抗体融合蛋白的制造方法与流程

本发明涉及使抗体与溶酶体酶融合而成的融合蛋白的制造方法，例如，涉及将通过对导入了整合有编码该融合蛋白的基因的表达载体的宿主细胞进行培养而得到的重组融合蛋白纯化至能够作为药物利用的纯度的方法。

背景技术：

目前，有很多含有重组蛋白作为有效成分的药物正在销售。这样的重组蛋白是通过对导入了整合有编码目标蛋白质的基因的表达载体的宿主细胞进行培养而在培养上清中得到的。在培养上清中得到的重组蛋白含有夹杂物，因此不能直接作为药物使用。为了作为药物使用，需要对培养上清中含有的重组蛋白进行纯化。

已经报道了如下方法：使用哺乳动物细胞作为宿主细胞，对该宿主细胞进行培养，将在培养上清中得到的重组蛋白纯化至能够作为药物使用的水平。例如报道了下述方法：对于作用于红细胞祖细胞而使其分化成红细胞的、作为促进红细胞产生的糖蛋白的人促红细胞生成素(hepo)，使用cho细胞作为宿主细胞，以重组蛋白的形式进行表达，使用包括染料亲和柱色谱的各种色谱从培养上清中将其纯化至能够用于药物为止(专利文献1)。另外，例如报道了下述方法：对于具有促进卵巢中的雌激素生产和分泌的活性的促性腺激素之一的人促卵泡激素(hfsh)，使用cho细胞作为宿主细胞，以重组蛋白的形式进行表达，使用包括阳离子交换柱色谱的各种色谱从培养上清中将其纯化至能够用于药物为止(专利文献2)。另外，例如报道了下述方法：对于作为具有将存在于硫酸肝素、硫酸皮肤素等糖胺聚糖(gag)分子内的硫酸酯键水解的活性的溶酶体酶之一的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hi2s)，使用cho细胞作为宿主细胞，以重组蛋白的形式进行表达，使用包括阳离子交换柱色谱的各种色谱从培养上清中将其纯化至能够用于药物为止(专利文献3)。另外，例如报道了下述方法：对于作为具有将糖脂质和糖蛋白的末端α-半乳糖苷键水解的活性的溶酶体酶之一的人α-半乳糖苷酶a(hα-gala)，使用cho细胞作为宿主细胞，以重组蛋白的形式进行表达，使用包含阴离子交换柱色谱的各种色谱从培养上清中将其纯化至能够用于药物为止(专利文献4、专利文献5)。此外，例如报道了下述方法：对于具有以碱基序列非特异性的方式分解dna的活性的人dnasei，使用cho细胞作为宿主细胞，以重组蛋白的形式进行表达，使用包括阴离子交换柱色谱和染料配体亲和柱色谱的各种色谱从培养上清中将其纯化至能够用于药物为止(专利文献6)。

这样，为了取得能够作为药物使用的重组蛋白，对于各重组蛋白，开发出了单独的纯化方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2010-511378号公报

专利文献2：日本特开2009-273427号公报

专利文献3：日本特表2014-508506号公报

专利文献4：国际公开第2014/017088号

专利文献5：国际公开第2016/117341号

专利文献6：国际公开第2016/067944号

技术实现要素：

发明所要解决的问题

本发明的目的在于提供以重组蛋白的形式表达抗体与其他蛋白质融合而成的融合蛋白、并将其纯化至能够作为药物在市场中流通的纯度的方法。

用于解决问题的方法

在面向上述目的研究中，本发明人反复进行了深入研究，结果发现，将导入了整合有编码使抗转铁蛋白受体抗体与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hi2s)融合而成的融合蛋白的基因的表达载体的哺乳动物细胞在无血清培养基中进行培养，通过将在培养液中得到的融合蛋白利用使用对融合蛋白具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱以及尺寸排阻柱色谱的组合进行纯化，能够以高纯度高效地进行纯化。本发明是基于这些发现进一步加以研究而完成的。即，本发明提供以下发明。

1.一种制造方法，其为使抗体与人溶酶体酶融合而成的融合蛋白的制造方法，其包括：

(a)将产生该融合蛋白的哺乳动物细胞在无血清培养基中进行培养，使该融合蛋白分泌到培养液中的步骤；

(b)通过从该培养液中除去该哺乳动物细胞而回收培养上清的步骤；以及

(c)利用使用结合有对该融合蛋白具有亲和性的物质的材料作为固定相的柱色谱、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱、以及尺寸排阻柱色谱，从该培养上清中纯化出该融合蛋白的步骤。

2.如上述1所述的制造方法，其中，在该步骤(c)中，依次利用使用结合有对该融合蛋白具有亲和性的物质的材料作为固相的柱色谱、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱、以及尺寸排阻柱色谱。

3.如上述1或2所述的制造方法，其中，对该融合蛋白具有亲和性的物质选自由蛋白a、蛋白g、蛋白l、蛋白a/g、该抗体的抗原、将该抗体作为抗原进行识别的抗体、以及该溶酶体酶的抗体组成的组中。

4.如上述1至3中任一项所述的制造方法，其中，对磷酸基具有亲和性的该材料为氟磷灰石或羟基磷灰石中的任意一种。

5.如上述1至3中任一项所述的制造方法，其中，对磷酸基具有亲和性的该材料为羟基磷灰石。

6.如上述1至5中任一项所述的制造方法，其中，与该人溶酶体酶融合的该抗体为人源化抗体或人抗体。

7.如上述1至5中任一项所述的制造方法，其中，与该人溶酶体酶融合的该抗体为人源化抗体。

8.如上述1至7中任一项所述的制造方法，其中，与该人溶酶体酶融合的该抗体以存在于血管内皮细胞的表面的分子作为抗原。

9.如上述8所述的制造方法，其中，存在于血管内皮细胞的表面的该分子选自由转铁蛋白受体(tfr)、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、igf受体、oatp-f、有机阴离子转运体、mct-8、单羧酸转运体、以及fc受体组成的组中。

10.如上述8所述的制造方法，其中，该血管内皮细胞为脑血管内皮细胞。

11.如上述10所述的制造方法，其中，存在于该脑血管内皮细胞的表面的分子选自由转铁蛋白受体(tfr)、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、igf受体、oatp-f、有机阴离子转运体、mct-8、以及单羧酸转运体组成的组中。

12.如上述8至11中任一项所述的制造方法，其中，该血管内皮细胞为人的血管内皮细胞。

13.如上述1至12中任一项所述的制造方法，其中，该抗体为抗人转铁蛋白受体抗体。

14.如上述1至13中任一项所述的制造方法，其中，该融合蛋白是经由选自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖类、葡聚糖、聚乙烯基醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、壳多糖类、透明质酸、生物素-链霉抗生物素蛋白、以及它们的衍生物组成的组中的接头将该抗体与该人溶酶体酶结合而成的。

15.如上述1至13中任一项所述的制造方法，其中，该融合蛋白是在该抗体的重链的c末端侧或n末端侧、通过肽键直接结合该人溶酶体酶或者经由接头序列结合该人溶酶体酶而成的。

16.如上述1至13中任一项所述的制造方法，其中，该融合蛋白是在该抗体的轻链的c末端侧或n末端侧、通过肽键直接结合该人溶酶体酶或者经由接头序列结合该人溶酶体酶而成的。

17.如上述15或16所述的制造方法，其中，该接头序列由1～50个氨基酸残基构成。

18.如上述17所述的制造方法，其中，该接头序列包含选自由1个甘氨酸、1个丝氨酸、氨基酸序列(gly-ser)、氨基酸序列(gly-gly-ser)、序列号1的氨基酸序列、序列号2的氨基酸序列、序列号3的氨基酸序列、以及1～10个这些氨基酸序列连续而成的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列。

19.如上述17或18所述的制造方法，其中，该接头序列具有氨基酸序列(gly-ser)所表示的氨基酸序列。

20.如上述1至19中任一项所述的制造方法，其中，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(人i2s)。

21.如上述20所述的制造方法，其中，该人i2s具有序列号5所表示的氨基酸序列。

22.如上述20所述的制造方法，其中，该人i2s与序列号5所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有作为人i2s的活性。

23.如上述20所述的制造方法，其中，该人i2s与序列号5所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性，并且具有作为人i2s的活性。

24.如上述20所述的制造方法，其中，该人i2s具有在序列号5所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有作为人i2s的活性。

25.如上述20所述的制造方法，其中，该人i2s具有在序列号5所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～5个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有作为人i2s的活性。

26.如上述20所述的制造方法，其中，该人i2s具有在序列号5所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有作为人i2s的活性。

27.如上述1至26中任一项所述的制造方法，其中，该抗体为人源化抗htfr抗体，该人源化抗htfr抗体为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的抗体：

(a)轻链具有序列号6所表示的氨基酸序列、重链具有序列号7所表示的氨基酸序列的抗体；

(b)轻链具有序列号8所表示的氨基酸序列、重链具有序列号9所表示的氨基酸序列的抗体；以及

(c)轻链具有序列号10所表示的氨基酸序列、重链具有序列号11所表示的氨基酸序列的抗体。

28.如上述1至26中任一项所述的制造方法，其中，该抗体为人源化抗htfr抗体，该人源化抗htfr抗体为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的抗体：

(a)轻链与序列号6所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性、重链与序列号7所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的抗体；

(b)轻链与序列号8所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性、重链与序列号9所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的抗体；以及

(c)轻链与序列号10所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性、重链与序列号11所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的抗体。

29.如上述1至26中任一项所述的制造方法，其中，该抗体为人源化抗htfr抗体，该人源化抗htfr抗体为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的抗体：

(a)轻链与序列号6所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性、重链与序列号7所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性的抗体；

(b)轻链与序列号8所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性、重链与序列号9所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性的抗体；以及

(c)轻链与序列号10所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性、重链与序列号11所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性的抗体。

30.如上述1至26中任一项所述的制造方法，其中，该抗体为人源化抗htfr抗体，该人源化抗htfr抗体为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的抗体：

(a)轻链具有在序列号6所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链具有在序列号7所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体；

(b)轻链具有在序列号8所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链具有在序列号9所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体；以及

(c)轻链具有在序列号10所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链具有在序列号11所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体。

31.如上述1至26中任一项所述的制造方法，其中，该抗体为人源化抗htfr抗体，该人源化抗htfr抗体为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的抗体：

(a)轻链具有在序列号6所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链具有在序列号7所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体；

(b)轻链具有在序列号8所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链具有在序列号9所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体；以及

(c)轻链具有在序列号10所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链具有在序列号11所表示的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体。

32.如上述20所述的制造方法，其中，该抗体为人源化抗htfr抗体，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(人i2s)，该融合蛋白为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的蛋白质：

(a)由具有序列号6所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链和在具有序列号7所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧经由接头序列(gly-ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白；

(b)由具有序列号8所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链和在具有序列号9所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧经由接头序列(gly-ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白；以及

(c)由具有序列号10所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链和在具有序列号11所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧经由接头序列(gly-ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白。

33.如上述20所述的制造方法，其中，该抗体为人源化抗htfr抗体，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，该融合蛋白为选自由以下的(a)～(c)组成的组中的蛋白质：

(a)该人源化抗htfr抗体的轻链具有序列号6所表示的氨基酸序列、该人源化抗htfr抗体的重链在其c末端侧经由具有(gly-ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号12所表示的氨基酸序列的融合蛋白；

(b)该人源化抗htfr抗体的轻链具有序列号8所表示的氨基酸序列、该人源化抗htfr抗体的重链在其c末端侧经由具有(gly-ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号13所表示的氨基酸序列的融合蛋白；以及

(c)该人源化抗htfr抗体的轻链具有序列号10所表示的氨基酸序列、该人源化抗htfr抗体的重链在其c末端侧经由具有(gly-ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号14所表示的氨基酸序列的融合蛋白。

发明效果

根据本发明，可以提供纯化至能够在临床上用作伴有中枢神经障碍的溶酶体病的治疗剂的纯度的、抗转铁蛋白受体抗体与溶酶体酶的融合蛋白。特别是，可以提供纯化至能够在临床上用作伴有中枢神经障碍的亨特综合征的治疗剂的纯度的、抗转铁蛋白受体抗体与人i2s的融合蛋白。

附图说明

图1是示出实施例6中得到的i2s-抗htfr抗体纯化品的se-hplc的谱图的图。纵轴表示215nm下的吸光度，横轴表示保留时间(分钟)。(a)表示来自于i2s-抗htfr抗体3的单体的峰，(b)表示来自于i2s-抗htfr抗体3的聚合物的峰。

图2是示出实施例12中得到的i2s-抗htfr抗体纯化品的se-hplc的谱图的图。纵轴表示215nm下的吸光度，横轴表示保留时间(分钟)。(a)表示来自于i2s-抗htfr抗体3的单体的峰，(b)表示来自于i2s-抗htfr抗体3的聚合物的峰。

具体实施方式

本发明涉及使抗转铁蛋白受体抗体(抗tfr抗体)与人溶酶体酶结合而成的蛋白质的制造方法。在此，与溶酶体酶结合的抗体只要具有与抗原特异性结合的性质即可，对于抗体的动物种类等没有特别限制，特别地为人抗体或人源化抗体。例如，抗体可以为人以外的哺乳动物的抗体，另外也可以为人抗体与人以外的其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体。

人抗体是指其整体由来源于人的基因编码的抗体。其中，出于提高基因的表达效率等目的对原来的人的基因施加突变而得到的基因所编码的抗体也是人抗体。另外，将编码人抗体的两个以上的基因组合并将某一人抗体的一部分置换成其他人抗体的一部分而得到的抗体也是人抗体。人抗体具有免疫球蛋白轻链的三个部位的互补决定区(cdr)和免疫球蛋白重链的三个部位的互补决定区(cdr)。免疫球蛋白轻链的三个部位的cdr按照从n末端侧起的顺序依次称为cdr1、cdr2和cdr3。免疫球蛋白重链的三个部位的cdr按照从n末端侧起的顺序依次称为cdr1、cdr2和cdr3。通过将某一人抗体的cdr置换成其他人抗体的cdr而改变了人抗体的抗原特异性、亲和性等的抗体也是人抗体。

本发明中，通过改变原来的人抗体的基因而对原来的抗体的氨基酸序列施加了置换、缺失、添加等突变的抗体也称为人抗体。在将原来的抗体的氨基酸序列中的氨基酸置换成其他氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～5个、进一步更优选为1～3个。在使原来的抗体的氨基酸序列中的氨基酸缺失的情况下，所缺失的氨基酸的个数优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～5个、进一步更优选为1～3个。另外，施加了组合有这些氨基酸的置换和缺失的突变的抗体也是人抗体。在添加氨基酸的情况下，在原来的抗体的氨基酸序列之中或者在n末端侧或c末端侧添加优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～5个、进一步更优选为1～3个的氨基酸。施加了组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的突变的抗体也是人抗体。施加了突变的抗体的氨基酸序列与原来的抗体的氨基酸序列优选显示出80％以上的同源性，更优选显示出90％以上的同源性，进一步优选显示出95％以上的同源性，进一步更优选显示出98％以上的同源性。即，本发明中提到“来源于人的基因”时，除了来源于人的原来的基因以外，也包含通过对来源于人的原来的基因施加改变而得到的基因。

本发明中，“人源化抗体”的术语是指可变区的一部分(例如特别是cdr的全部或一部分)的氨基酸序列来源于人以外的哺乳动物、除此以外的区域来源于人的抗体。例如，作为人源化抗体，可以列举通过将构成人抗体的免疫球蛋白轻链的三个部位的互补决定区(cdr)和免疫球蛋白重链的三个部位的互补决定区(cdr)用其他哺乳动物的cdr置换而制作的抗体。作为移植到人抗体的适当位置的cdr的来源的其他哺乳动物的生物种类只要是人以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马或人以外的灵长类，更优选为小鼠和大鼠，例如小鼠。

本发明中，以下对抗体为人抗体或人源化抗体的情况进行详述。人抗体和人源化抗体的轻链有λ链和κ链。构成抗体的轻链可以为λ链和κ链中的任意一种。另外，人抗体和人源化抗体的重链有γ链、μ链、α链、σ链和ε链，分别对应于igg、igm、iga、igd和ige。构成抗体的重链可以为γ链、μ链、α链、σ链和ε链中的任意一种，优选为γ链。此外，抗体的重链的γ链有γ1链、γ2链、γ3链和γ4链，分别对应于igg1、igg2、igg3和igg4。在构成抗体的重链为γ链的情况下，其γ链可以为γ1链、γ2链、γ3链和γ4链中的任意一种，优选为γ1链或γ4链。在抗体为人源化抗体或人抗体、且为igg的情况下，该抗体的轻链可以为λ链和κ链中的任意一种，该抗体的重链可以为γ1链、γ2链、γ3链和γ4链中的任意一种，优选为γ1链或γ4链。例如，作为优选的抗体的一个方式，可以列举轻链为λ链、重链为γ1链的方式。

本发明中，“嵌合抗体”的术语是指来源于两个以上的不同种类的、两个以上的不同抗体的片段连接而成的抗体。

人抗体与其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体是指人抗体的一部分被人以外的哺乳动物的抗体的一部分置换而得到的抗体。抗体由以下说明的fc区域、fab区域和铰链部构成。作为这样的嵌合抗体的具体例，可以列举fc区域来源于人抗体、而fab区域来源于其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体。铰链部来源于人抗体或其他哺乳动物的抗体中的任意一者。相反地，可以列举fc区域来源于其他哺乳动物、而fab区域来源于人抗体的嵌合抗体。铰链部可以来源于人抗体或其他哺乳动物的抗体中的任意一者。

另外，抗体也可以说由可变区和恒定区构成。作为嵌合抗体的其他具体例，还可以列举重链的恒定区(ch)和轻链的恒定区(cl)来源于人抗体、而重链的可变区(vh)和轻链的可变区(vl)来源于其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体；相反地重链的恒定区(ch)和轻链的恒定区(cl)来源于其他哺乳动物的抗体、而重链的可变区(vh)和轻链的可变区(vl)来源于人抗体的嵌合抗体。在此，其他哺乳动物的生物种类只要是人以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马或人以外的灵长类，更优选为小鼠。

人抗体与小鼠抗体的嵌合抗体特别是指“人/小鼠嵌合抗体”。人/小鼠嵌合抗体可以列举fc区域来源于人抗体、而fab区域来源于小鼠抗体的嵌合抗体；或者相反地fc区域来源于小鼠抗体、而fab区域来源于人抗体的嵌合抗体。铰链部来源于人抗体或小鼠抗体中的任意一者。作为人/小鼠嵌合抗体的其他具体例，还可以列举重链的恒定区(ch)和轻链的恒定区(cl)来源于人抗体、而重链的可变区(vh)和轻链的可变区(vl)来源于小鼠抗体的嵌合抗体；相反地重链的恒定区(ch)和轻链的恒定区(cl)来源于小鼠抗体、而重链的可变区(vh)和轻链的可变区(vl)来源于人抗体的嵌合抗体。

抗体原本具有由两条免疫球蛋白轻链和两条免疫球蛋白重链共计四条多肽链构成的基本结构。但是，本发明中，提到“抗体”时，除了具有该基本结构的抗体以外，还包含：

(1)由一条免疫球蛋白轻链和一条免疫球蛋白重链共计两条多肽链构成的抗体；或者如以下详述的那样，

(2)在免疫球蛋白轻链的c末端侧结合接头序列、并且进一步在其c末端侧结合免疫球蛋白重链而成的单链抗体；以及

(3)在免疫球蛋白重链的c末端侧结合接头序列、并且进一步在其c末端侧结合免疫球蛋白轻链而成的单链抗体。

另外，(4)由从原本的含义下的抗体的基本结构中缺失fc区域而得到的fab区域构成的片段、以及由fab区域和铰链部的全部或一部分构成的片段(包括fab、f(ab’)和f(ab’)2)也包含在本发明中的“抗体”中。此外，经由接头序列使轻链的可变区与重链的可变区结合而形成单链抗体的scfv也包含在本发明中的抗体中。

本发明中，提到“单链抗体”时，是指在包含免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的c末端侧结合接头序列、进一步在其c末端侧结合包含免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而成、能够与特定抗原特异性结合的蛋白质。另外，在包含免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的c末端侧结合接头序列、进一步在其c末端侧结合包含免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而成、能够与特定抗原特异性结合的蛋白质也是本发明中的“单链抗体”。例如，上述(2)和(3)所示者包含在单链抗体中。在免疫球蛋白重链的c末端侧经由接头序列结合有免疫球蛋白轻链的单链抗体中，通常免疫球蛋白重链缺失了fc区域。免疫球蛋白轻链的可变区具有三个与抗体的抗原特异性相关的互补决定区(cdr)。同样地，免疫球蛋白重链的可变区也具有三个cdr。这些cdr是决定抗体的抗原特异性的主要区域。因此，单链抗体中优选包含免疫球蛋白重链的全部三个cdr和免疫球蛋白轻链的全部三个cdr。但是，只要可维持抗体的抗原特异性的亲和性，也可以为使cdr的一个或多个缺失的单链抗体。

单链抗体中，配置在免疫球蛋白的轻链与重链之间的接头序列是由优选为2～50个、更优选为8～50个、进一步优选为10～30个、进一步更优选为12～18个或15～25个、例如为15个或25个的氨基酸残基构成的肽链。关于这样的接头序列，只要由其将两链连接而成的抗htfr抗体保持对htfr的亲和性，则对其氨基酸序列没有限定，但优选仅由甘氨酸构成或者由甘氨酸和丝氨酸构成，例如具有氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号1)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(序列号2)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly(序列号3)、或者这些氨基酸序列重复2～10次或2～5次而成的序列。例如，在由免疫球蛋白重链的可变区的全部区域构成的氨基酸序列的c末端侧经由接头序列结合免疫球蛋白轻链的可变区而形成scfv的情况下，优选使用由相当于3个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号1)连续而成的共计15个氨基酸构成的接头序列。

本发明中，作为抗体特异性识别的抗原，例如为存在于血管内皮细胞的表面的分子(表面抗原)。作为该表面抗原，可以列举转铁蛋白受体(tfr)、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、igf受体、oatp-f等有机阴离子转运体、mct-8等单羧酸转运体、fc受体，但不限定于这些。抗原优选为存在于人血管内皮细胞的表面的这些分子(表面抗原)。

上述表面抗原之中，转铁蛋白受体(tfr)、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、igf受体、oatp-f等有机阴离子转运体、mct-8等单羧酸转运体存在于形成血脑屏障(bloodbrainbarrier)的脑毛细血管内皮细胞(脑血管内皮细胞)的表面。能够识别这些抗原的抗体可经由抗原与脑毛细血管内皮细胞结合。并且，与脑毛细血管内皮细胞结合的抗体能够通过血脑屏障而到达中枢神经系统。因此，通过使目标蛋白质与这样的抗体结合，能够使其到达中枢神经系统。作为目标蛋白质，可以列举具有应在中枢神经系统中发挥药效的功能的蛋白质。可以列举例如在伴有中枢神经障碍的溶酶体病患者中缺损或功能不全的溶酶体酶作为目标蛋白质。该溶酶体酶无法直接到达中枢神经系统，无法对患者的中枢神经障碍显示出药效，但通过与这些抗体结合，变得能够通过血脑屏障，因此能够改善在溶酶体病患者中观察到的中枢神经障碍。

本发明中，“人转铁蛋白受体”或“htfr”的术语是指具有序列号4所示的氨基酸序列的膜蛋白质。本发明的抗htfr抗体在其一个实施方式中与序列号4所表示的氨基酸序列中从n末端侧起第89位的半胱氨酸残基至c末端的苯丙氨酸为止的部分(htfr的细胞外区域)特异性地结合，但并不限定于此。

以下以抗htfr的抗体为例对抗体的制作方法进行说明。作为抗htfr的抗体的制作方法，一般的方法是使用导入了整合有htfr基因的表达载体的细胞，制作重组人转铁蛋白受体(rhtfr)，使用该rhtfr利用小鼠等动物进行免疫而得到的方法。从免疫后的动物取出抗htfr的抗体产生细胞，使其与骨髓瘤细胞融合，由此能够制作具有抗htfr的抗体产生能力的杂交瘤细胞。

另外，通过利用体外免疫法用rhtfr对由小鼠等动物得到的免疫系统细胞进行免疫，也能够取得产生抗htfr的抗体的细胞。在利用体外免疫法进行免疫的情况下，对该免疫系统细胞所来源的动物种类没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、马和包括人在内的灵长类，更优选为小鼠、大鼠和人，进一步优选为小鼠和人。作为小鼠的免疫系统细胞，可以使用例如由小鼠的脾脏制备的脾细胞。作为人的免疫系统细胞，可以使用由人的外周血、骨髓、脾脏等制备的细胞。在利用体外免疫法对人的免疫系统细胞进行免疫的情况下，能够得到抗htfr的人抗体。

本发明中，对于应当与抗体结合的人溶酶体酶没有特别限定，可以列举α-l-艾杜糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、β-半乳糖苷酶、gm2活化蛋白质、β-己糖胺酶a、β-己糖胺酶b、n-乙酰基葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖脑苷酯酶、鞘脂激活蛋白c、芳基硫酸酯酶a、α-l-岩藻糖苷酶、天冬氨酰葡糖胺酶、α-n-乙酰基半乳糖胺酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶a、β--葡萄糖醛酸苷酶、乙酰肝素n-硫酸酯酶、α-n-乙酰基葡糖胺酶、乙酰coaα-氨基葡糖苷n-乙酰基转移酶、n-乙酰基葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1，6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶、天冬氨酰葡糖胺酶、棕榈酰蛋白质硫酯酶-1(ppt-1)、三肽基肽酶-1(tpp-1)、透明质酸酶-1、cln1和cln2等溶酶体酶。

在抗体特异性地识别存在于血管内皮细胞的表面的分子(表面抗原)的情况下，关于与抗体结合的人溶酶体酶，α-l-艾杜糖苷酶能够用作赫勒氏综合征或赫勒-施艾氏(hurler-scheie)综合征中的中枢神经障碍治疗剂，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶能够用作亨特综合征中的中枢神经障碍治疗剂，葡糖脑苷脂酶能够用作戈谢病中的中枢神经障碍治疗剂，β半乳糖苷酶能够用作gm1-神经节苷脂贮积症1～3型中的中枢神经障碍治疗剂，gm2活化蛋白质能够用作gm2-神经节苷脂贮积症ab异型中的中枢神经障碍治疗剂，β-己糖胺酶a能够用作山德霍夫氏病和泰-萨二氏病中的中枢神经障碍治疗剂，β-己糖胺酶b能够用作山德霍夫氏病中的中枢神经障碍治疗剂，n-乙酰基葡糖胺-1-磷酸转移酶能够用作i-细胞病中的中枢神经障碍治疗剂，α-甘露糖苷酶能够用作α-甘露糖苷贮积症中的中枢神经障碍治疗剂，β-甘露糖苷酶能够用作β-甘露糖苷贮积症中的中枢神经障碍治疗剂，半乳糖脑苷酯酶能够用作克拉伯病中的中枢神经障碍治疗剂，鞘脂激活蛋白c能够用作戈谢病样贮积症中的中枢神经障碍治疗剂，芳基硫酸酯酶a能够用作异染性脑白质退化症(异染性脑白质营养不良)中的中枢神经障碍治疗剂，α-l-岩藻糖苷酶能够用作岩藻糖苷酶贮积症中的中枢神经障碍治疗剂，天冬氨酰葡糖胺酶能够用作天冬氨酰葡糖胺尿症中的中枢神经障碍治疗剂，α-n-乙酰基半乳糖胺酶能够用作辛德勒病和川崎病中的中枢神经障碍治疗剂，酸性鞘磷脂酶能够用作尼曼匹克病中的中枢神经障碍治疗剂，α-半乳糖苷酶a能够用作法布里病中的中枢神经障碍治疗剂，β-葡萄糖醛酸苷酶能够用作斯赖综合征中的中枢神经障碍治疗剂，乙酰肝素n-硫酸酯酶、α-n-乙酰基葡糖胺酶、乙酰coaα-氨基葡糖苷n-乙酰基转移酶和n-乙酰基葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶能够用作沙费利波综合征中的中枢神经障碍治疗剂，酸性神经酰胺酶能够用作法伯病中的中枢神经障碍治疗剂，淀粉-1，6-葡萄糖苷酶能够用作柯里氏病(福布斯-柯里氏病)中的中枢神经障碍治疗剂，唾液酸酶能够用作唾液酸酶缺乏症中的中枢神经障碍治疗剂，天冬氨酰葡糖胺酶能够用作天冬氨酰葡糖胺尿症中的中枢神经障碍治疗剂，棕榈酰蛋白质硫酯酶-1(ppt-1)能够用作神经元蜡样脂褐质沉积症或桑-哈二氏(santavuori-haltia)病中的中枢神经障碍治疗剂，三肽基肽酶-1(tpp-1)能够用作神经元蜡样脂褐质沉积症或詹-比二氏(jansky-bielschowsky)病中的中枢神经障碍治疗剂，透明质酸酶-1能够用作透明质酸酶缺乏症中的中枢神经障碍治疗剂，cln1和cln2能够用作巴藤病中的中枢神经障碍治疗剂。

在抗体特异性地识别存在于血管内皮细胞的表面的分子(表面抗原)的情况下，作为应当与抗体结合的溶酶体酶的优选例，可以列举人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hi2s)。i2s是具有将存在于硫酸肝素、硫酸皮肤素等糖胺聚糖(gag)分子内的硫酸酯键水解的活性的溶酶体酶之一。亨特综合征是先天性缺失该酶的基因疾病。亨特综合征的患者在组织内蓄积硫酸肝素、硫酸皮肤素，结果表现出角膜混浊、精神发育迟缓等各种症状。但是，在轻症的情况下，也有时观察不到精神发育迟缓。该抗体与hi2s的融合蛋白能够通过透过bbb而将蓄积在脑组织内的gag分解，因此，通过给药于表现出精神发育迟缓的亨特综合征的患者，能够作为中枢神经障碍治疗剂使用。

本发明中，“人i2s”或“hi2s”的术语特别是指具有与野生型的hi2s相同的氨基酸序列的hi2s。野生型的hi2s具有由序列号5所表示的525个氨基酸构成的氨基酸序列。但是，不限于此，只要具有i2s活性，对野生型的hi2s的氨基酸序列施加置换、缺失、添加等突变而得到的氨基酸序列也包含在hi2s中。在将hi2s的氨基酸序列的氨基酸置换为其他氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、进一步更优选为1～2个。在使hi2s的氨基酸序列中的氨基酸缺失的情况下，所缺失的氨基酸的个数优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、进一步更优选为1～2个。另外，也可以施加组合有这些氨基酸的置换和缺失的突变。在对hi2s添加氨基酸的情况下，在hi2s的氨基酸序列之中或者在n末端侧或c末端侧添加优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、进一步更优选为1～2个的氨基酸。也可以施加组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的突变。施加了突变的hi2s的氨基酸序列与原来的hi2s的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示出90％以上的同源性，进一步优选显示出95％以上的同源性。

需要说明的是，本发明中，提到hi2s具有i2s活性时，是指在使hi2s与抗体融合而形成融合蛋白时，相对于天然型的hi2s本来具有的活性，具有3％以上的活性。其中，相对于天然型的hi2s本来具有的活性，该活性优选为10％以上、更优选为20％以上、进一步优选为50％以上、进一步更优选为80％以上。在与抗体融合的hi2s施加了突变的情况下也同样。抗体例如为抗htfr抗体。

本发明中提到“融合蛋白”时，是指使抗体与人溶酶体酶经由非肽接头或肽接头结合、或者直接结合而得到的物质。以下对使抗体与人溶酶体酶结合的方法进行详述。

作为使抗体与人溶酶体酶结合的方法，有经由非肽接头或肽接头使其结合的方法。作为非肽接头，可以使用聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖类、葡聚糖、聚乙烯基醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、壳多糖类、以及透明质酸、或它们的衍生物、或者它们的组合。肽接头是由以肽键键合的1～50个氨基酸构成的肽链或其衍生物，其n末端和c末端分别与抗体或人溶酶体酶中的任意一者形成共价键，由此使抗体与人溶酶体酶结合。

在使用生物素-链霉抗生物素蛋白作为非肽接头的情况下，可以使抗体结合生物素，使人溶酶体酶结合链霉抗生物素蛋白，经由该生物素与链霉抗生物素蛋白的结合使抗体与人溶酶体酶结合；相反地，也可以使抗体结合链霉抗生物素蛋白，使人溶酶体酶结合生物素，经由该生物素与链霉抗生物素蛋白的结合使抗体与人溶酶体酶结合。

使用peg作为非肽接头使本发明的抗体与人溶酶体酶结合而得到的物质特别地称为抗体-peg-人溶酶体酶。抗体-peg-人溶酶体酶可以通过使抗体与peg结合而制作抗体-peg，接着使抗体-peg与人溶酶体酶结合来制造。或者，抗体-peg-人溶酶体酶也可以通过使人溶酶体酶与peg结合而制作人溶酶体酶-peg，接着使人溶酶体酶-peg与抗体结合来制造。使peg与抗体和人溶酶体酶结合时，使用经碳酸酯、羰基咪唑、羧酸的活性酯、吖内酯、环状酰亚胺硫酮、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯或醛等官能团修饰的peg。这些导入至peg中的官能团主要通过与抗体和人溶酶体酶分子内的氨基反应而将peg与抗体和人溶酶体酶共价键合。对此时使用的peg的分子量和形状没有特别限定，其平均分子量(mw)优选为mw＝300～60000、更优选为mw＝500～20000。例如，平均分子量为约300、约500、约1000、约2000、约4000、约10000、约20000等的peg可以优选作为非肽接头使用。

例如，抗体-peg通过将抗体和具有醛基作为官能团的聚乙二醇(ald-peg-ald)按照ald-peg-ald相对于该抗体的摩尔比为11、12.5、15、110、120等的方式进行混合，在其中添加nacnbh3等还原剂使其反应而得到。接着，在nacnbh3等还原剂的存在下使抗体-peg与人溶酶体酶反应，由此得到抗体-peg-人溶酶体酶。相反地，也可以通过先使人溶酶体酶与ald-peg-ald结合而制作人溶酶体酶-peg，接着使人溶酶体酶-peg与抗体结合而得到抗体-peg-人溶酶体酶。

关于抗体和人溶酶体酶，也可以在抗体的重链或轻链的c末端侧或n末端侧经由接头序列或者直接通过肽键分别结合人溶酶体酶的n末端或c末端。这样使抗体与人溶酶体酶结合而成的融合蛋白可以通过将在编码抗体的重链或轻链的cdna的3’末端侧或5’末端侧直接或夹着编码接头序列的dna片段以框内方式配置有编码人溶酶体酶的cdna的dna片段整合到哺乳动物细胞、酵母等真核生物用的表达载体中，并对导入有该表达载体的哺乳动物细胞进行培养而得到。在该哺乳动物细胞中，在使编码人溶酶体酶的dna片段与重链结合的情况下，将整合有编码抗体的轻链的cdna片段的哺乳动物细胞用的表达载体也导入至相同的宿主细胞中，另外，在使编码人溶酶体酶的dna片段与轻链结合的情况下，将整合有编码抗体的重链的cdna片段的哺乳动物细胞用的表达载体也导入至相同的宿主细胞中。在抗体为单链抗体的情况下，使抗体与人溶酶体酶结合而成的融合蛋白可以通过在编码人溶酶体酶的cdna的5’末端侧或3’末端侧直接或者夹着编码接头序列的dna片段连接有编码单链抗体的cdna的dna片段整合到哺乳动物细胞、酵母等真核生物用的表达载体中，并在导入有该表达载体的这些细胞中进行表达而得到。

在抗体的轻链的c末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白中，抗体含有包含轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和包含重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体的轻链的c末端侧。在此，抗体的轻链与人溶酶体酶可以直接结合，也可以经由接头结合。

在抗体的重链的c末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白中，抗体含有包含轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和包含重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体的重链的c末端侧。在此，抗体的重链与人溶酶体酶可以直接结合，也可以经由接头结合。

在抗体的轻链的n末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白中，抗体含有包含轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和包含重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体的轻链的n末端侧。在此，抗体的轻链与人溶酶体酶可以直接结合，也可以经由接头结合。

在抗体的重链的n末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白中，抗体含有包含轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和包含重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体的重链的n末端侧。在此，抗体的重链与人溶酶体酶可以直接结合，也可以经由接头结合。

此时，在抗体与人溶酶体酶之间配置接头序列的情况下，该序列由优选为1～50个、更优选为1～17个、进一步优选为1～10个、进一步更优选为1～5个的氨基酸构成，构成接头序列的氨基酸的个数可以根据应当与抗体结合的人溶酶体酶而适当调节为1个、2个、3个、1～17个、1～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个等。关于这样的接头序列，只要由其连接的抗体保持对htfr的亲和性，并且由该接头序列连接的人溶酶体酶在生理条件下能够发挥该蛋白质的生理活性，则对其氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成，例如具有由甘氨酸或丝氨酸中的任意一个氨基酸构成的氨基酸序列、由氨基酸序列g1y-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号1)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(序列号2)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly(序列号3)、或者1～10个或2～5个这些氨基酸序列连续而成的由1～50个氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个氨基酸构成的序列等。例如，可以优选使用具有氨基酸序列gly-ser的序列作为接头序列。抗体为单链抗体时也同样。

需要说明的是，本发明中，在一个肽链包含两个以上的接头序列的情况下，为方便起见，将各接头序列从n末端侧起依次命名为第一接头序列、第二接头序列。

在抗体为人源化抗体且为抗人转铁蛋白受体抗体的情况下，作为抗体的优选方式，可以列举以下的(x)～(z)。即为下述中的任意一者：

(x)轻链具有序列号6所表示的氨基酸序列、重链具有序列号7所表示的氨基酸序列的抗体；

(y)轻链具有序列号8所表示的氨基酸序列、重链具有序列号9所表示的氨基酸序列的抗体；

(z)轻链具有序列号10所表示的氨基酸序列、重链具有序列号11所表示的氨基酸序列的抗体。

需要说明的是，在此，(x)、(y)和(z)分别相当于实施例中所示的人源化抗htfr抗体编号1、人源化抗htfr抗体编号2和人源化抗htfr抗体编号3。

但是，在抗体为人源化抗体且为抗人转铁蛋白受体抗体的情况下，抗体的优选方式并不限于上述的(x)～(z)。例如，只要对htfr具有亲和性，抗体的轻链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列具有80％以上的同源性、该抗体的重链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列具有80％以上的同源性的抗体也可以在本发明中使用。另外，只要对htfr具有亲和性，抗体的轻链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列具有90％以上的同源性、该抗体的重链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列具有90％以上的同源性的抗体也可以在本发明中使用。另外，只要对htfr具有亲和性，抗体的轻链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列具有95％以上的同源性、该抗体的重链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列具有95％以上的同源性的抗体也可以作为本发明中的抗体使用。

另外，只要对htfr具有亲和性，轻链的氨基酸序列具有在构成上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链的氨基酸序列具有在构成上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体也可以作为本发明中的抗体使用。另外，只要对htfr具有亲和性，轻链的氨基酸序列具有在构成上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～5个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链的氨基酸序列具有在构成上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～5个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体也可以作为本发明中的抗体使用。此外，只要对htfr具有亲和性，轻链的氨基酸序列具有在构成上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列、重链的氨基酸序列具有在构成上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体也可以作为本发明中的抗体使用。

在上述抗体的优选方式(x)中，在序列号6所表示的轻链的氨基酸序列中，序列号15所表示的氨基酸序列为可变区，在序列号7所表示的重链的氨基酸序列中，序列号16所表示的氨基酸序列为可变区。另外，在上述抗体的优选方式(y)中，在序列号8所表示的轻链的氨基酸序列中，序列号17所表示的氨基酸序列为可变区，在序列号9所表示的重链的氨基酸序列中，序列号18所表示的氨基酸序列为可变区。另外，在上述抗体的优选方式(z)中，在序列号10所表示的轻链的氨基酸序列中，序列号19所表示的氨基酸序列为可变区，在序列号11所表示的重链的氨基酸序列中，序列号20所表示的氨基酸序列为可变区。在这些抗体的优选方式(x)～(z)中，特别是在这些可变区中导入对构成重链或/和轻链的氨基酸序列的氨基酸序列的置换、缺失或添加。

需要说明的是，本发明中，原来的蛋白质(包括抗体)的氨基酸序列与施加了突变的蛋白质的氨基酸序列的同源性可以使用公知的同源性计算算法容易地算出。例如，作为这样的算法，有blast(altschulsf.jmol.biol.215.403-10、(1990))、pearson和lipman的类似性检索法(proc.natl.acad.sci.usa.85.2444(1988))、smith和waterman的局部同源性算法(adv.appl.math.2.482-9(1981))等。

在抗体为人源化抗人转铁蛋白受体抗体、人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(人i2s)的情况下，作为融合蛋白的优选方式，可以列举以下的(a)～(c)。即，

(a)由具有序列号6所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链和在具有序列号7所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧经由接头序列(gly-ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白；

(b)由具有序列号8所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链和在具有序列号9所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧经由接头序列(gly-ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白；

(c)由具有序列号10所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链和在具有序列号11所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧经由接头序列(gly-ser)结合序列号5所表示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白。

另外，在抗体为人源化抗人转铁蛋白受体抗体、人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(人i2s)的情况下，作为融合蛋白的优选方式，可以列举以下的(a)～(c)。即，

(a)该人源化抗htfr抗体的轻链具有序列号6所表示的氨基酸序列，该人源化抗htfr抗体的重链在其c末端侧经由具有(gly-ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号12所表示的氨基酸序列的融合蛋白；

(b)该人源化抗htfr抗体的轻链具有序列号8所表示的氨基酸序列，该人源化抗htfr抗体的重链在其c末端侧经由具有(gly-ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号13所表示的氨基酸序列的融合蛋白；

(c)该人源化抗htfr抗体的轻链具有序列号10所表示的氨基酸序列，该人源化抗htfr抗体的重链在其c末端侧经由具有(gly-ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号14所表示的氨基酸序列的融合蛋白。

本发明中，抗体与人溶酶体酶的融合蛋白可以通过对下述哺乳动物细胞进行培养而产生，该哺乳动物细胞按照通过表达或强表达编码该融合蛋白的基因而产生该融合蛋白的方式施加了人为的操作。此时在产生融合蛋白的哺乳动物细胞内强表达的该基因通常通过利用整合有该基因的表达载体进行转化而导入至该哺乳动物细胞中。另外，对于此时使用的哺乳动物细胞没有特别限定，优选来源于人、小鼠、中国仓鼠的细胞，特别优选来源于中国仓鼠卵巢细胞的cho细胞。本发明中，提到融合蛋白时，特别是指对这样的产生融合蛋白的哺乳动物细胞进行培养时分泌到培养基中的重组融合蛋白。

抗体与人溶酶体酶的融合蛋白也可以通过分别产生抗体和人溶酶体酶后，利用非肽接头或肽接头使它们结合而制造。此时，抗体和人溶酶体酶可以通过对下述哺乳动物细胞进行培养而以重组蛋白的形式产生，该哺乳动物细胞按照通过表达或强表达编码抗体和人溶酶体酶的基因而产生它们的方式施加了人为的操作。

用于整合编码融合蛋白、抗体或人溶酶体酶的基因而使其表达的表达载体只要在导入至哺乳动物细胞内时表达该基因，则可以没有特别限定地使用。整合到表达载体中的该基因配置在能够在哺乳动物细胞内调节基因的转录频率的dna序列(基因表达调控部位)的下游。作为本发明中能够使用的基因表达调控部位，可以列举例如来源于巨细胞病毒的启动子、sv40早期启动子、人延伸因子-1α(ef-1α)启动子、人泛素c启动子等。

导入了这样的表达载体的哺乳动物细胞可表达整合到表达载体中的所期望的蛋白质，但其表达量根据各个细胞而异，并不一致。因此，为了高效地生产重组蛋白，需要从导入了表达载体的哺乳动物细胞中选择出所期望的蛋白质的表达水平高的细胞的步骤。为了进行该选择步骤，在表达载体中整合了作为选择标志物发挥作用的基因。

作为选择标志物，最常见的为分解嘌呤霉素、新霉素等药剂的酶(药剂耐性标志物)。哺乳动物细胞在一定浓度以上的上述药剂的存在下死亡。但是，导入了表达载体的哺乳动物细胞能够利用整合到表达载体中的药剂耐性标志物将上述药剂分解，使药剂无毒化或弱毒化，因此在上述药剂存在下也能够存活。将整合有药剂耐性标志物作为选择标志物的表达载体导入至哺乳动物细胞中，在含有与该药剂耐性标志物对应的药剂的选择培养基中一边缓慢地升高该药剂的浓度一边继续培养时，可得到即使在更高浓度的药剂存在下也能够增殖的细胞。在这样选择出的细胞中，通常，整合到表达载体中的编码所期望的蛋白质的基因的表达量也与药剂耐性标志物一起增加，因此，作为结果，选择出所期望的蛋白质的表达水平高的细胞。

另外，作为选择标志物，也可以使用谷氨酰胺合成酶(gs)。谷氨酰胺合成酶是由谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶。将哺乳动物细胞在含有谷氨酰胺合成酶的抑制剂、例如蛋氨酸亚氨基代砜(msx)且不含有谷氨酰胺的选择培养基中进行培养时，细胞死亡。但是，将整合有谷氨酰胺合成酶作为选择标志物的表达载体导入至哺乳动物细胞中时，在该细胞中，谷氨酰胺合成酶的表达水平升高，因此，即使在更高浓度的msx存在下也能够增殖。此时，若一边缓慢地升高msx的浓度一边继续培养，则可得到即使在更高浓度的msx存在下也能够增殖的细胞。在这样选择出的细胞中，通常，整合到表达载体中的编码所期望的蛋白质的基因的表达量也与谷氨酰胺合成酶一起增加，因此，作为结果，选择出所期望的蛋白质的表达水平高的细胞。

另外，作为选择标志物，也可以使用二氢叶酸还原酶(dhfr)。在使用dhfr作为选择标志物的情况下，将导入了表达载体的哺乳动物细胞在含有氨甲蝶呤、氨基蝶呤等dhfr抑制剂的选择培养基中进行培养。一边缓慢地升高dhfr抑制剂的浓度一边继续培养时，可得到即使在更高浓度的dhfr抑制剂存在下也能够增殖的细胞。在这样选择出的细胞中，通常，整合到表达载体中的编码所期望的蛋白质的基因的表达量也与dhfr一起增加，因此，作为结果，选择出所期望的蛋白质的表达水平高的细胞。

已知有在编码所期望的蛋白质的基因的下游侧经由内部核糖体进入位点(ires：internalribosomeentrysite)配置有谷氨酰胺合成酶(gs)作为选择标志物的表达载体(国际专利公报wo2012/063799、wo2013/161958)。这些文献中记载的表达载体可以特别优选在本发明的制造方法中使用。

例如，作为用于表达蛋白质的表达载体的下述表达载体可以优选在本发明的制造方法中使用，该表达载体包含基因表达调控部位，在其下游包含编码该蛋白质的基因，进一步在下游包含内部核糖体进入位点，进一步在下游包含编码谷氨酰胺合成酶的基因，并且在该基因表达调控部位的下游或者与该基因表达调控部位不同的基因表达调控部位的下游进一步含有二氢叶酸还原酶基因或药剂耐性基因。在该表达载体中，作为基因表达调控部位或不同的基因表达调控部位，优选使用来源于巨细胞病毒的启动子、sv40早期启动子、人延伸因子-1α启动子(hef-1α启动子)、人泛素c启动子，特别优选为hef-1α启动子。

另外，作为内部核糖体进入位点，优选使用来源于选自由小核糖核酸病毒科的病毒、口蹄疫病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、冠状病毒、牛肠道病毒、泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒、柯萨奇b组病毒、人免疫球蛋白重链结合蛋白质基因、果蝇触角足基因、果蝇超级双胸基因组成的组中的病毒或基因的5’非翻译区域的内部核糖体进入位点，特别优选为来源于小鼠脑心肌炎病毒的5’非翻译区域的内部核糖体进入位点。在使用来源于小鼠脑心肌炎病毒的5’非翻译区域的内部核糖体进入位点的情况下，除了野生型的内部核糖体进入位点以外，也可以优选使用野生型的内部核糖体进入位点中所含的多个起始密码子中的一部分被破坏的内部核糖体进入位点。另外，在该表达载体中，优选使用的药剂耐性基因优选为嘌呤霉素或新霉素耐性基因，更优选为嘌呤霉素耐性基因。

另外，例如作为用于表达蛋白质的表达载体的下述表达载体可以优选在本发明的制造方法中使用，该表达载体包含hef-1α启动子，在其下游包含编码该蛋白质的基因，进一步在下游包含来源于小鼠脑心肌炎病毒的5’非翻译区域的内部核糖体进入位点，进一步在下游包含编码谷氨酰胺合成酶的基因，并且进一步包含不同的基因表达调控部位及其下游的二氢叶酸还原酶基因，该内部核糖体进入位点是野生型的内部核糖体进入位点中所含的多个起始密码子中的一部分被破坏的内部核糖体进入位点。作为这样的表达载体，可以列举wo2013/161958中记载的表达载体。

另外，例如，作为用于表达蛋白质的表达载体的下述表达载体可以优选在本发明的制造方法中使用，该表达载体包含hef-1α启动子，在其下游包含编码该蛋白质的基因，进一步在下游包含来源于小鼠脑心肌炎病毒的5’非翻译区域的内部核糖体进入位点，进一步在下游包含编码谷氨酰胺合成酶的基因，并且进一步包含不同的基因表达调控部位及其下游的药剂耐性基因，该内部核糖体进入位点是野生型的内部核糖体进入位点中所含的多个起始密码子中的一部分被破坏的内部核糖体进入位点。作为这样的表达载体，可以列举wo2012/063799中记载的pe-mires-gs-puro和wo2013/161958中记载的pe-mires-gs-mneo。

本发明中，为了选择融合蛋白、抗体或人溶酶体酶的表达水平高的细胞，将导入了整合有编码融合蛋白、抗体或人溶酶体酶的基因的表达载体的哺乳动物细胞在选择培养基中进行选择培养。

在选择培养中，在使用dhfr作为选择标志物的情况下，使选择培养基中含有的dhfr抑制剂的浓度阶段性地升高。在dhfr抑制剂为氨甲蝶呤的情况下，其最大浓度优选为0.25～5μm、更优选为0.5～1.5μm、进一步优选为约1.0μm。

在使用gs作为选择标志物的情况下，使选择培养基中含有的gs抑制剂的浓度阶段性地升高。在gs抑制剂为msx的情况下，其最大浓度优选为100～1000μm、更优选为200～500μm、进一步优选为约300μm。另外，此时，通常使用不含有谷氨酰胺的培养基作为选择培养基。

在使用分解嘌呤霉素的酶作为选择标志物的情况下，选择培养基中含有的嘌呤霉素的最大浓度优选为3～30μg/ml、更优选为5～20μg/ml、进一步优选为约10μg/ml。

在使用分解新霉素的酶作为选择标志物的情况下，选择培养基中含有的g418的最大浓度优选为0.1mg～2mg/ml、更优选为0.5～1.5mg/ml、进一步优选为约1mg/ml。

另外，作为用于哺乳动物细胞的培养的培养基，只要能够对哺乳动物细胞进行培养而使其增殖，则选择培养中使用的培养基、后述的用于产生融合蛋白、抗体或人溶酶体酶的培养基(重组蛋白产生用培养基)均可以没有特别限定地使用，优选使用无血清培养基。

通过选择培养选择出的融合蛋白、抗体或人溶酶体酶的表达水平高的细胞作为这些物质的产生细胞用于这些物质的生产。融合蛋白、抗体或人溶酶体酶的生产通过将这些物质的产生细胞在重组蛋白产生用培养基中进行培养而进行。将该培养称为生产培养。

本发明中，作为用作重组蛋白产生用培养基的无血清培养基，优选使用例如含有氨基酸3～700mg/l、维生素类0.001～50mg/l、单糖类0.3～10g/l、无机盐0.1～10000mg/l、微量元素0.001～0.1mg/l、核苷0.1～50mg/l、脂肪酸0.001～10mg/l、生物素0.01～1mg/l、氢化可的松0.1～20μg/l、胰岛素0.1～20mg/l、维生素b120.1～10mg/l、腐胺0.01～1mg/l、丙酮酸钠10～500mg/l和水溶性铁化合物的培养基。可以根据期望在培养基中添加胸苷、次黄嘌呤、惯用的ph指示剂和抗生素。

另外，作为用作重组蛋白产生用培养基的无血清培养基，可以使用dmem/f12培养基(dmem与f12的混合培养基)作为基本培养基，这些各培养基是本领域技术人员公知的。此外，作为无血清培养基，也可以使用包含碳酸氢钠、l-谷氨酰胺、d-葡萄糖、胰岛素、亚硒酸钠、二氨基丁烷、氢化可的松、硫酸铁(ii)、天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸和聚乙烯醇的dmem(hg)ham改良型(r5)培养基。此外，也可以使用市售的无血清培养基、例如cdopticho^tm培养基、cho-s-sfmii培养基或cdcho培养基(thermofisherscientific公司)、ex-cell^tm302培养基或ex-cell^tm325-pf培养基(safcbiosciences公司)等作为基本培养基。例如，作为含有16μmol/l胸苷、100μmol/l次黄嘌呤和4mmol/ll-丙氨酰基-l-谷氨酰胺的无血清培养基的ex-cell^tmadvancedchofed-batch培养基(safcbiosciences公司)可以优选用于融合蛋白产生细胞的培养。

融合蛋白、抗体或人溶酶体酶的产生细胞的生产培养在将这些产生细胞在重组蛋白产生用培养基中的密度调节至优选0.2×10⁵～5×10⁵个/ml、更优选1×10⁵～4×10⁵个/ml、进一步优选约2×10⁵个/ml后开始。

生产培养在经时地观察细胞的存活率(％)的同时进行，按照生产培养期间中的细胞的存活率优选维持于85％以上、更优选维持于90％以上的方式进行。

另外，生产培养期间中，培养温度优选维持于33.5～37.5℃，生产培养基中的溶解氧饱和度优选维持于38～42％、更优选维持于约40％。在此，溶解氧饱和度是指将氧的饱和溶解量设为100％时在相同条件下的氧的溶解量。

另外，生产培养期间中，生产培养基利用叶轮(impeller)进行搅拌。此时的叶轮的旋转速度优选调节为50～100转/分钟、更优选调节为60～95转/分钟、例如70转/分钟、90转/分钟等，其转速根据叶轮的形状等适当变更。

作为生产培养中的优选培养条件的初期条件，可以列举例如下述条件：生产培养开始时的产生细胞在重组蛋白产生用培养基中的密度为2×10⁵个/ml，生产培养期间中的培养温度为34～37℃，生产培养基中的溶解氧饱和度为40％，并且培养基利用以约89转/分钟的速度旋转的叶轮进行搅拌。

在生产培养结束后回收培养基，将回收的培养基离心分离或者进行膜过滤，由此能够除去细胞等而得到培养上清。该培养上清中含有的目标融合蛋白通过使用各种色谱的工序进行纯化。纯化工艺可以在室温或低温环境下进行，优选在低温环境下进行，特别优选在1～10℃的温度下进行。

以下，对培养上清中含有的抗体与人溶酶体酶的融合蛋白的纯化方法进行详述。

纯化工序的一个步骤为使用结合有对融合蛋白具有亲和性的物质的材料作为固定相的柱色谱。对此时使用的对融合蛋白具有亲和性的物质没有特别限定，优选为蛋白a、蛋白g、蛋白l、蛋白a/g、将构成融合蛋白的抗体作为抗原进行识别的抗体、构成融合蛋白的抗体作为抗原所识别的物质、或者抗人溶酶体酶抗体，更优选为蛋白a。也可以将它们组合使用。通过加载培养上清，使培养上清中含有的融合蛋白与柱结合，将柱清洗后，使融合蛋白从柱上洗脱。这样能够除去大多数的夹杂物。在构成融合蛋白的抗体为人igg的情况下，将构成融合蛋白的抗体作为抗原进行识别的抗体为抗人igg抗体。

在上述对融合蛋白具有亲和性的物质之中，蛋白a、蛋白g、蛋白l、蛋白a/g、将构成融合蛋白的抗体作为抗原进行识别的抗体也可以称为对融合蛋白具有亲和性的物质，或者也可以称为对抗体具有亲和性的物质。

蛋白a为存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁的分子量约42kd的蛋白质。蛋白a能够特异性地与igg1、igg2和igg4类的人抗体(或人源化抗体)的fc区域结合。另外，蛋白a也能够与属于vh3亚家族的igg的fab区域结合。因此，在构成应纯化的融合蛋白的一部分的抗体具有fc区域且为igg1、igg2和igg4类的人抗体(或人源化抗体)的情况下，使用蛋白a。另外，在构成应纯化的融合蛋白的一部分的抗体为属于vh3亚家族的人抗体(或人源化抗体)的fab、f(ab’)或f(ab’)2的情况下，也可以使用蛋白a。

关于在此使用的蛋白a，只要对抗体具有所期望的亲和性，则并不限定于野生型的蛋白a，也可以为使野生型的蛋白a的氨基酸序列的1～10个氨基酸发生置换、缺失、添加而得到的突变型蛋白a。此外，只要对抗体具有所期望的亲和性，也可以为包含野生型或突变型蛋白a的氨基酸序列的部分序列的肽。该部分序列包含与抗体结合的区域。

蛋白g是作为链球菌的菌体成分之一的蛋白质，特别是已知分子量为约65kd(g148蛋白g)的蛋白g和分子量为约58kd(c40蛋白g)的蛋白g。蛋白g能够特异性地与igg1、igg2、igg3和igg4类的人抗体(或人源化抗体)结合。因此，在构成应纯化的融合蛋白的一部分的抗体为不与蛋白a结合的igg3类的抗体的情况下，可以通过使用蛋白g对融合蛋白进行纯化。

关于在此使用的蛋白g，只要对抗体具有所期望的亲和性，则并不限定于野生型的蛋白g，也可以为使野生型的蛋白g的氨基酸序列的1～10个氨基酸发生置换、缺失、添加而得到的突变型蛋白g。此外，只要对抗体具有所期望的亲和性，也可以为包含野生型或突变型蛋白a的氨基酸序列的部分序列的肽。该部分序列包含与抗体结合的区域。野生型的蛋白g具有白蛋白结合区域，但在本发明中可以特别优选使用使该区域缺失的突变型蛋白g。

蛋白l是作为大消化链球菌(peptostreptococcusmagnus)的菌体成分之一的蛋白质。蛋白l能够特异性地与人抗体(或人源化抗体)的轻链的κ链之中属于κi、κiii和κiv亚类的κ链结合。因此，在构成应纯化的融合蛋白的一部分的抗体为具有属于这些亚类的轻链的抗体的情况下，即使抗体为fab或scfv，也可以使用蛋白l。

关于在此使用的蛋白l，只要对抗体具有所期望的亲和性，则并不限定于野生型的蛋白l，也可以为使野生型的蛋白l的氨基酸序列的1～10个氨基酸发生置换、缺失、添加而得到的突变型蛋白l。此外，只要对抗体具有所期望的亲和性，也可以为包含野生型或突变型蛋白l的氨基酸序列的部分序列的肽。该部分序列包含与抗体结合的区域。

蛋白a/g是使四个蛋白a的fc结合区域和两个蛋白g的fc结合区域结合而成的人造蛋白质。蛋白a/g兼具蛋白g和蛋白a这两者的性质，能够纯化可利用蛋白a进行纯化的抗体和可利用蛋白g进行纯化的抗体中的任意一种。

在构成融合蛋白的一部分的抗体为人igg的情况下，将构成融合蛋白的一部分的抗体作为抗原进行识别的抗体为特异性地结合该人igg的抗人igg抗体。该抗人igg抗体可以通过使用融合蛋白或构成其一部分的抗体作为抗原对动物进行免疫，以单克隆抗体的形式或以多克隆抗体的形式来制作。

在抗体为抗转铁蛋白受体(tfr)抗体、抗胰岛素受体抗体、抗瘦素受体抗体、抗脂蛋白受体抗体、抗igf受体抗体、抗oatp-f抗体、抗有机阴离子转运体抗体、抗mct-8抗体、抗单羧酸转运体抗体和fc受体抗体的情况下，构成融合蛋白的一部分的抗体作为抗原进行识别的物质分别为tfr、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、igf受体、oatp-f、有机阴离子转运体、mct-8和fc受体的细胞外区域。

纯化工序的另一个步骤为使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱。对此时使用的对磷酸基具有亲和性的固定相没有特别限定，优选羟基磷灰石和氟磷灰石、特别优选羟基磷灰石。加载于该柱色谱中的包含融合蛋白的溶液优选在加载前将其ph调节至6.8～7.8。

在上述纯化工序的另一个步骤中，融合蛋白结合至预先利用含有盐和磷酸的ph为中性附近的缓冲液进行了平衡化的固定相上。此时使用的缓冲液优选为mes缓冲液，其ph优选为6.8～7.8。另外，对缓冲液中含有的盐没有特别限定，优选氯化钠，其浓度优选为70～230mm、更优选为160～220mm。另外，缓冲液中含有的磷酸的浓度优选为0.2～4.0mm、更优选为1～2.5mm。

将结合有融合蛋白的柱清洗后，利用含有盐的ph为中性附近的缓冲液使融合蛋白从柱上洗脱，回收含有融合蛋白的级分。此时使用的缓冲液优选为磷酸缓冲液，其ph优选为6.8～7.8。另外，缓冲液中含有的磷酸的浓度优选为10～50mm、更优选为20～40mm。另外，对缓冲液中含有的盐没有特别限定，优选氯化钠，其浓度优选为70～230mm、更优选为160～220mm。另外，缓冲液中含有的磷酸的浓度优选为0.2～4.0mm。

作为纯化工序的又一步骤的、利用尺寸排阻柱色谱的纯化工序是用于除去内毒素等低分子的杂质、融合蛋白的多聚体、分解物等的工序，由此，能够得到实质上较纯的融合蛋白。

在融合蛋白的纯化工序中，也可以追加使有可能从培养上清中带入的病毒失活的工序。该病毒失活工序可以在纯化工序的第一步骤之前实施，可以在纯化工序的各步骤之间实施，也可以在纯化工序结束后实施。例如，在纯化工序依次进行使用结合有对融合蛋白具有亲和性的物质的材料作为固定相的柱色谱(纯化工序的第一步骤)、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱(纯化工序的第二步骤)、以及尺寸排阻柱色谱(纯化工序的第三步骤)的情况下，病毒失活工序优选在纯化工序的第一步骤之前或者纯化工序的第一步骤与第二步骤之间实施。

病毒失活工序通过在含有融合蛋白的溶液中添加非离子性表面活性剂，并在20～60℃下搅拌2～6小时来进行。作为此时使用的非离子性表面活性剂的优选例，可以列举聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和磷酸三正丁基酯、或它们的混合物。

病毒失活工序也可以使用病毒除去膜来进行。通过使含有融合蛋白的溶液在孔径为35nm、20nm的病毒除去膜中通过，能够除去溶液中含有的病毒。

使用本发明的制造方法得到的融合蛋白的纯化品是能够直接作为药物使用的纯度的纯化品。融合蛋白的纯化品中含有的来源于宿主细胞的蛋白质(hcp)的浓度优选小于300ppm、更优选小于100ppm，例如小于60ppm。另外，融合蛋白的纯化品中含有的聚合物在融合蛋白整体中所占的比率优选小于1％。

在使用本发明的制造方法得到的融合蛋白的纯化品作为药物进行供给的情况下，可以以含有适当的赋形剂的水性液剂或冷冻干燥制剂的形式供给。在制成水性液剂的情况下，可以制成填充于管形瓶中的形态，也可以以预先填充于注射器中的预填充型制剂的形式供给。在冷冻干燥制剂的情况下，在使用前溶解于水性介质中后使用。

融合蛋白的纯化品在作为药物给药于人时，作为注射剂，可以给药至例如静脉内、肌肉内、皮下、腹腔内、动脉内或病灶内，优选静脉内给药。

另外，融合蛋白的纯化品在给药于人时能够通过bbb，因此，能够用作伴有中枢神经障碍的各种疾病的治疗剂。通过给药融合蛋白，能够预防、缓解中枢神经障碍，或者能够延缓其进展。

以下，对该人源化抗htfr抗体的轻链具有序列号10所表示的氨基酸序列、该人源化抗htfr抗体的重链在其c末端侧经由具有(gly-ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号14所表示的氨基酸序列的融合蛋白(人源化抗htfr抗体-i2s)的纯化方法进行详述。需要说明的是，构成该融合蛋白的一部分的抗体为igg1类的抗体。

纯化工序的第一步骤为使用结合有对融合蛋白具有亲和性的物质的材料作为固定相的柱色谱。对此时使用的对抗体具有亲和性的物质没有特别限定，优选为蛋白a、蛋白g、蛋白l、蛋白a/g、抗人igg1抗体、作为抗体的抗原的htfr或抗人i2s抗体，更优选为蛋白a。在该物质为htfr的情况下，为其细胞外区域。

在第一步骤中，在使用蛋白a作为对融合蛋白具有亲和性的物质的情况下，使含有融合蛋白的培养上清结合至预先利用含有盐的中性附近的缓冲液进行了平衡化的柱上。此时使用的缓冲液优选为氨基丁三醇缓冲液，其ph优选为6.5～7.5、更优选为约7.0。另外，对缓冲液中含有的盐没有特别限定，优选氯化钠，其浓度优选为60～180mm、更优选为100～150mm、进一步优选为约140mm。

将结合有融合蛋白的柱清洗后，利用含有盐的酸性的缓冲液使融合蛋白洗脱，回收含有融合蛋白的级分。此时使用的缓冲液优选为甘氨酸缓冲液，其ph优选为3.2～3.8、更优选为3.5。另外，对缓冲液中含有的盐没有特别限定，优选氯化钠，其浓度优选为60～180mm、更优选为100～150mm、进一步优选为约140mm。将回收的含有融合蛋白的溶液的ph迅速调节至中性附近。

纯化工序的第二步骤为使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱色谱。对此时使用的对磷酸基具有亲和性的固定相没有特别限定，优选羟基磷灰石和氟磷灰石、特别优选羟基磷灰石。

在纯化工序的第二步骤中，在作为固定相使用羟基磷灰石作为对磷酸基具有亲和性的材料的情况下，融合蛋白结合至预先利用含有盐和磷酸的ph为中性附近的缓冲液进行了平衡化的固定相上。此时使用的缓冲液优选为mes缓冲液，其ph优选为6.8～7.8、更优选为ph7.3。另外，对缓冲液中含有的盐没有特别限定，优选氯化钠，其浓度优选为150～230mm、更优选为215mm。另外，缓冲液中含有的磷酸的浓度优选为1.0～4.0mm、更优选为2.0mm。

将结合有融合蛋白的柱清洗后，利用含有盐的ph为中性附近的缓冲液使融合蛋白从柱上洗脱，回收含有融合蛋白的级分。此时使用的缓冲液优选为磷酸缓冲液，其ph优选为6.8～7.8、更优选为ph7.3。另外，缓冲液中含有的磷酸的浓度优选为30～50mm、更优选为约35mm。另外，对缓冲液中含有的盐没有特别限定，优选氯化钠，其浓度优选为150～230mm、更优选为215mm。

纯化工序的第三步骤为尺寸排阻柱色谱。该步骤是用于除去内毒素等低分子的杂质、融合蛋白的多聚体、分解物等的步骤，由此，能够得到实质上较纯的融合蛋白。

在人源化抗htfr抗体-i2s的纯化工序中，也可以追加使有可能从培养上清中带入的病毒失活的工序。该病毒失活工序可以在纯化工序的第一步骤之前实施，可以在纯化工序的各步骤之间实施，也可以在纯化工序结束后实施，例如，在纯化工序的第一步骤之前或者纯化工序的第一步骤与第二步骤之间实施。

病毒失活工序通过在含有人源化抗htfr抗体-i2s的溶液中添加非离子性表面活性剂，并在20～60℃下搅拌2～6小时来进行。作为此时使用的非离子性表面活性剂的优选例，可以列举聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和磷酸三正丁基酯、或它们的混合物。

病毒失活工序也可以使用病毒除去膜来进行。通过使含有人源化抗htfr抗体-i2s的溶液在孔径为35nm、20nm的病毒除去膜中通过，能够除去溶液中含有的病毒。

使用本发明的制造方法得到的人源化抗htfr抗体-i2s的纯化品是能够直接作为药物使用的纯度的纯化品。人源化抗htfr抗体-i2s的纯化品中含有的来源于宿主细胞的蛋白质(hcp)的浓度小于100ppm、例如小于60ppm、小于40ppm等。另外，人源化抗htfr抗体-i2s的纯化品中含有的聚合物在人源化抗htfr抗体-i2s整体中所占的比率小于1％、例如小于0.8％、小于0.6％、小于0.5％等。

在使用本发明的制造方法得到的人源化抗htfr抗体-i2s的纯化品作为药物进行供给的情况下，可以以含有适当的赋形剂的水性液剂或冷冻干燥制剂的形式供给。在制成水性液剂的情况下，可以制成填充于管形瓶中的形态，也可以以预先填充于注射器中的预填充型制剂的形式供给。在冷冻干燥制剂的情况下，在使用前溶解于水性介质中后使用。

人源化抗htfr抗体-i2s的纯化品在作为药物给药于人时，作为注射剂，可以给药至例如静脉内、肌肉内、皮下、腹腔内、动脉内或病灶内。例如，该纯化品可以通过点滴进行静脉内给药。

另外，人源化抗htfr抗体-i2s的纯化品能够用作亨特综合征、特别是伴有中枢神经障碍的亨特综合征的治疗剂。给药于亨特综合征的患者的人源化抗htfr抗体-i2s能够分解蓄积在患者的脏器中的糖胺聚糖(gag)，进而还能够通过bbb而分解蓄积在脑组织内的gag，因此能够预防、缓解亨特综合征的中枢神经障碍，或者能够延缓其进展。

实施例

以下，参考实施例进一步详细地对本发明进行说明，但并没有将本发明限定于实施例的意图。

[实施例1]hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白表达用载体的构建

使用编码由具有序列号6所表示的氨基酸序列的轻链和具有序列号7所表示的氨基酸序列的重链构成的人源化抗htfr抗体编号1、由具有序列号8所表示的氨基酸序列的轻链和具有序列号9所表示的氨基酸序列的重链构成的人源化抗htfr抗体编号2、由具有序列号10所表示的氨基酸序列的轻链和具有序列号11所表示的氨基酸序列的重链构成的人源化抗htfr抗体编号3这三种人源化抗htfr抗体(编号1～3)的基因，构建人源化抗htfr抗体-hi2s融合蛋白表达用载体。

用kpni和ncoi消化pef/myc/nuc载体(invitrogen公司)，将包含ef-1α启动子及其第一内含子的区域切出，利用t4dna聚合酶对其进行平滑末端化处理。用bglii和ecori消化pci-neo载体(invitrogen公司)，切除包含cmv的增强子/启动子和内含子的区域后，用t4dna聚合酶进行平滑末端化处理。在其中插入上述包含ef-1α启动子及其第一内含子的区域，构建pe-neo载体。用sfii和bstxi消化pe-neo载体，切除包含新霉素耐性基因的约1kbp的区域。以pcdna3.1/hygro(+)载体(invitrogen公司)作为模板，使用引物hyg-sfi5’(序列号27)和引物hyg-bstx3’(序列号28)，通过pcr反应对潮霉素基因进行扩增。用sfii和bstxi消化扩增出的潮霉素基因，插入到上述切除了新霉素耐性基因的pe-neo载体中，构建pe-hygr载体。pe-hygr载体的构建法也公开在专利文献(日本特开2009-273427)中。

人工合成包含编码具有序列号6所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号1的轻链全长的基因的dna片段(序列号21)。在该dna片段的5’侧导入mlui序列，在3’侧导入noti序列。用mlui和noti消化该dna片段，整合到pe-neo载体的mlui-noti间。将所得到的载体作为人源化抗htfr抗体编号1的轻链表达用载体pe-hygr(lc1)。

人工合成包含编码具有序列号8所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号2的轻链全长的基因的dna片段(序列号22)。在该dna片段的5’侧导入mlui序列，在3’侧导入noti序列。用mlui和noti消化该dna片段，整合到pe-neo载体的mlui-noti间。将所得到的载体作为人源化抗htfr抗体编号2的轻链表达用载体pe-hygr(lc2)。

人工合成包含编码具有序列号10所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号3的轻链全长的基因的dna片段(序列号23)。在该dna片段的5’侧导入mlui序列，在3’侧导入noti序列。用mlui和noti消化该dna片段，整合到pe-neo载体的mlui-noti间。将所得到的载体作为人源化抗htfr抗体编号3的轻链表达用载体pe-hygr(lc3)。

人工合成具有序列号24所表示的碱基序列的dna片段，该dna片段包含编码在具有序列号7所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号1的重链的c末端侧经由具有(gly-ser)所表示的氨基酸序列的接头结合具有序列号5所表示的氨基酸序列的hi2s而得到的蛋白质的基因。该dna片段编码具有序列号12所表示的氨基酸序列、使人源化抗htfr抗体编号1的重链与hi2s结合而得到的蛋白质。用mlui和noti消化该dna片段，整合到pe-neo载体的mlui与noti之间，构建pe-neo(hc-i2s-1)。

人工合成具有序列号25所表示的碱基序列的dna片段，该dna片段包含编码在具有序列号9所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号2的重链的c末端侧经由具有(gly-ser)所表示的氨基酸序列的接头结合具有序列号5所表示的氨基酸序列的hi2s而得到的蛋白质的基因。该dna片段编码具有序列号13所表示的氨基酸序列、使人源化抗htfr抗体编号2的重链与hi2s结合而得到的蛋白质。用mlui和noti消化该dna片段，整合到pe-neo载体的mlui与noti之间，构建pe-neo(hc-i2s-2)。

人工合成具有序列号26所表示的碱基序列的dna片段，该dna片段包含编码在具有序列号11所表示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号3的重链的c末端侧经由具有(gly-ser)所表示的氨基酸序列的接头结合具有序列号5所表示的氨基酸序列的hi2s而得到的蛋白质的基因。该dna片段编码具有序列号14所表示的氨基酸序列、使人源化抗htfr抗体编号3的重链与hi2s结合而得到的蛋白质。用mlui和noti消化该dna片段，整合到pe-neo载体的mlui与noti之间，构建pe-neo(hc-i2s-3)。

[实施例2-1]hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白的高表达细胞株的制作

使用genepulser(bio-rad公司)，利用实施例1中构建的pe-hygr(lc1)与pe-neo(hc-i2s-1)的组合、实施例1中构建的pe-hygr(lc2)与pe-neo(hc-i2s-2)的组合、以及实施例1中构建的pe-hygr(lc3)与pe-neo(hc-i2s-3)的组合，通过下述方法分别对cho细胞(cho-k1，由美国典型培养物保藏中心获得)进行转化。

细胞的转化大致利用以下的方法进行。将5×10⁵个cho-k1细胞接种到添加有cdopticho^tm培养基(thermofisherscientific公司)的3.5cm培养皿中，在37℃、5％co2的条件下培养一晚。培养后，以达到5×10⁶个细胞/ml的密度的方式将细胞悬浮在opti-mem^tmi培养基(thermofisherscientific公司)中。采集100μl的细胞悬浮液，在其中添加用cdopticho^tm培养基稀释至100μg/ml的pe-hygr(lc1)和pe-neo(hc-i2s-1)质粒dna溶液各5μl。使用genepulser(bio-rad公司)实施电穿孔，在细胞中导入质粒。在37℃、5％co2的条件下培养一晚后，将细胞在添加有0.5mg/ml的潮霉素和0.8mg/ml的g418的cdopticho^tm培养基中进行选择培养。对于pe-hygr(lc2)与pe-neo(hc-i2s-2)的组合、以及pe-hygr(lc3)与pe-neo(hc-i2s-3)的组合，也利用同样的方法转化细胞。

接着，利用有限稀释法，按照每一孔接种一个以下的细胞的方式将通过选择培养选择出的细胞接种到96孔板上，培养约10天，以使各细胞形成单克隆菌落。采集形成有单克隆菌落的孔的培养上清，利用elisa法调查人源化抗体含量，选择出hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白的高表达细胞株。

此时的elisa法大致利用以下的方法实施。在96孔微量滴定板(nunc公司)的各孔中各添加100μl用0.05m碳酸氢盐缓冲液(ph9.6)将山羊抗人igg多克隆抗体溶液稀释至4μg/ml而得到的溶液，在室温下静置至少1小时，使抗体吸附到板上。接着，用在磷酸缓冲生理盐水(ph7.4)中添加有0.05％tween20的溶液(pbs-t)将各孔清洗3次后，在各孔中各添加200μlstartingblock(pbs)封闭缓冲液(thermofisherscientific公司)，将板在室温下静置30分钟。接着，将各孔用pbs-t清洗3次后，在各孔中各添加100μl用在磷酸缓冲生理盐水(ph7.4)中添加有0.5％bsa和0.05％tween20的溶液(pbs-bt)稀释至适当浓度的培养上清或人igg标准品，将板在室温下静置至少1小时。接着，将板用pbs-t清洗3次后，在各孔中各添加100μl用pbs-bt稀释的hrp标记抗人igg多克隆抗体溶液，将板在室温下静置至少1小时。用pbs-t将各孔清洗3次后，在各孔中各添加100μl含有0.4mg/ml邻苯二胺的磷酸-柠檬酸缓冲液(ph5.0)，在室温下静置8～20分钟。接着，在各孔中各添加100μl的1mol/l硫酸，使反应停止，使用96孔板酶标仪，对各孔测定490nm下的吸光度。选择出显示高测定值的孔所对应的细胞作为hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白的高表达细胞株。

将利用pe-hygr(lc1)与pe-neo(hc-i2s-1)的组合进行转化而得到的hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白的高表达细胞株作为hi2s-抗htfr抗体表达株1。将该细胞株表达的hi2s与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为i2s-抗htfr抗体1。

将利用pe-hygr(lc2)与pe-neo(hc-i2s-2)的组合进行转化而得到的hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白的高表达细胞株作为hi2s-抗htfr抗体表达株2。将该细胞株表达的hi2s与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为i2s-抗htfr抗体2。

将利用pe-hygr(lc3)与pe-neo(hc-i2s-3)的组合进行转化而得到的hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白的高表达细胞株作为hi2s-抗htfr抗体表达株3。将该细胞株表达的hi2s与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为i2s-抗htfr抗体3。

[实施例3]hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白的高表达细胞株的制作

使实施例2中得到的hi2s-抗htfr抗体表达株1～3悬浮在含有10mg/l胰岛素、40mg/ml胸苷和10％(v/v)dmso的cdopticho^tm培养基中后，分注到冻存管中，作为种子细胞在液氮中保存。

[实施例4]hi2s-抗htfr抗体表达株的培养

利用以下的方法制造i2s-抗htfr抗体。将实施例2-1中得到的hi2s-抗htfr抗体表达株3按照细胞密度为约2×10⁵个/ml的方式悬浮在含有4mml-丙氨酰基-l-谷氨酰胺、100μmol/l次黄嘌呤和16μmol/l胸苷的约200l无血清培养基(ex-cell高级cho流加培养基、sigmaaldrich公司)中。将140l该细胞悬浮液移至培养槽中。利用叶轮以89rpm的速度对培养基进行搅拌，将培养基的溶解氧饱和度保持于约40％，在34～37℃的温度范围内将细胞培养约11天。培养期间中，对细胞数、细胞的存活率、培养基的葡萄糖浓度和乳酸浓度进行监测。在培养基的葡萄糖浓度小于15mmol/l的情况下，立即向培养基中添加葡萄糖溶液，以使葡萄糖浓度为37.89mmol/l。培养结束后回收培养基。利用millistak+hcpod过滤器d0hc级(merck公司)对回收的培养基进行过滤，进一步利用millistak+hcx0hc级(merck公司)进行过滤，得到含有i2s-抗htfr抗体3的培养上清。使用pellicon^tm3cassettew/ultracelplctk膜(孔径：30kda、膜面积：1.14m²、merck公司)对该培养上清进行超滤，浓缩至液量为约十七分之一为止。接着，使用opticapxl600(0.22μm、merck公司)对该浓缩液进行过滤。将所得到的液体作为浓缩培养上清。

[实施例5]病毒的失活

在实施例4中得到的浓缩培养上清中添加磷酸三正丁基酯(tnbp)和聚山梨醇酯80，使终浓度分别为0.3％(v/v)和1％(w/v)，在室温下轻柔地搅拌4小时。该操作用于使混入到培养上清中的病毒失活。但是，只要使用不含有生物来源成分的无血清培养基来培养细胞，则几乎没有在培养上清中混入对人体有害的病毒的可能性。

[实施例6]hi2s-抗htfr抗体的纯化

将病毒失活后的浓缩培养上清添加到0.5倍体积的含有140mmnacl的20mmtris-hcl缓冲液(ph7.0)中后，利用millipak-200过滤单元(孔径：0.22μm、merck公司)进行过滤。将该过滤后的溶液以200cm/hr的恒定流速加载到用柱体积的4倍体积的含有140mmnacl的20mmtris-hcl缓冲液(ph7.0)平衡化的、作为蛋白a亲和柱的mabselectsurelx柱(柱体积：约3.2l、柱床高：约20cm、gehealthcare公司)上，使i2s-抗htfr抗体3吸附到蛋白a上。

接着，以相同流速供给柱体积的5倍体积的含有500mmnacl和450mm精氨酸的10mmtris-hcl缓冲液(ph7.0)，对柱进行清洗。接着，以相同流速供给柱体积的2.5倍体积的含有140mmnacl的20mmtris-hcl缓冲液(ph7.0)，进一步对柱进行清洗。接着，用柱体积的5倍体积的含有140mmnacl的100mm甘氨酸缓冲液(ph3.5)使吸附在蛋白a上的i2s-抗htfr抗体3洗脱。洗脱液接收到预先装有1mtris-hcl缓冲液(ph7.5)的容器中，立即进行中和。

在由上述蛋白a亲和柱得到的洗脱液中依次添加200mm磷酸缓冲液(ph7.0)、含有4mnacl和2mm磷酸缓冲液的10mmmes缓冲液(ph7.3)、以及1mtris-hcl缓冲液(ph8.0)，将洗脱液中含有的磷酸钠和nacl的浓度分别调节至2mm和215mm，并且将洗脱液的ph调节至7.3。接着，利用opticapxl600(孔径：0.22μm、merck公司)对该洗脱液进行过滤。将该过滤后的溶液以200cm/hr的恒定流速加载到用柱体积的4倍体积的含有215mmnacl和2mm磷酸钠的10mmmes缓冲液(ph7.3)平衡化的、作为羟基磷灰石柱的chtii型40μm柱(柱体积：约3.2l、柱床高：约20cm、bio-rad公司)上，使i2s-抗htfr抗体3吸附到羟基磷灰石上。

接着，以相同流速供给柱体积的5倍体积的该缓冲液，对柱进行清洗。接着，用柱体积的5倍体积的含有215mmnacl的35mm磷酸缓冲液(ph7.3)使吸附在羟基磷灰石上的i2s-抗htfr抗体3洗脱。需要说明的是，利用羟基磷灰石柱进行的纯化每次使用由蛋白a亲和柱得到的洗脱液的一半，分两次实施。

在上述由羟基磷灰石柱得到的洗脱液中添加稀盐酸，将ph调节至6.5。接着，使用pellicon^tm3cassettew/ultracelplctk膜(孔径：30kda、膜面积：1.14m²、merck公司)进行超滤，浓缩至溶液中的i2s-抗htfr抗体3的浓度为约2mg/ml为止。接着，使用opticapxl600(0.22μm、merck公司)对该浓缩液进行过滤。

将上述浓缩液以19cm/hr的恒定流速加载到用柱体积的5倍体积的含有0.8mg/mlnacl和75mg/ml蔗糖的20mm磷酸缓冲液(ph6.5)平衡化的、作为尺寸排阻柱的superdex200柱(柱体积：约12.6l、柱床高：40cm、gehealthcare公司)上，进一步以相同的流速供给该缓冲液。此时，在由尺寸排阻柱得到的洗脱液的流道中配置用于连续测定洗脱液的吸光度的吸光光度计，监测280nm的吸光度，回收在280nm下显示出吸收峰的级分作为包含i2s-抗htfr抗体3的级分，将其作为i2s-抗htfr抗体纯化品。需要说明的是，利用尺寸排阻柱进行的纯化每次使用由羟基磷灰石柱得到的洗脱液的一半，分两次实施。

[实施例7]纯化各步骤中的i2s-抗htfr抗体的回收率的测定

使用实施例2中记载的elisa法对纯化各步骤中的i2s-抗htfr抗体3的加载量和洗脱液中回收的量进行测定。将其结果示于表1。回收了30.6g的i2s-抗htfr抗体3作为纯化品，其相当于当初培养上清中含有的36.7g的i2s-抗htfr抗体3的约76.5％。这些结果表明，上述实施例中记载的纯化法作为i2s-抗htfr抗体3的纯化方法是效率非常高的。需要说明的是，表1中，工序回收率(％)是指各纯化步骤中的回收的rhi2s量相对于加载的rhi2s量的比率，总回收率(％)是指各纯化步骤中回收的rhi2s量相对于供于纯化工序的rhi2s量的初始量的比率。

[表1]

(表1)纯化各步骤中的i2s-抗htfr抗体3的回收率

[实施例8]i2s-抗htfr抗体纯化品的分析(hcp的定量)

利用elisa法对i2s-抗htfr抗体纯化品中含有的来源于宿主细胞的蛋白质(hcp)的量进行定量。首先，在96孔板(nunc公司)的各孔中添加来源于抗cho细胞的蛋白质抗体100μl，静置一晚，使抗体吸附。将各孔清洗3次后，在各孔中添加含有酪蛋白的封闭溶液200μl，在25℃下振荡60分钟。将各孔清洗3次后，在各孔中分别添加含有i2s-抗htfr抗体纯化品的溶液(样品溶液)或hcp标准溶液100μl，在25℃下振荡2小时。将各孔清洗3次后，在各孔中添加生物素化的来源于抗cho细胞的蛋白质抗体100μl，在25℃下振荡60分钟。将各孔清洗3次后，添加hrp偶联链霉抗生物素蛋白(jacksonimmunoresearchlaboratories公司)100μl，在25℃下振荡60分钟。将各孔清洗3次后，在各孔中添加tmb底物溶液100μl，在25℃下振荡使其显色。tmb底物溶液使用tmb微孔过氧化物酶底物系统(kpl公司)的tmb过氧化物酶底物与过氧化物酶底物溶液b的等量混合物。显色后，在各孔中添加1mol/l硫酸100μl，使酶反应停止，利用96孔板酶标仪测定各孔在450nm下的吸光度。由hcp标准溶液的测定值制作标准曲线，将样品溶液的值内插于标准曲线，对i2s-抗htfr抗体纯化品中含有的hcp进行定量。由这样求出的hcp的定量值和使用实施例2中记载的elisa法测定的i2s-抗htfr抗体纯化品的定量值对i2s-抗htfr抗体纯化品中含有的hcp进行定量。其结果可知，i2s-抗htfr抗体纯化品中含有的hcp的量为约35ppm(即，1mg的i2s-抗htfr抗体纯化品中有约35ng的hcp)。

[实施例9]i2s-抗htfr抗体纯化品的分析(se-hplc分析)

将tskgelultraswaggregate柱(内径7.8mm×高度30cm、东曹公司)设置到lc-20a系统、spd-20av的uv/vis检测器(岛津制作所公司)中。将柱用含有5％丙醇和20mmnacl的200mm磷酸缓冲液(ph6.5)平衡化。在该柱上以0.5ml/分钟的恒定流速加载以1mg/ml的浓度含有实施例6中得到i2s-抗htfr抗体纯化品的10μl溶液，进一步以相同的流速供给该缓冲液。将测定215nm下的吸光度而制作的洗脱曲线示于图1。所得到的曲线基本仅显示出来自于i2s-抗htfr抗体3的单个的峰。但是，确认到在主峰(图中峰a)前检测到的来自于i2s-抗htfr抗体3的聚合物的峰(图中峰b)。由峰整体的面积与峰b的面积的比率计算出聚合物在i2s-抗htfr抗体3整体中所占的比率为约0.49％。

[实施例10]i2s-抗htfr抗体纯化品的分析(总结)

以上的i2s-抗htfr抗体纯化品的分析结果表明，实施例6中得到的i2s-抗htfr抗体纯化品几乎不含有包括hcp的夹杂物；聚合物的存在比率极低。即，可以说i2s-抗htfr抗体纯化品是能够作为药物、例如作为静脉内、肌肉内、皮下、腹腔内、动脉内或病灶内给药剂直接使用的品质的纯化品。

[实施例11]hi2s-抗htfr抗体表达株的培养(其他方法)

将实施例3中得到的hi2s-抗htfr抗体表达株3的种子细胞在37℃水浴中融解。将细胞以4×10⁵个/ml的密度悬浮在含有4mml-丙氨酰基-l-谷氨酰胺、100μmol/l次黄嘌呤、16μmol/l胸苷、500μg/ml潮霉素b和10μg/ml嘌呤霉素的无血清培养基(ex-cell高级cho流加培养基、sigmaaldrich公司)中，在37℃、5％co2的条件下振荡培养3天。反复进行该培养直至细胞数增殖到至少5×10¹¹个为止。

接着，将细胞以细胞密度达到约2×10⁵个/ml的方式悬浮在含有4mml-丙氨酰基-l-谷氨酰胺、100μmol/l次黄嘌呤和16μmol/l胸苷的无血清培养基(ex-cell高级cho流加培养基、sigmaaldrich公司)中。将约1400l该细胞悬浮液移至培养槽中，利用叶轮以80rpm的速度进行搅拌，将培养基的ph保持于6.9、将溶解氧饱和度保持于约40％，将培养温度调节至34～37℃的范围，同时将细胞培养约11天。另外，从第3天到第10天每天各添加70l含有35g/l葡萄糖的ex-cell高级chofeed1。培养中每天实施采样，测定细胞数、存活率、葡萄糖浓度、乳酸浓度。从第5天至第11天测定抗htfrab-i2s表达量。在葡萄糖浓度小于15mmol/l的情况下，立即添加葡萄糖以达到37.89mmol/l的浓度。

培养结束后回收培养基。利用millistak+hcpod过滤器d0hc级(merck公司)对回收的培养基进行过滤，进一步利用millistak+hcx0hc级(merck公司)进行过滤，得到含有i2s-抗htfr抗体3的培养上清。该培养上清使用pellicon^tm3cassettew/ultracelplctk膜(孔径：30kda、膜面积：9.12m²、merck公司)对该培养上清进行超滤，浓缩至液量为约十三分之一为止。接着，使用opticapxl600(0.22μm、merck公司)对该浓缩液进行过滤。将所得到的液体作为浓缩培养上清。

[实施例12]hi2s-抗htfr抗体的纯化(其他方法)

将实施例11中得到的浓缩培养上清的1/3液量以200cm/hr的恒定流速加载到用柱体积的4倍体积的含有140mmnacl的20mmtris-hcl缓冲液(ph7.0)平衡化的、作为蛋白a亲和柱的mabselectsurelx柱(柱体积：约9.8l、柱床高：约20cm、gehealthcare公司)上，使i2s-抗htfr抗体3吸附到蛋白a上。

接着，以相同流速供给柱体积的5倍体积的含有500mmnacl和450mm精氨酸的10mmtris-hcl缓冲液(ph7.0)，对柱进行清洗。接着，以相同流速供给柱体积的2.5倍体积的含有140mmnacl的20mmtris-hcl缓冲液(ph7.0)，对柱进行清洗。接着，用柱体积的5倍体积的含有140mmnacl的100mm甘氨酸缓冲液(ph3.5)使吸附在蛋白a上的i2s-抗htfr抗体3洗脱。洗脱液接收到装有100mmmes缓冲液(ph7.0)的容器中，立即进行中和。

在由上述蛋白a亲和柱得到的洗脱液中添加聚山梨醇酯80，以使终浓度为1％(w/v)，在室温下轻柔地搅拌3小时以上。该工序用于使有可能混入到洗脱液中的病毒失活。

在上述病毒失活后的溶液中依次添加200mm磷酸缓冲液(ph7.0)、含有4mnacl和2mm磷酸缓冲液的10mmmes缓冲液(ph7.3)、以及1mtris-hcl缓冲液(ph8.8)，将洗脱液中含有的磷酸钠和nacl的浓度分别调节至2mm和215mm，并且将洗脱液的ph调节至7.3。接着，利用opticapshcxl3(0.22μm、merck公司)对该洗脱液进行过滤。将该过滤后的溶液以200cm/hr的恒定流速加载到用柱体积的4倍体积的含有215mmnacl和2mm磷酸缓冲液的10mmmes缓冲液(ph7.3)平衡化的、作为羟基磷灰石柱的chtii型40μm柱(柱体积：约19.2l、柱床高：约20cm、bio-rad公司)上，使i2s-抗htfr抗体3吸附到羟基磷灰石上。

接着，以相同流速供给柱体积的5倍体积的该缓冲液，对柱进行清洗。接着，用柱体积的5倍体积的含有215mmnacl的35mm磷酸缓冲液(ph7.3)使吸附在羟基磷灰石上的i2s-抗htfr抗体3洗脱。

在上述由羟基磷灰石柱得到的洗脱液中添加稀盐酸，将ph调节至6.5。接着，使用pellicon^tm3cassettew/ultracelplctk膜(孔径：30kda、膜面积：2.85m²、merck公司)进行超滤，浓缩至溶液中的i2s-抗htfr抗体3的浓度为约20mg/ml为止。接着，使用opticapshcxl3(0.22μm、merck公司)对该浓缩液进行过滤。

将上述浓缩液以24cm/hr以下的流速加载到预先用柱体积的5倍体积的含有0.8mg/mlnacl和75mg/ml蔗糖的20mm磷酸缓冲液(ph6.5)平衡化的、作为尺寸排阻柱的superdex200柱(柱体积：约38.5l、柱床高：40cm、gehealthcare公司)上，进一步以相同的流速供给该缓冲液。此时，在由尺寸排阻柱得到的洗脱液的流道中配置用于连续测定洗脱液的吸光度的吸光光度计，监测280nm的吸光度，回收在280nm下显示出吸收峰的级分作为包含i2s-抗htfr抗体3的级分。将回收的溶液用planova20n(尺寸：0.3m²、旭化成医疗公司)和millipak-100过滤单元(孔径：0.22μm、merck公司)进行过滤。将过滤后的溶液作为i2s-抗htfr抗体纯化品。

[实施例13]纯化各步骤(其他方法)中的i2s-抗htfr抗体的回收率的测定

利用实施例2中记载的elisa法或吸光度测定对纯化各步骤(其他方法)中的i2s-抗htfr抗体3的加载量和洗脱液中回收的量进行测定。将其结果示于表2。回收了68.8g的i2s-抗htfr抗体3作为纯化品，其相当于当初培养上清中含有的96.8g的i2s-抗htfr抗体3的约82％。这些结果表明，上述实施例12中记载的纯化法(其他方法)作为i2s-抗htfr抗体的纯化方法是效率非常高的。需要说明的是，表3中的工序回收率(％)和总回收率(％)的含义与表1中所用的含义相同。

[表2]

(表2)纯化各步骤中的i2s-抗htfr抗体3的回收率

[实施例14]利用其他方法得到的i2s-抗htfr抗体纯化品的分析(hcp的定量)

对于实施例12中得到的i2s-抗htfr抗体纯化品，利用实施例8中记载的方法进行hcp的定量。其结果可知，i2s-抗htfr抗体纯化品中含有的hcp的量为约20ppm(即，1mg的i2s-抗htfr抗体纯化品中有约20ng的hcp)。

[实施例13]利用其他方法得到的i2s-抗htfr抗体纯化品的分析(se-hplc分析)

对于实施例12中得到的i2s-抗htfr抗体纯化品，利用实施例9中记载的方法进行se-hplc分析。将其分析结果示于图2。所得到的曲线基本仅显示出来自于i2s-抗htfr抗体3的单个的峰。但是，确认到在主峰(图中峰a)前检测到的来自于i2s-抗htfr抗体3的聚合物的峰(图中峰b)。由峰整体的面积与峰b的面积的比率计算出聚合物在i2s-抗htfr抗体3整体中所占的比率为约0.37％。

[实施例10]利用其他方法得到的i2s-抗htfr抗体纯化品的分析(总结)

以上的i2s-抗htfr抗体纯化品的分析结果表明，实施例12中得到的i2s-抗htfr抗体纯化品几乎不含有包括hcp的夹杂物；聚合物的存在比率极低。即，可以说利用其他方法得到的i2s-抗htfr抗体纯化品是能够作为药物、例如作为静脉内、肌肉内、皮下、腹腔内、动脉内或病灶内给药剂直接使用的品质的纯化品。

产业上的可利用性

根据本发明，可以提供例如纯化至能够直接作为药物使用的纯度的、抗体与其他蛋白质融合而成的融合蛋白。

序列表白由文本

序列号1：接头的氨基酸序列的例1

序列号2：接头的氨基酸序列的例2

序列号3：接头的氨基酸序列的例3

序列号6：人源化抗htfr抗体编号1的轻链的氨基酸序列

序列号7：人源化抗htfr抗体编号1的重链的氨基酸序列

序列号8：人源化抗htfr抗体编号2的轻链的氨基酸序列

序列号9：人源化抗htfr抗体编号2的重链的氨基酸序列

序列号10：人源化抗htfr抗体编号3的轻链的氨基酸序列

序列号11：人源化抗htfr抗体编号3的重链的氨基酸序列

序列号12：人源化抗htfr抗体编号1的重链与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列

序列号13：人源化抗htfr抗体编号2的重链与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列

序列号14：人源化抗htfr抗体编号3的重链与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列

序列号15：人源化抗htfr抗体编号1的轻链的可变区的氨基酸序列

序列号16：人源化抗htfr抗体编号1的重链的可变区的氨基酸序列

序列号17：人源化抗htfr抗体编号2的轻链的可变区的氨基酸序列

序列号18：人源化抗htfr抗体编号2的重链的可变区的氨基酸序列

序列号19：人源化抗htfr抗体编号3的轻链的可变区的氨基酸序列

序列号20：人源化抗htfr抗体编号3的重链的可变区的氨基酸序列

序列号21：包含编码人源化抗htfr抗体编号1的轻链的碱基序列的碱基序列、合成序列

序列号22：包含编码人源化抗htfr抗体编号2的轻链的碱基序列的碱基序列、合成序列

序列号23：包含编码人源化抗htfr抗体编号3的轻链的碱基序列的碱基序列、合成序列

序列号24：编码人源化抗htfr抗体编号1的重链与hi2s的融合蛋白的碱基序列、合成序列

序列号25：编码人源化抗htfr抗体编号2的重链与hi2s的融合蛋白的碱基序列、合成序列

序列号26：编码人源化抗htfr抗体编号3的重链与hi2s的融合蛋白的碱基序列、合成序列

序列号27：引物hyg-sfi5’、合成序列

序列号28：引物hyg-bstx3’、合成序列

序列表

<110>jcr制药股份有限公司（jcrpharmaceuticalsco.,ltd.）

<120>抗体融合蛋白的制造方法（methodforproductionofantigenfusionproteins）

<130>1211jp

<160>28

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>示例接头1的氨基酸序列

<400>1

glyglyglyglyser

15

<210>2

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>示例接头2的氨基酸序列

<400>2

glyglyglyglyglyser

15

<210>3

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>示例接头3的氨基酸序列

<400>3

serglyglyglyglygly

15

<210>4

<211>760

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>4

metmetaspglnalaargseralapheserasnleupheglyglyglu

151015

proleusertyrthrargpheserleualaargglnvalaspglyasp

202530

asnserhisvalglumetlysleualavalaspgluglugluasnala

354045

aspasnasnthrlysalaasnvalthrlysprolysargcyssergly

505560

serilecystyrglythrilealavalilevalphepheleuilegly

65707580

phemetileglytyrleuglytyrcyslysglyvalgluprolysthr

859095

glucysgluargleualaglythrgluserprovalarggluglupro

100105110

glygluasppheproalaalaargargleutyrtrpaspaspleulys

115120125

arglysleuserglulysleuaspserthraspphethrglythrile

130135140

lysleuleuasngluasnsertyrvalproargglualaglysergln

145150155160

lysaspgluasnleualaleutyrvalgluasnglnphearggluphe

165170175

lysleuserlysvaltrpargaspglnhisphevallysileglnval

180185190

lysaspseralaglnasnservalileilevalasplysasnglyarg

195200205

leuvaltyrleuvalgluasnproglyglytyrvalalatyrserlys

210215220

alaalathrvalthrglylysleuvalhisalaasnpheglythrlys

225230235240

lysaspphegluaspleutyrthrprovalasnglyserilevalile

245250255

valargalaglylysilethrphealaglulysvalalaasnalaglu

260265270

serleuasnalaileglyvalleuiletyrmetaspglnthrlysphe

275280285

proilevalasnalagluleuserphepheglyhisalahisleugly

290295300

thrglyaspprotyrthrproglypheproserpheasnhisthrgln

305310315320

pheproproserargserserglyleuproasnileprovalglnthr

325330335

ileserargalaalaalaglulysleupheglyasnmetgluglyasp

340345350

cysproserasptrplysthraspserthrcysargmetvalthrser

355360365

gluserlysasnvallysleuthrvalserasnvalleulysgluile

370375380

lysileleuasnilepheglyvalilelysglyphevalgluproasp

385390395400

histyrvalvalvalglyalaglnargaspalatrpglyproglyala

405410415

alalysserglyvalglythralaleuleuleulysleualaglnmet

420425430

pheseraspmetvalleulysaspglypheglnproserargserile

435440445

ilephealasertrpseralaglyasppheglyservalglyalathr

450455460

glutrpleugluglytyrleuserserleuhisleulysalaphethr

465470475480

tyrileasnleuasplysalavalleuglythrserasnphelysval

485490495

seralaserproleuleutyrthrleuileglulysthrmetglnasn

500505510

vallyshisprovalthrglyglnpheleutyrglnaspserasntrp

515520525

alaserlysvalglulysleuthrleuaspasnalaalapheprophe

530535540

leualatyrserglyileproalavalserphecysphecysgluasp

545550555560

thrasptyrprotyrleuglythrthrmetaspthrtyrlysgluleu

565570575

ilegluargileprogluleuasnlysvalalaargalaalaalaglu

580585590

valalaglyglnphevalilelysleuthrhisaspvalgluleuasn

595600605

leuasptyrgluargtyrasnserglnleuleuserphevalargasp

610615620

leuasnglntyrargalaaspilelysglumetglyleuserleugln

625630635640

trpleutyrseralaargglyaspphepheargalathrserargleu

645650655

thrthrasppheglyasnalaglulysthraspargphevalmetlys

660665670

lysleuasnaspargvalmetargvalglutyrhispheleuserpro

675680685

tyrvalserprolysgluserprophearghisvalphetrpglyser

690695700

glyserhisthrleuproalaleuleugluasnleulysleuarglys

705710715720

glnasnasnglyalapheasngluthrleupheargasnglnleuala

725730735

leualathrtrpthrileglnglyalaalaasnalaleuserglyasp

740745750

valtrpaspileaspasngluphe

755760

<210>5

<211>525

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>5

sergluthrglnalaasnserthrthraspalaleuasnvalleuleu

151015

ileilevalaspaspleuargproserleuglycystyrglyasplys

202530

leuvalargserproasnileaspglnleualaserhisserleuleu

354045

pheglnasnalaphealaglnglnalavalcysalaproserargval

505560

serpheleuthrglyargargproaspthrthrargleutyraspphe

65707580

asnsertyrtrpargvalhisalaglyasnpheserthrileprogln

859095

tyrphelysgluasnglytyrvalthrmetservalglylysvalphe

100105110

hisproglyileserserasnhisthraspaspserprotyrsertrp

115120125

serpheproprotyrhisproserserglulystyrgluasnthrlys

130135140

thrcysargglyproaspglygluleuhisalaasnleuleucyspro

145150155160

valaspvalleuaspvalprogluglythrleuproasplysglnser

165170175

thrgluglnalaileglnleuleuglulysmetlysthrseralaser

180185190

prophepheleualavalglytyrhislysprohisileprophearg

195200205

tyrprolysglupheglnlysleutyrproleugluasnilethrleu

210215220

alaproaspprogluvalproaspglyleuproprovalalatyrasn

225230235240

protrpmetaspileargglnarggluaspvalglnalaleuasnile

245250255

servalprotyrglyproileprovalasppheglnarglysilearg

260265270

glnsertyrphealaservalsertyrleuaspthrglnvalglyarg

275280285

leuleuseralaleuaspaspleuglnleualaasnserthrileile

290295300

alaphethrserasphisglytrpalaleuglygluhisglyglutrp

305310315320

alalystyrserasnpheaspvalalathrhisvalproleuilephe

325330335

tyrvalproglyargthralaserleuproglualaglyglulysleu

340345350

pheprotyrleuasppropheaspseralaserglnleumetglupro

355360365

glyargglnsermetaspleuvalgluleuvalserleupheprothr

370375380

leualaglyleualaglyleuglnvalproproargcysprovalpro

385390395400

serphehisvalgluleucysarggluglylysasnleuleulyshis

405410415

pheargpheargaspleuglugluaspprotyrleuproglyasnpro

420425430

arggluleuilealatyrserglntyrproargproseraspilepro

435440445

glntrpasnserasplysproserleulysaspilelysilemetgly

450455460

tyrserileargthrileasptyrargtyrthrvaltrpvalglyphe

465470475480

asnproaspglupheleualaasnpheseraspilehisalaglyglu

485490495

leutyrphevalaspseraspproleuglnasphisasnmettyrasn

500505510

aspserglnglyglyaspleupheglnleuleumetpro

515520525

<210>6

<211>214

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号1的轻链的氨基酸序列

<400>6

aspileglnvalthrglnserproserpheleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcyslysalaserglnaspvalasnserala

202530

valalatrppheglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile

354045

tyrtrpthrserthrarghisthrglyvalproaspargphesergly

505560

serglyserglythrvaltyrthrleuthrileserserleuglnpro

65707580

gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnhistyrserthrproarg

859095

thrpheglyglyglythrlysvalgluilelysargthrvalalaala

100105110

proservalpheilepheproproseraspgluglnleulyssergly

115120125

thralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarggluala

130135140

lysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnsergln

145150155160

gluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuser

165170175

serthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyr

180185190

alacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysser

195200205

pheasnargglyglucys

210

<210>7

<211>446

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号1的重链的氨基酸序列

<400>7

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyleuthrpheserasntyr

202530

glymetsertrpvalargglnalaproglylysglyleugluleuval

354045

alaasnileasnthrasnglyglyserthrtyrtyrproaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

thrasnasnargtyraspgluasptyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleuala

115120125

proserserlysserthrserglyglythralaalaleuglycysleu

130135140

vallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnsergly

145150155160

alaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserser

165170175

glyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserserleu

180185190

glythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthr

195200205

lysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthrhisthr

210215220

cysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproservalphe

225230235240

leupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrpro

245250255

gluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluval

260265270

lyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthr

275280285

lysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalserval

290295300

leuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscys

305310315320

lysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrileser

325330335

lysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleupropro

340345350

serargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuval

355360365

lysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasngly

370375380

glnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspserasp

385390395400

glyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrp

405410415

glnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhis

420425430

asnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

435440445

<210>8

<211>214

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号2的轻链的氨基酸序列

<400>8

gluilevalleuthrglnserproasppheglnservalthrprolys

151015

glulysvalthrilethrcysargalaserglnserileserasnasn

202530

leuglntrptyrglnglnlysproaspglnserprolysleuleuile

354045

lystyralaserglnserileserglyileproserargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrileasnserleugluala

65707580

gluaspalaalathrtyrleucysglnglnserasnsertrpproarg

859095

thrpheglyglnglythrlysvalgluilelysargthrvalalaala

100105110

proservalpheilepheproproseraspgluglnleulyssergly

115120125

thralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarggluala

130135140

lysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnsergln

145150155160

gluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuser

165170175

serthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyr

180185190

alacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysser

195200205

pheasnargglyglucys

210

<210>9

<211>453

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号2的重链的氨基酸序列

<400>9

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

valmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile

354045

glyvalileserthrtyrtyrglyhisglysertyrasnglnargphe

505560

lysglyargalathrmetthrvalasplysserileserthralatyr

65707580

metgluleuvalargleuargseraspaspthralavaltyrtyrcys

859095

valargglyglytyrglyserserserleualaglyasnpheaspval

100105110

trpglyglnglythrthrvalthrvalserseralaserthrlysgly

115120125

proservalpheproleualaproserserlysserthrserglygly

130135140

thralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluproval

145150155160

thrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrphe

165170175

proalavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalval

180185190

thrvalproserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnval

195200205

asnhislysproserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolys

210215220

sercysasplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleu

225230235240

leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr

245250255

leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

260265270

serhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyval

275280285

gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnser

290295300

thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu

305310315320

asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproala

325330335

proileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro

340345350

glnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasngln

355360365

valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala

370375380

valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr

385390395400

proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleu

405410415

thrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysser

420425430

valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser

435440445

leuserproglylys

450

<210>10

<211>219

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号3的轻链的氨基酸序列

<400>10

aspilevalmetthrglnthrproleuserleuservalthrprogly

151015

glnproalaserilesercysargserserglnserleuvalhisser

202530

asnglyasnthrtyrleuhistrptyrleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrlysvalserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysserglnser

859095

thrhisvalprotrpthrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

100105110

argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu

115120125

glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe

130135140

tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln

145150155160

serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser

165170175

thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu

180185190

lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser

195200205

provalthrlysserpheasnargglyglucys

210215

<210>11

<211>448

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号3的重链的氨基酸序列

<400>11

gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyglu

151015

serleulysilesercyslysglyserglytyrserphethrasntyr

202530

trpleuglytrpvalargglnmetproglylysglyleuglutrpmet

354045

glyaspiletyrproglyglyasptyrprothrtyrserglulysphe

505560

lysvalglnvalthrileseralaasplysserileserthralatyr

65707580

leuglntrpserserleulysalaseraspthralamettyrtyrcys

859095

alaargserglyasntyraspgluvalalatyrtrpglyglnglythr

100105110

leuvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro

115120125

leualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleugly

130135140

cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn

145150155160

serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln

165170175

serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser

180185190

serleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproser

195200205

asnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthr

210215220

histhrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproser

225230235240

valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg

245250255

thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro

260265270

gluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala

275280285

lysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalval

290295300

servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr

305310315320

lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr

325330335

ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu

340345350

proproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcys

355360365

leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser

370375380

asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp

385390395400

seraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysser

405410415

argtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisgluala

420425430

leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

435440445

<210>12

<211>973

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号1的重链与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列

<400>12

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyleuthrpheserasntyr

202530

glymetsertrpvalargglnalaproglylysglyleugluleuval

354045

alaasnileasnthrasnglyglyserthrtyrtyrproaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

thrasnasnargtyraspgluasptyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleuala

115120125

proserserlysserthrserglyglythralaalaleuglycysleu

130135140

vallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnsergly

145150155160

alaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserser

165170175

glyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserserleu

180185190

glythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthr

195200205

lysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthrhisthr

210215220

cysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproservalphe

225230235240

leupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrpro

245250255

gluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluval

260265270

lyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthr

275280285

lysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalserval

290295300

leuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscys

305310315320

lysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrileser

325330335

lysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleupropro

340345350

serargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuval

355360365

lysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasngly

370375380

glnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspserasp

385390395400

glyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrp

405410415

glnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhis

420425430

asnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylysglyser

435440445

sergluthrglnalaasnserthrthraspalaleuasnvalleuleu

450455460

ileilevalaspaspleuargproserleuglycystyrglyasplys

465470475480

leuvalargserproasnileaspglnleualaserhisserleuleu

485490495

pheglnasnalaphealaglnglnalavalcysalaproserargval

500505510

serpheleuthrglyargargproaspthrthrargleutyraspphe

515520525

asnsertyrtrpargvalhisalaglyasnpheserthrileprogln

530535540

tyrphelysgluasnglytyrvalthrmetservalglylysvalphe

545550555560

hisproglyileserserasnhisthraspaspserprotyrsertrp

565570575

serpheproprotyrhisproserserglulystyrgluasnthrlys

580585590

thrcysargglyproaspglygluleuhisalaasnleuleucyspro

595600605

valaspvalleuaspvalprogluglythrleuproasplysglnser

610615620

thrgluglnalaileglnleuleuglulysmetlysthrseralaser

625630635640

prophepheleualavalglytyrhislysprohisileprophearg

645650655

tyrprolysglupheglnlysleutyrproleugluasnilethrleu

660665670

alaproaspprogluvalproaspglyleuproprovalalatyrasn

675680685

protrpmetaspileargglnarggluaspvalglnalaleuasnile

690695700

servalprotyrglyproileprovalasppheglnarglysilearg

705710715720

glnsertyrphealaservalsertyrleuaspthrglnvalglyarg

725730735

leuleuseralaleuaspaspleuglnleualaasnserthrileile

740745750

alaphethrserasphisglytrpalaleuglygluhisglyglutrp

755760765

alalystyrserasnpheaspvalalathrhisvalproleuilephe

770775780

tyrvalproglyargthralaserleuproglualaglyglulysleu

785790795800

pheprotyrleuasppropheaspseralaserglnleumetglupro

805810815

glyargglnsermetaspleuvalgluleuvalserleupheprothr

820825830

leualaglyleualaglyleuglnvalproproargcysprovalpro

835840845

serphehisvalgluleucysarggluglylysasnleuleulyshis

850855860

pheargpheargaspleuglugluaspprotyrleuproglyasnpro

865870875880

arggluleuilealatyrserglntyrproargproseraspilepro

885890895

glntrpasnserasplysproserleulysaspilelysilemetgly

900905910

tyrserileargthrileasptyrargtyrthrvaltrpvalglyphe

915920925

asnproaspglupheleualaasnpheseraspilehisalaglyglu

930935940

leutyrphevalaspseraspproleuglnasphisasnmettyrasn

945950955960

aspserglnglyglyaspleupheglnleuleumetpro

965970

<210>13

<211>980

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号2的重链与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列

<400>13

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

valmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile

354045

glyvalileserthrtyrtyrglyhisglysertyrasnglnargphe

505560

lysglyargalathrmetthrvalasplysserileserthralatyr

65707580

metgluleuvalargleuargseraspaspthralavaltyrtyrcys

859095

valargglyglytyrglyserserserleualaglyasnpheaspval

100105110

trpglyglnglythrthrvalthrvalserseralaserthrlysgly

115120125

proservalpheproleualaproserserlysserthrserglygly

130135140

thralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluproval

145150155160

thrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrphe

165170175

proalavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalval

180185190

thrvalproserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnval

195200205

asnhislysproserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolys

210215220

sercysasplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleu

225230235240

leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr

245250255

leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

260265270

serhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyval

275280285

gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnser

290295300

thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu

305310315320

asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproala

325330335

proileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro

340345350

glnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasngln

355360365

valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala

370375380

valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr

385390395400

proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleu

405410415

thrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysser

420425430

valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser

435440445

leuserproglylysglysersergluthrglnalaasnserthrthr

450455460

aspalaleuasnvalleuleuileilevalaspaspleuargproser

465470475480

leuglycystyrglyasplysleuvalargserproasnileaspgln

485490495

leualaserhisserleuleupheglnasnalaphealaglnglnala

500505510

valcysalaproserargvalserpheleuthrglyargargproasp

515520525

thrthrargleutyrasppheasnsertyrtrpargvalhisalagly

530535540

asnpheserthrileproglntyrphelysgluasnglytyrvalthr

545550555560

metservalglylysvalphehisproglyileserserasnhisthr

565570575

aspaspserprotyrsertrpserpheproprotyrhisproserser

580585590

glulystyrgluasnthrlysthrcysargglyproaspglygluleu

595600605

hisalaasnleuleucysprovalaspvalleuaspvalproglugly

610615620

thrleuproasplysglnserthrgluglnalaileglnleuleuglu

625630635640

lysmetlysthrseralaserprophepheleualavalglytyrhis

645650655

lysprohisilepropheargtyrprolysglupheglnlysleutyr

660665670

proleugluasnilethrleualaproaspprogluvalproaspgly

675680685

leuproprovalalatyrasnprotrpmetaspileargglnargglu

690695700

aspvalglnalaleuasnileservalprotyrglyproileproval

705710715720

asppheglnarglysileargglnsertyrphealaservalsertyr

725730735

leuaspthrglnvalglyargleuleuseralaleuaspaspleugln

740745750

leualaasnserthrileilealaphethrserasphisglytrpala

755760765

leuglygluhisglyglutrpalalystyrserasnpheaspvalala

770775780

thrhisvalproleuilephetyrvalproglyargthralaserleu

785790795800

proglualaglyglulysleupheprotyrleuasppropheaspser

805810815

alaserglnleumetgluproglyargglnsermetaspleuvalglu

820825830

leuvalserleupheprothrleualaglyleualaglyleuglnval

835840845

proproargcysprovalproserphehisvalgluleucysargglu

850855860

glylysasnleuleulyshispheargpheargaspleuglugluasp

865870875880

protyrleuproglyasnproarggluleuilealatyrserglntyr

885890895

proargproseraspileproglntrpasnserasplysproserleu

900905910

lysaspilelysilemetglytyrserileargthrileasptyrarg

915920925

tyrthrvaltrpvalglypheasnproaspglupheleualaasnphe

930935940

seraspilehisalaglygluleutyrphevalaspseraspproleu

945950955960

glnasphisasnmettyrasnaspserglnglyglyaspleuphegln

965970975

leuleumetpro

980

<210>14

<211>975

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号3的重链与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列

<400>14

gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyglu

151015

serleulysilesercyslysglyserglytyrserphethrasntyr

202530

trpleuglytrpvalargglnmetproglylysglyleuglutrpmet

354045

glyaspiletyrproglyglyasptyrprothrtyrserglulysphe

505560

lysvalglnvalthrileseralaasplysserileserthralatyr

65707580

leuglntrpserserleulysalaseraspthralamettyrtyrcys

859095

alaargserglyasntyraspgluvalalatyrtrpglyglnglythr

100105110

leuvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro

115120125

leualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleugly

130135140

cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn

145150155160

serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln

165170175

serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser

180185190

serleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproser

195200205

asnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthr

210215220

histhrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproser

225230235240

valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg

245250255

thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro

260265270

gluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala

275280285

lysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalval

290295300

servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr

305310315320

lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr

325330335

ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu

340345350

proproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcys

355360365

leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser

370375380

asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp

385390395400

seraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysser

405410415

argtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisgluala

420425430

leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

435440445

glysersergluthrglnalaasnserthrthraspalaleuasnval

450455460

leuleuileilevalaspaspleuargproserleuglycystyrgly

465470475480

asplysleuvalargserproasnileaspglnleualaserhisser

485490495

leuleupheglnasnalaphealaglnglnalavalcysalaproser

500505510

argvalserpheleuthrglyargargproaspthrthrargleutyr

515520525

asppheasnsertyrtrpargvalhisalaglyasnpheserthrile

530535540

proglntyrphelysgluasnglytyrvalthrmetservalglylys

545550555560

valphehisproglyileserserasnhisthraspaspserprotyr

565570575

sertrpserpheproprotyrhisproserserglulystyrgluasn

580585590

thrlysthrcysargglyproaspglygluleuhisalaasnleuleu

595600605

cysprovalaspvalleuaspvalprogluglythrleuproasplys

610615620

glnserthrgluglnalaileglnleuleuglulysmetlysthrser

625630635640

alaserprophepheleualavalglytyrhislysprohisilepro

645650655

pheargtyrprolysglupheglnlysleutyrproleugluasnile

660665670

thrleualaproaspprogluvalproaspglyleuproprovalala

675680685

tyrasnprotrpmetaspileargglnarggluaspvalglnalaleu

690695700

asnileservalprotyrglyproileprovalasppheglnarglys

705710715720

ileargglnsertyrphealaservalsertyrleuaspthrglnval

725730735

glyargleuleuseralaleuaspaspleuglnleualaasnserthr

740745750

ileilealaphethrserasphisglytrpalaleuglygluhisgly

755760765

glutrpalalystyrserasnpheaspvalalathrhisvalproleu

770775780

ilephetyrvalproglyargthralaserleuproglualaglyglu

785790795800

lysleupheprotyrleuasppropheaspseralaserglnleumet

805810815

gluproglyargglnsermetaspleuvalgluleuvalserleuphe

820825830

prothrleualaglyleualaglyleuglnvalproproargcyspro

835840845

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850855860

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865870875880

asnproarggluleuilealatyrserglntyrproargproserasp

885890895

ileproglntrpasnserasplysproserleulysaspilelysile

900905910

metglytyrserileargthrileasptyrargtyrthrvaltrpval

915920925

glypheasnproaspglupheleualaasnpheseraspilehisala

930935940

glygluleutyrphevalaspseraspproleuglnasphisasnmet

945950955960

tyrasnaspserglnglyglyaspleupheglnleuleumetpro

965970975

<210>15

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号1的轻链的可变区的氨基酸序列

<400>15

aspileglnvalthrglnserproserpheleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcyslysalaserglnaspvalasnserala

202530

valalatrppheglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile

354045

tyrtrpthrserthrarghisthrglyvalproaspargphesergly

505560

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65707580

gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnhistyrserthrproarg

859095

thrpheglyglyglythrlysvalgluilelys

100105

<210>16

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号1的重链的可变区的氨基酸序列

<400>16

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyleuthrpheserasntyr

202530

glymetsertrpvalargglnalaproglylysglyleugluleuval

354045

alaasnileasnthrasnglyglyserthrtyrtyrproaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

thrasnasnargtyraspgluasptyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>17

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号2的轻链的可变区的氨基酸序列

<400>17

gluilevalleuthrglnserproasppheglnservalthrprolys

151015

glulysvalthrilethrcysargalaserglnserileserasnasn

202530

leuglntrptyrglnglnlysproaspglnserprolysleuleuile

354045

lystyralaserglnserileserglyileproserargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrileasnserleugluala

65707580

gluaspalaalathrtyrleucysglnglnserasnsertrpproarg

859095

thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

100105

<210>18

<211>120

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号2的重链的可变区的氨基酸序列

<400>18

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

valmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile

354045

glyvalileserthrtyrtyrglyhisglysertyrasnglnargphe

505560

lysglyargalathrmetthrvalasplysserileserthralatyr

65707580

metgluleuvalargleuargseraspaspthralavaltyrtyrcys

859095

valargglyglytyrglyserserserleualaglyasnpheaspval

100105110

trpglyglnglythrthrvalthr

115120

<210>19

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号3的轻链的可变区的氨基酸序列

<400>19

aspilevalmetthrglnthrproleuserleuservalthrprogly

151015

glnproalaserilesercysargserserglnserleuvalhisser

202530

asnglyasnthrtyrleuhistrptyrleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrlysvalserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysserglnser

859095

thrhisvalprotrpthrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

100105110

<210>20

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗htfr抗体编号3的重链的可变区的氨基酸序列

<400>20

gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyglu

151015

serleulysilesercyslysglyserglytyrserphethrasntyr

202530

trpleuglytrpvalargglnmetproglylysglyleuglutrpmet

354045

glyaspiletyrproglyglyasptyrprothrtyrserglulysphe

505560

lysvalglnvalthrileseralaasplysserileserthralatyr

65707580

leuglntrpserserleulysalaseraspthralamettyrtyrcys

859095

alaargserglyasntyraspgluvalalatyrtrpglyglnglythr

100105110

leuvalthrvalserser

115

<210>21

<211>725

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>编码人源化抗htfr抗体编号1的轻链的氨基酸序列的碱基序列,合成序列

<400>21

acgcgtgccgccaccatgggctggagctggattctgctgttcctcctgagcgtgacagca60

ggagtgcacagcgacatccaggtcacacagtcaccaagttttctgagcgcaagcgtgggc120

gacagggtcactatcacatgcaaggcaagccaggacgtgaactccgcagtggcctggttc180

cagcagaagccagggaaagcacccaagctgctgatctattggacctctacaaggcacacc240

ggtgtcccagatcggttctcaggttccggcagcggaacagtgtatactctgaccatttcc300

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