n-酰基酰胺基团，优选地是n-乙酰基酰胺基团。
根据实施方案，包含酰胺基团的分子还包含ph敏感手性中心。包含酰胺基团并还包含ph敏感手性中心的分子的实例包括但不限于某些寡糖、多糖和氨基酸。
如通过所附实施例证明的，使用羟胺或其盐裂解分子中的酰胺键还可以在不裂解分子中存在的常见保护基团(commonprotectinggroup)的情况下来实现。
根据实施方案，包含酰胺基团的分子还包含ph敏感保护基团。对于“ph敏感保护基团”，我们意指在高或低ph条件下被裂解掉的保护基团。对于在此上下文中的高ph，我们通常意指12或更高的ph(例如浓naoh或类似物)。对于在此上下文中的低ph，我们通常意指2或更低的ph(例如浓hcl或类似物)。ph敏感保护基团的实例包括但不限于boc(叔丁氧羰基)、fmoc(9-芴甲氧羰基)、cbz(苄氧羰基)、i-prco、t-buco和tr(三苯基甲基)。
根据某些实施方案，包含酰胺基团的分子是包含乙酰基基团的生物聚合物。根据某些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物是糖胺聚糖。根据某些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物选自由以下组成的组：硫酸化的或非硫酸化的糖胺聚糖例如透明质酸、软骨素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、细菌肝素前体(heparosan)、肝素、硫酸皮肤素(dermatansulphate)和硫酸角质素，优选地透明质酸、软骨素和硫酸软骨素，及其混合物。根据某些实施方案，包含乙酰基基团的生物聚合物是透明质酸。在某些实施方案中，生物聚合物是透明质酸凝胶。在某些实施方案中，生物聚合物是由1,4-丁二醇二缩水甘油醚(1,4-butanedioldiglycidylether)(bdde)交联的透明质酸凝胶。
透明质酸是用于医学用途的最广泛使用的生物相容性聚合物中的一种。透明质酸和其他gag是带负电荷的杂多糖链，其具有吸收大量水的能力。透明质酸和衍生自透明质酸的产品在生物医学和化妆品领域被广泛使用，例如在粘性手术(viscosurgery)期间和作为真皮填充剂(dermalfiller)。
根据实施方案，通过步骤b)中的酰胺键的裂解形成的产物是胺。
根据实施方案，该方法还包括以下步骤：
c)回收由步骤b)的反应形成的产物，优选地胺。
步骤c)中的回收可以包括任何合适的有机合成后处理(organicsyntheticwork-up)或纯化技术或这些技术的组合。
优选地选择步骤b)中的反应温度，以便不造成分子的过度降解并以便保留保护基团和/或手性中心。反应通常可以在200℃或更低的温度例如150℃或更低的温度进行。根据实施方案，步骤b)中的反应包括在100℃或更低的温度，使包含酰胺基团的分子与羟胺或其盐反应。根据实施方案，步骤b)中的反应包括在10℃-100℃、优选地20℃-90℃、优选地30℃-70℃、优选地30℃-50℃的范围内的温度，使包含酰胺基团的分子与羟胺或其盐反应。温度例如可以是在70℃-90℃的范围内例如约80℃，或在30℃-50℃的范围内例如约40℃。
步骤b)中的反应时间取决于期望的酰胺裂解程度。优选地选择反应时间，以便不造成分子的过度降解并以便保留保护基团和/或手性中心，并且反应时间还取决于温度和ph。反应时间通常可以是从5分钟至200小时或更长的任何时间。根据某些实施方案，步骤b)中的反应包括使包含酰胺基团的分子与羟胺或其盐反应持续2小时-200小时。根据某些实施方案，步骤b)中的反应包括使包含酰胺基团的分子与羟胺或其盐反应持续2小时-150小时、优选地5小时-150小时、优选地5小时-100小时。在其他实施方案中，例如在使用较高的温度或ph的情况下，反应时间可以短得多，例如在5分钟至2小时的范围内、在30分钟至2小时的范围内、或在1小时-2小时的范围内。同样地，在另外温和的反应条件下，反应时间可以远远长于200小时。
酰胺键的裂解优选地使用羟胺盐获得。羟胺盐指的是由羟胺和酸形成的盐。羟胺盐例如可以是由羟胺和选自由以下组成的组的酸形成的盐：无机酸和有机酸或其混合物。
根据实施方案，羟胺盐是由羟胺和无机酸形成的盐。根据实施方案，酸选自由以下组成的组：硫酸、盐酸、氢碘酸、氢溴酸和磷酸及其组合。优选的无机酸包括盐酸、氢碘酸和氢溴酸。特别优选的无机酸是氢碘酸。
根据实施方案，羟胺盐是由羟胺和有机酸形成的盐。根据实施方案，酸选自由以下组成的组：乙酸、丙酸、新戊酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、乳酸、苯甲酸和卤代羧酸，例如三氟乙酸(tfa)和三氯乙酸，及其组合。
根据实施方案，酸选自由以下组成的组：乙酸、丙酸、新戊酸、和卤代羧酸优选地三氟乙酸，及其组合。根据实施方案，酸是卤代羧酸，优选地是三氟乙酸。
根据实施方案，羟胺盐是由羟胺和选自由以下组成的组的酸形成的盐：盐酸、氢碘酸和氢溴酸、丙酸、新戊酸和三氟乙酸。
步骤b中的反应优选地在能够至少部分地溶解包含酰胺基团的分子和羟胺或其盐两者的溶剂中进行。溶剂例如可以是水或有机溶剂或其混合物。优选的溶剂的非限制性实例包括水或水与低级醇例如乙醇的混合物。然而，取决于待被裂解的包含酰胺基团的特定分子以及羟胺或其盐的选择，许多其他溶剂将是有用的。有用的有机溶剂的一个实例是四氢呋喃(thf)。
根据实施方案，步骤b)中的反应包括使包含酰胺基团的分子与羟胺在水中反应。
该方法可以优选地在水或水溶液中进行，所述水溶液任选地还包含另一种溶剂，例如乙醇。因此，根据某些实施方案，步骤b)包括使包含酰胺基团的分子与羟胺在水中接触，使得形成该分子和羟胺的含水混合物或水溶液。
根据实施方案，步骤b)中的羟胺的浓度是按重量计至少10％、优选地按重量计至少20％、优选地按重量计至少30％。较高的羟胺浓度可以增加反应速率。
羟胺通常以水溶液的形式来提供，典型地以按重量计50％的浓度。在某些实施方案中，包含酰胺基团的分子可以直接被混合并溶解在羟胺的水溶液中，任选地稀释的羟胺的水溶液中。可选择地，羟胺的固体盐，例如盐酸羟胺或硫酸羟胺，可以溶解在包含酰胺基团的分子的水溶液中。添加羟胺的盐并将该盐转化成羟胺可以作为将包含酰胺基团的分子溶解在羟胺的水溶液中的可选方案或补充方案来进行。
反应混合物中的羟胺的摩尔浓度优选地在5m-20m的范围内。例如，按重量计50％的羟胺浓度大约对应于16m的摩尔浓度。
本发明人已经令人惊讶地发现，当使用羟胺盐替代羟胺本身时，可以以明显较低的摩尔浓度实现相同的反应速率。因此，反应混合物中的羟胺盐的摩尔浓度优选地在0.01m-10m的范围内，优选地在0.1m-5m的范围内。
根据某些实施方案，在步骤a)中，将包含酰胺基团的分子溶解在羟胺或其盐的水溶液中。根据某些实施方案，在步骤a)中，将羟胺的盐溶解在包含酰胺基团的分子的水溶液中。根据某些实施方案，将包含酰胺基团的分子溶解在羟胺的水溶液中，并且将羟胺的盐溶解在包含酰胺基团的分子在羟胺中的水溶液中。
优选地选择反应步骤b)中的ph，以便不造成分子的过度降解并以便保留保护基团和/或手性中心。羟胺在水中的50％v/v溶液的ph是10.2。根据某些实施方案，步骤b)中的反应以在4-12的范围内的ph值进行。根据某些实施方案，步骤b)中的反应以在9-11的范围内的ph值进行。根据某些实施方案，步骤b)中的反应以在4-9的范围内、优选地在6-8的范围内的ph值进行。
本发明人已经通过大量实验发现，添加ph降低剂(phreducingagent)可以明显地增加步骤b)中的反应的反应速率，特别是当使用羟胺时。此效果既是令人惊讶的又是高度有利的。应注意，相应添加ph降低剂至肼酰胺裂解反应不产生任何的反应速率增加。在反应期间较低的ph值也是优选的，以便避免分子的过度降解并以便保留保护基团和/或手性中心。
因此，根据某些实施方案，通过添加ph降低剂来降低反应的ph。根据某些实施方案，通过添加ph降低剂，反应的ph被降低至在4-9的范围内、优选地在6-8的范围内的值。ph降低剂例如可以选自由以下组成的组：无机酸、有机酸和ph降低盐及其组合。
根据实施方案，ph降低剂选自由以下组成的组：无机酸、有机酸和ph降低盐及其组合。
根据实施方案，ph降低剂是无机酸。根据实施方案，ph降低剂选自由以下组成的组：硫酸、盐酸、氢碘酸、氢溴酸和磷酸及其组合。
根据实施方案，ph降低剂是有机酸。根据实施方案，ph降低剂选自由以下组成的组：乙酸、丙酸、新戊酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、乳酸、苯甲酸和卤代羧酸，例如三氟乙酸和三氯乙酸，及其组合。根据实施方案，ph降低剂选自由以下组成的组：乙酸、丙酸、新戊酸、和卤代羧酸优选地三氟乙酸，及其组合。根据实施方案，ph降低剂是卤代羧酸，优选地是三氟乙酸。
根据实施方案，ph降低剂是ph降低盐。根据实施方案，ph降低剂选自由以下组成的组：氯化铵、溴化铵、碘化铵、盐酸羟胺和硫酸羟胺及其组合。根据实施方案，ph降低剂选自由以下组成的组：盐酸羟胺或硫酸羟胺，优选地盐酸羟胺。
根据某些实施方案，步骤b)中的反应在惰性气氛和/或在黑暗中进行。
本发明基于本发明的认识，即羟胺(nh2oh)且特别是其盐可以被有利地用于在温和的反应条件下裂解包含酰胺基团的分子中的酰胺键。因此，根据本文阐明的其他方面，提供了羟胺盐用于裂解包含酰胺基团的分子中的酰胺键的用途。
该用途还可以如上文关于上文描述的方法所描述的来表征。
本发明的其他方面和优选的实施方案依据以下实施例和所附权利要求将是明显的。
如本文使用的，与各种聚合物例如多糖相关的术语“分子量”指的是聚合物的重均分子量mw，重均分子量在科学文献中被明确地定义。重均分子量可以通过例如静态光散射、小角中子散射、x射线散射和沉积速度来确定。分子量的单位是da或g/mol。
本领域技术人员认识到，本发明决不限于本文描述的优选的实施方案。相反地，在所附权利要求的范围内，许多修改和变型是可能的。另外，所公开的实施方案的变型可以由技术人员根据对附图、本公开内容和所附权利要求的研究在实践要求保护的本发明中来理解和实现。在权利要求中，词语“包括”不排除其他要素或步骤，并且不定冠词“一(a)”或“一(an)”不排除多于一个。在相互不同的从属权利要求中列举某些手段的纯粹事实并不指示这些手段的组合不能被有利地使用。
实施例
不希望受限于此，本发明将在下文中通过实施例的方式来例证。
分析方法
1hnmr光谱被记录在brukerbiospinavance400光谱仪上。化学位移被报告为从在合适的有机溶液中的内标物tms向低磁场的δ值。产物的纯度和结构通过waters2690光电二极管阵列检测器系统上的lcms(254nm)，使用以下条件来确证：柱，symmetryc-18；溶剂a，水0.1％甲酸；溶剂b，ch3cn；流量，2.5ml/min；运行时间，4.5分钟；梯度，从0％溶剂b至100％溶剂b；质量检测器，微质量zmd(micromasszmd)。纯化直接通过质量触发制备型lcmswatersx-terra反相柱(c-18，5微米二氧化硅，19mm直径，100mm长度，40ml/分钟的流量)和作为洗脱剂的水(包含0.1％甲酸)和乙腈的逐渐减小极性的混合物来进行。将包含期望的化合物的级分蒸发至干燥，以提供通常为固体的最终化合物。
实施例1-n-((2r,3r,4s)-1,3,4,5-四羟基-6-(三苯甲基氧基)己-2-基)乙酰胺的制备
在室温，n-((2r,3s,5s)-2,4,5-三羟基-6-三苯甲基氧基甲基-四氢-吡喃-3-基)-乙酰胺(556mg,1.20mol,1.00当量)在thf-h2o(20ml,4:1)的混合物中的溶液用固体硼氢化钠(49.92mg,1.32mol,1.10当量)处理[气体逸出]。将反应混合物在室温搅拌持续2h，浓缩至干燥，以提供作为白色固体的n-((2r,3r,4s)-1,3,4,5-四羟基-6-(三苯甲基氧基)己-2-基)乙酰胺(500mg，89.54％)，使用所述白色固体而不另外纯化。
lcms：tr＝1.01min.，纯度＝100％；es+,464.26(m-h)-。
实施例2-n-((2r,3r,4s)-1,3,4,5-四羟基-6-(三苯甲基氧基)己-2-基)乙酰胺的脱乙酰化
n-((2r,3r,4s)-1,3,4,5-四羟基-6-(三苯甲基氧基)己-2-基)乙酰胺(1当量)在羟胺(10倍体积)中的悬浮液用酸添加剂处理以降低ph至7或不被处理，如表1、实施例1-10中提出的。混合物在80℃加热，直到达到脱乙酰化的完全转化。还包括在与实施例2-1中相同的条件下用肼(ph13)对n-((2r,3r,4s)-1,3,4,5-四羟基-6-(三苯甲基氧基)己-2-基)乙酰胺进行脱乙酰化作为实施例2-10。
结果在表1中显示。结果示出，脱乙酰化程序用羟胺进行得比用肼快很多，并且通过添加ph降低剂明显更快。
表1.
反应混合物直接通过制备型lcms纯化，以提供作为白色固体的(2r，3r，4s)-2-氨基-6-(三苯甲基氧基)己烷-1，3，4，5-四醇。
lcms：tr＝0.88min.，纯度＝99％；es+，422.11(m-h)-。
1hnmr(dmso-d6)δ：7.47-7.37(m，6h)，7.30(dd，j＝8.3，6.7hz，6h)，7.26-7.15(m，3h)，3.92(m，1h)，3.83-3.74(m，1h)，3.62-3.53(m，1h)，3.52-3.41(m，1h)，3.34-3.27(m，1h)，3.22-3.16(m，1h)，3.13-3.04(m，1h)，3.01-2.91(m，1h).
实施例3-n-(4-氨基苯乙基)乙酰胺的制备
向4-(2-氨基乙基)苯胺(1.50g；11.01mmol；1.00当量)添加纯的乙酸对甲酚酯(1.65g，11.0mmol，1.00当量)，并且反应混合物在室温搅拌持续30h。将产生的橙色溶液直接吸收在硅胶上，并通过快速色谱法(硅胶，dcm/meoh0％-5％)纯化，以提供n-(4-氨基苯乙基)乙酰胺(1.76g，89.7％收率)。lcms：tr＝0.58min.，纯度＝99.5％；es+，179.5(m+h)+。1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ1.78(s，3h)，2.50(m，2h被dmso信号隐藏)3.14(m，2h)，4.83(s，2h)，6.49(d，j＝7.5hz，2h)，6.84(d，j＝7.5hz，2h)，7.82(s，1h).
实施例4-(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯的制备
在室温，向n-[2-(4-氨基-苯基)-乙基]-乙酰胺(500mg，2.81mmol，1.00当量)在dcm(20ml)中搅拌的溶液添加三乙胺(0.51ml，3.65mmol，1.30当量)，随后是二碳酸二叔丁酯(673.48mg，3.09mmol，1.10当量)。反应混合物在室温搅拌持续1h，用水(5ml)、nahso4(含水)的饱和溶液(5ml)和水(3×5ml)洗涤，经mgso4干燥并浓缩至干燥，以提供作为浅橙色固体的(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(496mg，63％收率)。lcms：tr＝1min.，纯度＝100％；es+，279.5(m+h)。
1h-nmr(dmso-d6)δ1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ1.57(s，9h)，1.87(s，3h)，2.75-2.64(m，2h)，3.36-3.20(m，2h)，7.27-7.07(m，2h)，7.45(d，j＝8.3hz，2h)，7.94(t，j＝5.6hz，1h)，9.31(s，1h).
实施例5-nh2oh.hi的制备
在0℃，在5分钟的时间段内，向50％nh2oh(含水的)的搅拌的溶液(9.28ml，0.15mol，1.00当量)小心地逐滴地添加57％hi(含水的)，直到实现7的ph。形成致密的白色结晶固体，其通过过滤来收集，用冰冷水小心地洗涤以提供氢碘酸羟胺(6.80g，28％)。
实施例6-nh2oh.tfa的制备
在0℃，在5分钟的时间段内，向50％nh2oh(含水的)的搅拌的溶液(9.28ml，0.15mol，1.00当量)小心地逐滴地添加tfa，直到实现7的ph。反应混合物在氮气鼓泡下浓缩，以提供作为透明无色油的三氟乙酸羟胺(11.0g，98％)。
实施例7-nh2oh及其盐相对于常用的转酰胺化剂(transamidationagent)例如nh2nh2.h2o和naoh的比较研究
向(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(50mg，0.18mmol)在所选择的溶剂(5倍体积)中的搅拌的溶液/悬浮液添加该盐(5当量)，并将产生的混合物在80℃加热持续完成反应所需的时间。结果在表2中显示。结果示出，即使当盐中的羟胺的相对浓度远低于实施例7-1中单独的羟胺的浓度时，用例如氢碘酸羟胺(实施例7-3)或三氟乙酸羟胺(实施例7-9)的脱乙酰化程序也进行迅速。lcms：tr＝0.81min.，纯度＝100％；es+，237.51(m+h)+。
1h-nmr(dmso-d6)δ1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ9.26(s，1h)，8.40(s，1h)，7.38(d，j＝8.0hz，2h)，7.11(d，j＝8.0hz，2h)，2.89(m，2h)，2.80-2.63(m，2h)，1.47(s，9h)(作为甲酸盐分离的).
表2.
*体积＝1g＝1ml＝1倍体积
实施例8-还原的ha-4的制备和通过羟胺脱乙酰化
二氨基四-ha(da-4ha)根据以下方案来合成：
步骤1
在室温，ha-4(500mg，0.61mmol)在水(5ml)中的溶液用硼氢化钠(23.05mg，0.61mmol)处理，并且将产生的溶液搅拌持续3h，浓缩至干燥，以提供作为白色泡沫的还原产物1(532mg，假定100％)。
lcms(tr＝0.28min.,es+＝779.4(m-2na+2h)。
步骤2
将还原产物1(532mg)溶解在含水的nh2oh(5ml，50％v/v/)中，并添加固体nh4i(100mg)。将产生的悬浮液在70℃加热持续48h，冷却至室温并浓缩至干燥，以提供残余物。将残余物在纯etoh中沉淀，并且产生的沉淀物通过过滤收集并干燥至恒重，以定量收率提供二胺2和单胺3的1:1混合物。
2:lcms(tr＝0.16min.,es+＝695.36(m-2na+2h)。
3:lcms(tr＝0.19min.,es+＝737.47(m-2na+2h)。
实施例9-还原的ha-4通过nh2oh.hi的脱乙酰化
将如实施例26的步骤1中描述制备的还原的ha-4(532mg)溶解在etoh-h2o(2.5ml,1:1)中并添加固体nh2oh.hi(491mg,3.05mmol)。将产生的悬浮液在80℃加热持续6h，冷却至室温，并且反应混合物通过制备型hilic色谱法纯化，以提供作为白色固体的脱乙酰化的ha-4。
脱乙酰化的ha-4：lcms(tr＝0.16min.,es+＝695.36(m-2na+2h)。
实施例10-透明质酸通过羟胺的脱乙酰化
将0.2g或20g的ha(mw2500kda，doa100％)溶解在羟胺(sigma-aldrich50体积％溶液)或羟胺/水的混合物中，如表3中提出的。将溶液在黑暗中并在氩气下在30℃-70℃温育持续5小时-353小时。在温育之后，混合物通过乙醇来沉淀。将获得的沉淀物过滤，用乙醇洗涤，并然后再溶解在水中。溶液通过超滤来纯化并随后冻干，以获得作为白色固体的脱乙酰化的ha(de-acha)。使用约0.2gha进行实施例10-1至实施例10-14，并使用20gha进行实施例10-15至实施例10-16。结果在表3中显示。相比于肼解法(实施例11)和碱法(实施例12-实施例13)，通过羟胺解(hydroxylaminolysis)的脱乙酰化是更有效的，并且较好地保存ha主链的mw。
表3.
a:sec-uvb:sec-mals
实施例11-透明质酸通过肼解的脱乙酰化-比较实施例
将0.2g的ha(mw2500kda，doa100％)溶解在硫酸肼在一水合肼中的10ml的1％溶液中。反应在黑暗中并在氩气下在30℃-55℃发生持续24小时-120小时。混合物通过乙醇来沉淀。将获得的沉淀物过滤，用乙醇洗涤，并然后再溶解在水中。最终的脱乙酰化的ha产物在超滤之后获得，并冷冻干燥。结果在表4中显示。相比于羟胺解(实施例10-1至实施例10-16)，通过肼解的脱乙酰化给出更多的ha主链的降解，即脱乙酰化的产物的更低的mw。
表4.
实施例12-透明质酸通过均相碱水解的脱乙酰化-比较实施例
将ha(1000kda)称重至反应容器，添加naoh溶液并混合反应直到获得均相溶液。将混合物在不搅拌的情况下温育，并随后用水和etoh稀释。混合物通过添加1.2mhcl来中和，并通过添加etoh来沉淀。沉淀物用乙醇(70w/w％)、随后是乙醇洗涤，并在真空中干燥过夜，以获得固体。结果在表5中显示。
相比于羟胺解(实施例10-1至实施例10-16)，通过均相碱水解的脱乙酰化给出更多的ha主链的降解，即脱乙酰化的产物的更低的mw。
表5.
实施例13-透明质酸通过非均相碱水解的脱乙酰化-比较实施例
将ha(1000kda)称重至反应容器，并添加在etoh中的naoh(70％w/w％)。将非均相混合物温育并随后通过添加1.2mhci中和。沉淀物用乙醇(75w/w％)、随后是乙醇洗涤，并在真空中干燥过夜，以获得固体。结果在表6中显示。
相比于羟胺解(实施例10-1至实施例10-16)，通过非均相碱水解的脱乙酰化给出更多的ha主链的降解，即脱乙酰化的产物的更低的mw。
表6.
进一步检查基质范围和化学选择性
用各种广泛使用的保护基团保护n-[2-(4-氨基-苯基)-乙基]-乙酰胺。
实施例14-(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)-氨基甲酸苄酯的制备
在0℃，在1分钟内，向n-[2-(4-氨基-苯基)-乙基]-乙酰胺(150mg，0.84mmol)在thf(2ml)和水(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加碳酸氢钠(91.9mg，1.09mmol)，随后添加氯甲酸苄酯(151mg，0.88mmol)。将反应混合物搅拌持续1小时，用dcm(30ml)稀释，用水(3×5ml)洗涤，干燥(mgso4)，以提供作为白色固体的(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)氨基甲酸苄酯(224mg，85％)：
lcms(tr＝1.13min.，es+＝313.68(m+h))；1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ9.67(s，1h)，7.86(t，j＝5.6hz，1h)，7.51-7.27(m，7h)，7.17-7.02(m，2h)，5.14(s，2h)，3.29-3.11(t，j＝7.4hz，2h)，2.63(t，j＝7.4hz，2h)，1.78(s，3h)；13cnmr(101mhz，dmso-d6)δ169.02，153.43，137.18，136.74，133.58，128.90，128.49，128.11，128.06，118.33，65.68，39.07，34.59，22.65.
实施例15-(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)氨基甲酸(9h-芴-9-基)甲酯的制备
在0℃，向n-[2-(4-氨基-苯基)-乙基]-乙酰胺(150mg，0.84mmol)在thf(2ml)和水(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加碳酸氢钠(91.9mg，1.09mmol)，随后添加fmoc-osu(298mg，0.88mmol)。反应混合物在室温搅拌持续1h，并且所得悬浮液用水(2ml)稀释，并且沉淀物通过过滤收集，用水(2ml)和乙醚(5ml)洗涤，以提供作为白色固体的(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)氨基甲酸(9h-芴-9-基)甲酯(316mg，94％)：
lcms(tr＝1.29min.，es+＝401.52(m+h)，423.55(m+na))；1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ9.61(s，1h)，7.99-7.79(m，2h)，7.86(t，j＝5.6hz，1h)，7.75(d，j＝7.4hz，2h)，7.50-7.28(m，6h)，7.09(d，j＝8.1hz，2h)，4.83(s，1h)，4.48(d，j＝6.7hz，2h)，4.31(t，j＝6.6hz，1h)，3.27-3.07(m，2h)，2.63(t，j＝7.4hz，2h)，1.78(s，3h).1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ9.61(s，1h)，7.92(d，j＝7.4hz，2h)，7.86(t，j＝5.6hz，1h)，7.75(d，j＝7.4hz，2h)，7.44(ddd，j＝8.1，7.4，1.2hz，2h)，7.36(td，j＝7.4，1.2hz，4h)，7.09(d，j＝8.1hz，2h)，4.48(d，j＝6.7hz，2h)，4.31(t，j＝6.7hz，1h)，3.26-3.12(m，2h)，2.68-2.58(m，2h)，1.78(s，3h).13cnmr(101mhz，dmso-d6)δ169.02，153.48，143.85，140.86，137.13，133.60，128.97，128.86，127.34，127.16，125.17，121.43，65.54，46.71，40.78，34.59，22.66.
实施例16-(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯的制备
在5分钟的时间段内，向n-(4-氨基苯乙基)乙酰胺(200mg，1.12mmol，1当量)和tea在dcm(10ml)中在0℃搅拌的溶液添加4-硝基苯基2-(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯(286mg，1.01mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，用dcm(10ml)稀释，用饱和的nahso4水溶液(5ml)、饱和的nahco3溶液(含水的)(5ml)、水(3×5ml)洗涤，经mgso4干燥并浓缩至干燥，以提供作为白色固体的标题化合物：
lcms(tr＝1.25min.，es+＝323.47(m+h)，345.47(m+na))；1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ9.37(s，1h)，7.80(t，j＝5.6hz，1h)，7.42-7.23(d，j＝8.3hz，2h)，7.12-6.96(d，j＝8.3hz，2h)，4.17-3.97(m，2h)，3.22-3.06(m，2h)，2.57(t，j＝7.4hz，2h)，1.76-1.67(m，3h)，0.00(s，9h)；13cnmr(101mhz，dmso-d6)δ169.99，153.70，137.39，133.35，128.82，118.34，67.07，40.31，34.59，25.40，22.65，-1.52.
实施例17-(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯的制备
在1分钟的时间段内，向n-(4-氨基苯乙基)乙酰胺(150mg，0.84mmol)在thf(2ml)和水(0.5ml)中在0℃搅拌的溶液添加碳酸氢钠(91.9mg，1.09mmol)，随后添加氯甲酸三氯甲酯(175mg，0.88mmol)(286mg，1.01mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h，用dcm(10ml)稀释，用水(3×5ml)洗涤，经mgso4干燥并浓缩至干，以提供作为白色固体的标题化合物(200mg，67％)；
lcms(tr＝1.17min.，es+＝353.35(m+h)；1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ10.05(s，1h)，7.86(t，j＝5.6hz，1h)，7.42(d，j＝8.1hz，2h)，7.19-7.02(d，j＝8.1hz，2h)，4.94(s，2h)，3.27-3.10(m，2h)，2.64(t，j＝7.4hz，2h)，1.78(s，3h)；13cnmr(101mhz，dmso-d6)δ169.03，151.85，136.52，134.30，129.00，118.74，96.05，73.39，39.99，34.59，22.65.
实施例18-4-(乙酰氨基甲基)苯甲酸甲酯的制备
向4-(氨基甲基)苯甲酸甲酯盐酸盐(260mg，1.29mmol)在dcm(5ml)中在室温搅拌的悬浮液中添加三乙胺(0.39ml，2.84mmol)，然后添加乙酸酐(171mg，1.68mmol)，并且将反应混合物在室温搅拌持续1h，用dcm(10ml)稀释，并用水(2ml)、饱和的nahso4水溶液(2ml)和水(2×2ml)洗涤。将有机提取物浓缩至干，以提供作为白色固体的4-(乙酰氨基甲基)苯甲酸甲酯(232mg，87％)：
lcms(tr＝0.92min.，es+＝208.42(m+h))；1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.42(t，j＝6.0hz，1h)，8.03-7.82(d，j＝7.7hz，2h)，7.49-7.24(d，j＝7.7hz，2h)，4.33(d，j＝6.0hz，2h)，3.85(s，3h)，1.90(s，3h)；13cnmr(dmso-d6)δ169.40，166.16，145.42，129.27，127.10，52.07，41.94，34,59，22.68.
实施例19-4-(乙酰氨基甲基)-n-甲基苯甲酰胺的制备
向4-氨基甲基-n-甲基-苯甲酰胺(250mg，1.52mmol)在dcm(20ml)中在室温搅拌的悬浮液中添加三乙胺(274μl，1.98mmol)，然后添加乙酸酐(155mg，1.52mmol)。将所得悬浮液在室温搅拌持续16h，并且沉淀物通过过滤收集，用dcm(2ml)洗涤，并干燥至恒重，以提供作为白色固体的4-(乙酰氨基甲基)-n-甲基苯甲酰胺(301mg，94.07％)：
lcms(tr＝0.66min.，es+＝207.40(m+h)；1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.37(t，j＝5.7hz，1h)，7.85-7.71(m，2h)，7.37-7.23(m，2h)，4.29(d，j＝6.0hz，2h)，2.78(d，j＝4.5hz，3h)，1.89(s，3h)；13cnmr(101mhz，dmso-d6)δ169.27，166.43，142.78，133.08，127.11，127.01，41.86，39.71，26.25，22.61.
实施例20-4-(乙酰氨基甲基)-n，n-二甲基苯甲酰胺的制备
向4-氨基甲基-n，n-二甲基-苯甲酰胺(250mg，1.40mmol)在dcm(20ml)中在室温搅拌的悬浮液中添加三乙胺(253μl，1.82mmol)，然后添加乙酸酐(143mg；1.40mmol)。将所得溶液在室温搅拌持续16h，用饱和的nahso4溶液(含水的)和水洗涤。将有机相干燥(mgso4)并浓缩至干，以提供作为淡黄色油的4-(乙酰氨基甲基)-n，n-二甲基苯甲酰胺(265mg，86％)；
lcms(tr＝0.75min.，es+＝221.14(m+h)；1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.37(s，1h)，7.41-7.13(m，5h)，4.28(d，j＝6.0hz，2h)，3.10-2.77(m，6h)，1.89(s，3h)；13cnmr(101mhz，dmso-d6)δ170.06，169.26，140.9，134.97，127.07，127.01，41.87，((ch3)2nc＝o-)在40.28-38.97的dmso峰下)，22.61.
实施例21-4-(乙酰氨基甲基)苯甲酸叔丁酯的制备
向4-氨基甲基-苯甲酸叔丁酯(250mg，1.21mmol)在dcm(20ml)中在室温搅拌的悬浮液中添加三乙胺(217μl，1.57mmol)，然后添加乙酸酐(123mg；1.21mmol)。将所得溶液在室温搅拌持续16h，用饱和的nahso4溶液(含水的)和水洗涤。将有机相干燥(mgso4)并浓缩至干，以提供作为透明无色油的4-(乙酰氨基甲基)苯甲酸叔丁酯(291mg，97％)：
lcms(tr＝1.14min.，es+＝250.50(m+h)，194.46(m-tbu+h)；1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ8.41(t，j＝6.0hz，1h)，7.90-7.77(m，2h)，7.47-7.27(m，2h)，4.31(d，j＝5.9hz，2h)，1.89(s，3h)，1.55(s，9h)；13cnmr(101mhz，dmso-d6)δ169.32，164.89，144.94，129.88，129.10，127.22，80.59，41.90，27.86，22.59.
实施例22-30乙酰胺相对于常见氨基甲酸酯保护基酯和其他酰胺的化学选择性裂解
实施例22-一般脱乙酰化程序
向‘乙酰胺’(50mg，1当量)在etoh-h2o(4∶1，5倍体积)中的搅拌的溶液添加nh2oh.tfa溶液(50％v/v，5当量)并且将悬浮液/溶液在80℃加热持续5h，冷却至室温，并通过质量触发制备型lcms直接纯化，以提供作为它们的三氟乙酸盐的期望的化合物。
实施例23-使用实施例22的一般程序将(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)氨基甲酸苄酯(实施例14)脱乙酰化。
按照实施例22的一般程序，分离出作为白色固体的(4-(2-氨基乙基)苯基)氨基甲酸苄酯(41.2mg，67％)。
lcms(tr＝0.51min.，es+271.31(m+h)；1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ9.74(s，1h)，7.81(s，3h)，7.53-7.27(m，7h)，7.18(d，j＝8.6hz，2h)，5.15(s，2h)，3.01(t，j＝7.9hz，2h)，2.79(m，2h)；13cnmr(101mhz，dmso-d6)δ153.44，137.84，136.68，131.15，129.06，128.50，128.13，128.10，118.52，65.75，40.10，32.45.
实施例24-使用实施例22的一般程序将(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯(实施例17)脱乙酰化。
按照实施例22的一般程序，分离出作为白色固体的(4-(2-氨基乙基)苯基)氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯(45mg，75％)。
lcms(tr＝0.56min.，es+311.12，313.15，315.09(m+h)；1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ10.12(s，1h)，7.76(s，3h)，7.47(d，j＝8.7hz，2h)，7.21(d，j＝8.7hz，2h)，4.94(s，2h)，3.02(dd，j＝9.2，6.6hz，2h)，2.81(dd，j＝9.2，6.6hz，2h)；13cnmr(101mhz，dmso-d6)δ151.87，137.18，131.89，129.16，118.95，96.01，73.41，40.11，32.53.
实施例25-使用实施例22的一般程序将(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(实施例16)脱乙酰化。
按照实施例22的一般程序，分离出作为近白色固体的(4-(2-氨基乙基)苯基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(48mg，78％)。
lcms(tr＝0.93min.，es+281(m+h)；1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ9.45(s，1h)，7.76(s，3h)，7.36(d，j＝8.3hz，2h)，7.10(d，j＝8.3hz，2h)，4.19-4.01(m，2h)，3.05-2.87(m，2h)，2.73(dd，j＝9.3，6.6hz，2h)，1.08-0.82(m，2h)，0.00(s，9h)；13cnmr(101mhz，dmso-d6)δ153.69，138.06，130.92，128.98，118.50，62.12，40.12，32.46，17.40，-1.39.
实施例26-使用实施例22的一般程序将(4-(2-乙酰氨基乙基)苯基)氨基甲酸(9h-芴-9-基)甲酯(实施例15)脱乙酰化。
按照实施例22的一般程序，分离出作为近白色固体的(4-(2-氨基乙基)苯基)氨基甲酸(9h-芴-9-基)甲酯(35mg，59％)。
lcms(tr＝0.99min.，es+395.47(m+h)；1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ9.67(s，1h)，7.92(d，j＝7.5hz，2h)，7.75(d，j＝7.4hz，2h)，7.51-7.28(重叠的信号，9h)，7.16(d，j＝8.2hz，2h)，4.49(d，j＝6.6hz，2h)，4.31(t，j＝6.6hz，1h)，2.96(m，2h)，2.84-2.59(m，2h).
实施例27-4-(乙酰氨基甲基)苯甲酸酯(实施例18)的脱乙酰化。
向4-(乙酰基氨基-甲基)-苯甲酸甲酯(40.0mg，0.19mmol)在thf(200μl)中的搅拌的溶液添加nh2oh.tfa(85.15mg，0.58mmol)，并且将溶液在80℃加热持续2h，冷却至室温，并通过制备型lcms纯化，以提供作为三氟乙酸盐的4-(氨基甲基)苯甲酸甲酯(22.0mg，69％)：
lcms(tr＝0.92min.，es+＝166.37(m+h)，149.72(m-nh3)+h)；1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.32(brs，3h)，8.09-7.94(d，j＝7.5hz，2h)，7.71-7.50(d，j＝7.5hz，2h)，4.14(s，2h)，3.87(s，3h)；13cnmr(dmso-d6)δ165.93，163.06，139.34，129.66，129.43，129.11，52.31，41.95.
实施例28-使用实施例22的一般程序将4-(乙酰氨基甲基)-n-甲基苯甲酰胺(实施例19)脱乙酰化。
按照实施例22的一般程序，分离出作为白色固体的4-(氨基甲基)-n-甲基苯甲酰胺(22mg，54％)。
lcms(tr＝0.15min.，es+165(m+h)；1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ8.35(d，j＝4.5hz，1h)，7.84-7.69(d，2h)，7.32(d，j＝7.9hz，2h)，7.20(s，1h)，4.17(d，j＝5.8hz，2h)，2.78(d，j＝4.5hz，3h)；13cnmr(101mhz，dmso-d6)δ166.55，142.78，133.08，127.01，126.70，26.25.
实施例29-使用实施例22的一般程序将4-(乙酰氨基甲基)-n，n-二甲基苯甲酰胺(实施例20)脱乙酰化。
按照实施例22的一般程序，分离出作为白色固体的4-(氨基甲基)-n，n-二甲基苯甲酰胺(24mg，59％)。
lcms(tr＝0.15min.，es+179(m+h)；1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ7.48-7.22(m，4h)，3.75(s，1h)，2.94(2s，旋转异构体，6h)；13cnmr(101mhz，dmso-d6)δ166.55，145.40，134.43，127.10，126.70，45.70，26.25.
实施例30-使用实施例22的一般程序将4-(乙酰氨基甲基)苯甲酸叔丁酯(实施例21)脱乙酰化。
按照实施例22的一般程序，分离出作为透明无色油的4-(氨基甲基)苯甲酸叔丁酯(29mg，70％)。
lcms(tr＝0.79min.，es+208(m+h)；1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ7.92-7.78(d，j＝8.0hz，2h)，7.36(d，j＝8.0hz，1h)，3.78(s，2h)，1.55(s，9h)；13cnmr(101mhz，dmso-d6)δ164.44，144.13，134.21，129.03，126.94，80.53，43.71，27.88.