发明领域
本发明属于可通过遗传操作获得的微生物领域。具体地，本发明涉及新的乳酸细菌菌株，其属于乳酸乳球菌(lactococcuslactis)物种，特征在于较高的产生2,3-丁二醇和乙偶姻的能力，这些分子在化学、制药和生物燃料工业中具有广泛的应用。
背景技术：
2,3-丁二醇(2,3-bdo)是一种在燃料和化学品领域中显示巨大潜力的化学品，包括用作制备各种不同化学品中的结构单元。其可以用作溶剂、抗冻剂、液体燃料和用于制备许多合成聚合物和树脂的单体。其具有27,200jg-1的热值，类似于乙醇(29,100jg-1)和甲醇(22,100jg-1)，这使得其适合作为液体燃料和燃料添加剂。此外，由于其较高的辛烷值，其可用作汽油的辛烷促进剂。2,3-bdo在印刷用油墨、香料、熏蒸剂、斯潘德克斯弹性纤维(spandex)、润湿剂和软化剂、增塑剂以及作为药物载体的制造中也具有另外的潜在应用。
特别相关的是使用2,3-bdo作为结构单元，即作为前体用于合成有价值的工业化学品，包括乙偶姻和二乙酰、甲基乙基酮、2-丁醇、丁烯、1,3-丁二烯和塑料(聚酯、聚碳酸酯和聚氨酯)。其中，1,3-丁二烯值得特别关注，这是因为其为用于合成合成橡胶，主要是用于制造轮胎的单体。另外，上述衍生物中的一些可以通过寡聚化、缩合和氢化反应的方式转换成具有用作包括喷气燃料在内的(生物)燃料的潜能的高级烃。
商业上，2,3-bdo的关键下游产品具有每年约3200万吨，销售额估价为约$430亿的潜在全球市场。
当前，2,3-bdo的工业制造主要是通过复杂和昂贵的工艺的方式从石化原料制得。在炼油期间，在从裂解气体去除丁二烯和异丁烯后，获得了c4烃级分，称为c4萃余液ii，其包含约77％的丁烯以及23％的丁烷和异丁烷的混合物。通过利用于水中的氯的溶液对该级分的氯醇化和随后的利用氢氧化钠对氯乙醇的环化，获得了以下组分的丁烯氧化物混合物：55％的反式-2,3-丁烯氧化物、30％的顺式-2,3-丁烯氧化物和15％的1,2-丁烯氧化物。于160-220℃，在50巴(bar)压力下，该混合物的水解产生丁二醇混合物，其通过真空分馏进行分离。通过该反应顺序，从反式-2-丁烯经反式-2,3-丁烯氧化物获得了meso-2,3-丁二醇；类似地从顺式-2-丁烯经顺式-2,3-丁烯氧化物形成了r,r-2,3-丁二醇和s,s-2,3-丁二醇的外消旋混合物。
由于昂贵的化学合成，2,3-bdo目前是一个没有吸引力的细分市场。原材料价格和使用合成2,3-bdo的环境影响是全球2,3-bdo市场增长的主要障碍。由于这些担忧，趋势正转向寻找更为环境友好和更具成本竞争力的替代选择，并且其中2,3-bdo的生物生产显得地位突出(http://www.transparencymarketresearch.com；丁二醇(1,4bdo&2,3bdo)、1,3丁二烯和mek市场：应用(thf、pu、pbt、sbr、abs、nbr等)，基于生物的替代选择，下游潜力，市场大小和预报，2010–2018)。
已知许多微生物能够产生2,3-bdo，但它们中的仅少数能够以可能被认为是工业相关的足够高的量产生2,3-bdo。最佳的生产者是属于克雷伯氏菌属(klebsiella)、肠杆菌属(enterobacter)、芽孢杆菌属(bacillus)和沙雷氏菌属(serratia)的细菌，特别是肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)和产酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)。
参与2,3-bdo的生物合成的代谢途径始于糖代谢产生的丙酮酸，并且包括三个步骤。在第一步中，硫胺素依赖性的酶-α-乙酰乳酸合成酶催化两分子的丙酮酸缩合，产生α-乙酰乳酸分子并释放co2分子。然后通过由α-乙酰乳酸脱羧酶催化的脱羧反应将α-乙酰乳酸转化为乙偶姻。最后，使用nadh作为辅因子，通过乙偶姻还原酶/2,3-bdo脱氢酶将乙偶姻还原为2,3-bdo。
关于通过发酵进行的2,3-bdo的工业规模生产，最佳生产者肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌是致病菌(二级危险群-rg2)的这一事实引起了强烈的担忧。工业规模的发酵工艺要求遵循严格的安全措施，这暗示使用rg2微生物是所述发酵工艺的工业发展的一个障碍。当发酵体积大于10l时，使用rg2微生物，必须采用合适的生物安全措施，包括生物安全水平第2等级大规模(bsl2-ls)安全壳(containment)设施设计和专门的操作规程。所有这些生物安全措施显著增加了生产成本，仅考虑安全壳水平的每增量的发酵罐基础成本，估计成本增加了10％-30％。
因此，需要能够与上述的rg2细菌一样有效地产生2,3-bdo的rg1微生物(安全的)。已报导有几种rg1细菌能够产生2,3-bdo，但通常，对于经济工艺来说其效率非常低。一些重要的例外为细菌多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)(
作为替代，在以下菌中改造了2,3-bdo的产生：细菌大肠杆菌(escherichiacoli)(nielsen,d.r.等人,"metabolicengineeringofacetoinandmeso-2,3-butanediolbiosynthesisine.coli.",biotechnol.j.2010,第5卷,pp.274-284)，和酵母菌酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)(lian,j.等人,“metabolicengineeringofasaccharomycescerevisiaestraincapableofsimultaneouslyutilizingglucoseandgalactosetoproduceenantiopure(2r,3r)-butanediol”metabolicengineering2014,第23卷,pp.92-99)。另一种考虑的可能性为使用rg1天然生产者，提高其2,3-bdo合成能力。在该最后的替代选择中，乳酸细菌乳酸乳球菌似乎是可能的候选物。
乳酸乳球菌显示出可用于工业工艺中的几个有利特征：它具有尺寸较小的、良好表征的基因组，已经针对几种菌株对基因组进行了测序；对其遗传操作有各种各样的工具可供选择；其在需氧或厌氧条件下显示快速增长；其显示出较高的糖酵解通量；其具有相当简单的能量和碳代谢；其对于产生感兴趣的化学品有不同的代谢途径；其不是病原体，且其被认为是一种gras(通常认为是安全的)有机体，这允许将其用于食品应用。除了具有其自身特征的食品用途外，所有这些特征使得乳酸乳球菌成为高度合适的宿主，用于开发旨在通过发酵用于有价值的化学品的有效的工业生产的细胞工厂。
乳酸乳球菌是一种兼性厌氧菌，其特征在于产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要产物(纯乳酸发酵)。然而，在某些条件下，该细菌还可以进行异型乳酸或混合酸发酵，产生不同的代谢物谱，包括2,3-bdo。然而，尽管乳酸乳球菌含有2,3-bdo生物合成的完整代谢途径，但该代谢物的天然产生通常是残留的。
有一些报导描述了使用代谢工程以增加以下菌中的2,3-bdo的产生：乳酸乳球菌(platteeuwc等人,"metabolicengineeringoflactococcuslactis—influenceoftheoverproductionofalpha-acetolactatesynthaseinstrainsdeficientinlactate-dehydrogenaseasafunctionofcultureconditions",appl.environ.microbiol.1995,第61卷,pp.3967–71；gasparp等人,"highyieldsof2,3-butanediolandmannitolinlactococcuslactisthroughengineeringofnad(+)cofactorrecycling",appl.environ.microbiol.2011,第77卷,pp.6826–35；liuj等人,“combiningmetabolicengineeringandbiocompatiblechemistryforhigh-yieldproductionofhomo-diacetylandhomo-(s,s)-2,3-butanediol”,metabolicengineering2016,第36卷,pp.57–67)，和其他乳酸菌(enhancedpyruvateto2,3-butanediolconversioninlacticacidbacteria,pct/us2009/058834)。一方面，它们均基于竞争性途径的失活，特别是l-乳酸脱氢酶，且另一方面，它们均基于2,3-bdo途径的基因的过表达。
通过这些重组菌株生产2,3-bdo要求其在包含维持引入其中的外来遗传物质的抗生素，和/或诱导增加的基因表达的化合物如乳链菌肽或维持生长的氯高铁血红素和fe3+的培养基中进行培养。在任何情形下，培养基必须补充有昂贵的成分，这将操作成本增加至难以与有经济效益的工业工艺相容的水平。
因此，目前工艺水平缺乏2,3-bdo的可持续的生物技术生产的有效方法，其通过rg1微生物驱动的发酵的方式，允许以较大产量和产率从可再生的生物质原材料获得高浓度的2,3-bdo。
发明详述
为了解决该缺陷，本发明提供了具有增加的产生2,3-bdo的能力的rg1细菌菌株，获得所述菌株的方法，以及以较高产量和产率及工业化可行性使用所述菌株的有效发酵方法。另外，令人吃惊地，该相同的菌株已被发现能够产生其他可选的代谢物，特别是乙偶姻和乳酸，这取决于使用的培养条件。
本发明提供了乳酸乳球菌菌株，其属于rg1，显示较高的产生代谢物如2,3-bdo、乙偶姻和乳酸的能力，这取决于培养条件。所述菌株显示关于代谢物产生的令人吃惊的多功能性，而不影响其活力和功能。
如下文所述的，本发明的菌株关于上述代谢物的产生(取决于培养条件)为高度有效和特异性的。例如，使用所述菌株发酵富含碳水化合物的培养基，并简单地调节ph和氧浓度参数，本发明的菌株能够主要产生2,3-bdo、乙偶姻或乳酸。重要的是需要指出这些特征的实现不需要向培养基中补充化合物如抗生素、乳链菌肽和促进所述产物合成的其他物质。这点非常重要，因为其允许降低生产成本和简化工艺的处理和发酵步骤。总之，其使得更容易以工业规模进行代谢物生产。
为了获得本发明的菌株，发明人开发了包括两种遗传改良的乳酸乳球菌菌株的原生质体融合的方案。该方案被称为基因组重排，其允许两种突变体的基因重组(zhangyx等人,“genomeshufflingleadstorapidphenotypicimprovementinbacteria”,nature2002,第415卷,pp.644–646)。令人吃惊地，通过该原生质体融合，发现了具有较高的产生代谢物能力的新的乳酸乳球菌菌株。有利地，使用原生质体融合技术，不需要将外源dna序列插入细菌或者使用基因表达的化学诱导物。
因此，本发明的第一个方面为产生细菌乳酸乳球菌的改良菌株的方法，其包括将来自两种乳酸乳球菌亲本菌株的两个原生质体融合的步骤，当在需氧条件下培养时，相比乳酸乳球菌的野生型菌株，所述乳酸乳球菌亲本菌株显示：(a)增加的产生乙偶姻和/或2,3-丁二醇的能力，和(b)降低的产生乳酸的能力。
如提供的实验数据所公开的，当相比其亲本菌株时，利用该方案产生的菌株根据培养条件能够显示：增加的产生2,3-bdo的能力，以及相反地，降低的产生乳酸的能力。
在本发明的第一个方面的特定实施方案中，通过对乳酸乳球菌野生型菌株进行诱变获得了上述乳酸乳球菌亲本菌株中的每一种，当在需氧条件下培养时，所述乳酸乳球菌亲本菌株具有增加的产生乙偶姻和/或2,3-bdo的能力以及降低的产生乳酸的能力。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，通过随机诱变进行诱变处理。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，使用化学诱变剂进行诱变处理。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，使用甲磺酸乙酯(ems)进行诱变处理。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，使用辐射进行诱变处理。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，使用重组dna技术或基因工程进行诱变处理。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，在具有降低的缓冲能力且补充有2,3,5-三苯基四唑的酸性琼脂营养培养基(如专利fr2777905和es2352633b1中描述的)中选择利用诱变处理产生的菌株。在该选择性培养基中生长的产生高乳酸盐的细菌形成粉红色菌落，且预期低乳酸盐产生菌显现为红色/棕色菌落。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，当在需氧条件下培养时，一种亲本菌株具有增加的产生乙偶姻的能力，且另一种亲本菌株具有增加的产生2,3-bdo的能力，二者均为与野生型菌株相比较。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，进行诱变处理的起始野生型菌株为菌株乳酸乳球菌ncimb702118，其保藏在英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心(nationalcollectionofindustrial,marineandfoodbacteria,uk)。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，原生质体融合步骤中使用的两种亲本菌株中的一种为菌株乳酸乳球菌cmlb4，当在需氧条件下培养时，相比乳酸乳球菌的野生型菌株，其具有增加的产生乙偶姻的能力和降低的产生乳酸的能力。菌株乳酸乳球菌cmlb4由申请人根据布达佩斯条约于2009年4月21日保藏于西班牙典型培养物保藏中心(colección
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，原生质体融合步骤中使用的两种亲本菌株中的一种为菌株乳酸乳球菌cmlb3，当在需氧条件下培养时，相比乳酸乳球菌的野生型菌株，其具有增加的产生2,3-bdo和乙偶姻的能力以及降低的产生乳酸的能力。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，当在需氧条件下培养时，相比乳酸乳球菌的野生型菌株，具有增加的产生乙偶姻的能力和降低的产生乳酸的能力的、用于原生质体融合步骤的亲本菌株为菌株乳酸乳球菌cmlb4，其以登录号cect7512保藏于西班牙典型培养物保藏中心，且当在需氧条件下培养时，相比乳酸乳球菌的野生型菌株，具有增加的产生2,3-bdo的能力和降低的产生乳酸的能力的、用于原生质体融合步骤的亲本菌株为菌株乳酸乳球菌cmlb3。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，当在需氧条件下培养时，相比乳酸乳球菌的野生型菌株，具有增加的产生乙偶姻的能力和降低的产生乳酸的能力的用于原生质体融合步骤的亲本菌株为菌株乳酸乳球菌cmlb4，其以登录号cect7512保藏于西班牙典型培养物保藏中心，且当在需氧条件下培养时，相比乳酸乳球菌的野生型菌株，具有增加的产生2,3-bdo的能力和降低的产生乳酸的能力的用于原生质体融合步骤的亲本菌株为菌株乳酸乳球菌cmlb3，其为来源于野生型菌株ncimb702118的cmlb4和cmlb3菌株。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，所述方案包括以下步骤：1)对乳酸乳球菌的野生型菌株进行诱变处理；2)选择步骤1)中获得的两种菌株，当在需氧条件下培养时，相比野生型菌株，其具有增加的产生乙偶姻和/或2,3-bdo的能力和降低的产生乳酸的能力；3)将步骤2)中选择的两种菌株用作原生质体融合步骤中的亲本菌株。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，所述方案包括以下步骤：1)对野生型菌株乳酸乳球菌ncimb702118进行诱变处理；2)选择步骤1)中获得的两种菌株，当在需氧条件下培养时，相比野生型菌株，其具有增加的产生乙偶姻和/或2,3-bdo的能力和降低的产生乳酸的能力；3)将步骤2)中选择的两种菌株用作原生质体融合步骤中的亲本菌株。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，所述方案包括以下步骤：1)通过暴露于ems对野生型菌株乳酸乳球菌ncimb702118进行化学诱变处理；2)选择步骤1)中获得的两种菌株，当在需氧条件下培养时，相比野生型菌株，其具有增加的产生乙偶姻和/或2,3-bdo的能力和降低的产生乳酸的能力；3)将步骤2)中选择的两种菌株用作原生质体融合步骤中的亲本菌株。
在本发明的第一个方面的另一个特定实施方案中，所述方案包括以下步骤：1)通过暴露于ems对野生型菌株乳酸乳球菌ncimb702118进行化学诱变处理；2)选择步骤1)中获得的两种菌株，当在需氧条件下培养时，其中的一种具有增加的产生乙偶姻的能力和降低的产生乳酸的能力，并且另一种具有增加的产生2,3-bdo的能力和降低的产生乳酸的能力，二者均为与野生型菌株相比较；3)将步骤2)中选择的菌株用作原生质体融合步骤的亲本菌株。
本发明的第二个方面为通过本发明的第一个方面中描述的方法获得的细菌乳酸乳球菌的改良菌株。
在本发明的第二个方面的特定实施方案中，当在需氧条件下培养时，所述菌株具有增加野生型菌株产生量至少10倍的产生2,3-bdo的能力。
在本发明的第二个方面的另一个特定实施方案中，当在需氧条件下培养时，所述菌株具有增加野生型菌株产生量至少20倍的产生2,3-bdo的能力。
在本发明的第二个方面的另一个特定实施方案中，当在需氧条件下培养时，所述菌株具有增加野生型菌株产生量至少10倍的产生乙偶姻的能力。
在本发明的第二个方面的另一个特定实施方案中，当在需氧条件下培养时，所述菌株具有增加野生型菌株产生量至少20倍的产生乙偶姻的能力。
在本发明的第二个方面的另一个特定实施方案中，当在需氧条件下培养时，所述菌株具有降低野生型菌株产生量至少10倍的产生乳酸的能力。
在本发明的第二个方面的另一个特定实施方案中，当在需氧条件下培养时，所述菌株具有降低野生型菌株产生量至少20倍的产生乳酸的能力。
在本发明的第二个方面的另一个特定实施方案中，当在需氧条件下培养时，所述菌株具有增加的野生型菌株产生量至少10倍的产生2,3-bdo的能力，以及降低野生型菌株产生量至少10倍的产生乳酸的能力。
在本发明的第二个方面的另一个特定实施方案中，当在需氧条件下培养时，所述菌株具有增加的产生野生型菌株产生量至少20倍的产生2,3-bdo的能力，以及降低野生型菌株产生量至少20倍的产生乳酸的能力。
在本发明的第二个方面的另一个特定实施方案中，细菌乳酸乳球菌的菌株被鉴定为乳酸乳球菌43103，其以登录号cect9139保藏于西班牙典型培养物保藏中心(cect)。本发明的乳酸乳球菌菌株根据布达佩斯条约的要求，由位于西班牙，圣塞瓦斯蒂安，圣塞瓦斯蒂安科技园，米凯莱吉帕萨拉夸,2号,e-20009(parquetecnológicodesansebastián,mikeletegipasealekua,num.2,e-20009donostia-sansebastián(spain))的保藏者“腾亚研创(fundacióntecnaliaresearch&innovation)”，于2016年4月19日保藏于西班牙典型培养物保藏中心(cect)，所述保藏中心位于西班牙，巴伦西亚市，帕特纳，巴伦西亚大学c.p，卡特德拉蒂科奥古斯丁埃斯卡迪诺，9号，46980(universidaddevalenciac.p46980catedráticoagustínescardino,num.9,paterna,valencia(spain))。乳酸乳球菌菌株由保藏者参考43103鉴定，获得了登录号cect9139，且另外，声明为活菌。其名称被明确为乳酸乳球菌43103。
本发明的第三个方面为生产2,3-bdo的方法，其包括用本发明的第二个方面的细菌菌株对富含碳水化合物的培养基进行需氧发酵。
在本发明的第三个方面的特定实施方案中，生产2,3-bdo的方法包括以下步骤：
(a)对本发明的第二个方面中限定的菌株进行预培养；
(b)用步骤(a)中获得的预培养物接种富含碳水化合物的培养基；
(c)在20-40℃，ph5.0-7.5和5-100％溶氧浓度下，将步骤(b)中接种的培养基中存在的碳水化合物进行发酵；以及
(d)从步骤(c)得到的发酵液中分离细胞。
应当注意溶氧浓度表示为相对于培养基饱和浓度的％。
在本发明的第三个方面的另一个特定实施方案中，生产2,3-bdo的方法包括以下步骤：
(a)对本发明的第二个方面中限定的菌株进行预培养；
(b)用步骤(a)中获得的预培养物接种富含碳水化合物的培养基；
(c)在20-40℃，ph5.0-7.5和10-90％溶氧浓度下，将步骤(b)中接种的培养基中存在的碳水化合物进行发酵；以及
(d)从步骤(c)得到的发酵液中分离细胞。
在本发明的第三个方面的另一个特定实施方案中，生产2,3-bdo的方法包括以下步骤：
(a)对本发明的第二个方面中限定的菌株进行预培养；
(b)用步骤(a)中获得的预培养物接种富含碳水化合物的培养基；
(c)在20-40℃，ph5.5-6.0和5-100％溶氧浓度下，将步骤(b)中接种的培养基中存在的碳水化合物进行发酵；以及
(d)从步骤(c)得到的发酵液中分离细胞。
在本发明的第三个方面的另一个特定实施方案中，生产2,3-bdo的方法包括以下步骤：
(a)对本发明的第二个方面中限定的菌株进行预培养；
(b)用步骤(a)中获得的预培养物接种富含碳水化合物的培养基；
(c)在20-40℃，ph5.5-6.0和10-90％溶氧浓度下，将步骤(b)中接种的培养基中存在的碳水化合物进行发酵；以及
(d)从步骤(c)得到的发酵液中分离细胞。
在本发明的第三个方面的另一个特定实施方案中，生产2,3-bdo的方法还包括将由步骤(d)得到的无细胞的发酵液中存在的2,3-bdo纯化的步骤。
在本发明的第三个方面的另一个特定实施方案中，步骤(c)中进行的发酵为连续模式。
在本发明的第三个方面的另一个特定实施方案中，步骤(c)中进行的发酵为补料-分批模式。
在本发明的第三个方面的另一个特定实施方案中，步骤(c)中进行的发酵为分批模式。
从在接种时发生的培养开始，2,3-bdo在发酵液中积累15-48小时，优选20-40小时。当达到最大的2,3-bdo产量时(其发生在微生物消耗完可用作碳源的所有碳水化合物后不久)，可以认为发酵完成。一旦发酵完成，就可以从发酵液中分离本发明第二个方面的菌株的细胞。优选通过物理方法的方式，如离心、过滤或本领域的任何其他可用方式，进行这一过程。
然后可以回收或纯化溶解于澄清发酵液中的发酵产生的2,3-bdo，或者按其原状用作水溶液，在后一种情况下不进行进一步的修饰或者在浓缩过程之后。当进行纯化时，可以使用本领域已知的任何方法，单独地或组合以下方式中的一些进行，所述方法包括但不限于蒸馏、全蒸发、超滤、纳滤、直接渗透、液液萃取、固相萃取、超临界流体萃取、层析等。
本发明的第四个方面为乙偶姻生产的方法，其包括用本发明的第二个方面的细菌菌株对富含碳水化合物的培养基进行需氧发酵。
令人吃惊地，已发现本发明第二个方面的菌株的代谢物产生特性非常依赖于培养条件。当在需氧条件下，于5.5-6.0的微酸性ph值下进行发酵时，其主要产生2,3-bdo。然而，当仍然在需氧条件下，但于接近中性的更高ph值下进行发酵时，主要的发酵产物为乙偶姻。“主要”被理解为提及的代谢物占总发酵产物的45％-95％，优选65％-95％。特别地，当在ph5.5-6.0下进行发酵时，70％-95％，优选80％-95％的发酵产物对应于2,3-bdo。当在ph6.5-7.0下进行发酵时，菌株以对应45％-95％，优选地，65％-80％的发酵产物的量产生乙偶姻。
在本发明的第四个方面的特定实施方案中，乙偶姻生产的方法包括以下步骤：
(a)对本发明的第二个方面中限定的菌株进行预培养；
(b)用步骤(a)中获得的预培养物接种富含碳水化合物的培养基；
(c)在20-40℃，ph6.5-7.5和30-100％溶氧浓度下，将步骤(b)中接种的培养基中存在的碳水化合物进行发酵；以及
(d)从步骤(c)得到的发酵液中分离细胞。
在本发明的第四个方面的另一个特定实施方案中，乙偶姻生产的方法还包括将由步骤(d)产生的无细胞的发酵液中存在的乙偶姻纯化的步骤。
在本发明的第四个方面的另一个特定实施方案中，在步骤(c)中进行的发酵为连续模式。
在本发明的第四个方面的另一个特定实施方案中，在步骤(c)中进行的发酵为补料-分批模式。
在本发明的第四个方面的另一个特定实施方案中，在步骤(c)中进行的发酵为分批模式。
从在接种时发生的培养开始，乙偶姻在发酵液中积累15-40小时，优选18-24小时。当达到最大乙偶姻产量时(其在微生物消耗完所有可用作碳源的碳水化合物后不久发生)，可认为发酵完成。
本发明的第五个方面为乳酸生产的方法，其包括用本发明的第二个方面的细菌菌株对富含碳水化合物的培养基进行厌氧发酵。
在本发明的第五个方面的特定实施方案中，乳酸生产的方法包括以下步骤：
(a)对本发明的第二个方面中限定的菌株进行预培养；
(b)用步骤(a)中获得的预培养物接种富含碳水化合物的培养基；
(c)在20-40℃，ph6.0-7.5和厌氧条件下，将步骤(b)中接种的培养基中存在的碳水化合物进行发酵；以及
(d)从步骤(c)得到的发酵液中分离细胞。
在本发明的第五个方面的另一个特定实施方案中，乳酸生产的方法还包括将由步骤(d)得到的无细胞的发酵液中存在的乳酸纯化的步骤。
在本发明的第五个方面的另一个特定实施方案中，在步骤(c)中进行的发酵为连续模式。
在本发明的第五个方面的另一个特定实施方案中，在步骤(c)中进行的发酵为补料-分批模式。
在本发明的第五个方面的另一个特定实施方案中，在步骤(c)中进行的发酵为分批模式。
从在接种时发生的培养开始，乳酸在发酵液中积累15-40小时，优选20-30小时。当达到最大乳酸产量时(其在微生物消耗完所有可用作碳源的碳水化合物后不久发生)，可认为发酵完成。
在本发明的第三个、第四个和第五个方面的特定实施方案中，可发酵的碳水化合物选自(并非限制性目的)：葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、糖蜜和以上的混合物。
在本发明的第三个、第四个和第五个方面的另一个特定实施方案中，发酵培养基包含选自以下的氮源(并非限制性目的)：酵母提取物、肉膏、玉米浆(csl)、肉、大豆或酪蛋白胨、来自富含蛋白的农产品副产品的蛋白水解物，如大豆粉/面粉、乳清、干酒糟及其可溶物(ddgs)，和以上的混合物。
在本发明的第三个、第四个和第五个方面的另一个特定实施方案中，可以向培养基中补充另外的营养物和生长因子，如维生素和矿物盐，以帮助细菌生长和促进2,3-bdo产生。其中，可用的维生素包括吡哆胺、生物素、烟酸、泛酸钙、核黄素和硫辛酸，其可以作为具有已知组分的纯维生素的人工混合物或者作为复合的天然制剂或包含其的提取物如酵母提取物、csl等而添加。矿物盐可优选地选自：磷酸盐、钾盐和镁盐。
在本发明的第三个、第四个和第五个方面的另一个特定实施方案中，由于整个发酵中过量的泡沫形成，必要时也可以根据本领域已知的方案，向富含碳水化合物的培养基中补充消泡剂，如基于硅酮的消泡剂、植物油、聚乙二醇等。
在本发明的第三个和第四个方面的另一个特定实施方案中，可以使用需氧培养的任何标准的技术在富含碳水化合物的培养基中进行本发明第二个方面的菌株的培养。在液体培养基中的培养方法是优选的，特别是摇瓶培养或者在发酵罐或恒化器样反应器中培养。
在本发明的第三个和第四个方面的另一个特定实施方案中，可以以空气、纯氧或其混合物的形式，通过充足供应氧气至培养基的方式，实现培养的需氧特征。在摇瓶培养的情形下，通过以100-500rpm，优选200-300rpm的频率振荡培养瓶，而实现氧气供应。在培养反应器的情形下，以使得溶氧浓度为5％-100％，优选10％-90％的饱和浓度的方式，将空气流、纯氧流或其混合物流通过培养基而实现氧气供应。可以在以250-1000rpm，优选500-750rpm运行的搅拌器或叶轮的帮助下，进行培养基混合。
在本发明的第五个方面的特定实施方案中，可以使用任何厌氧培养的标准技术在富含碳水化合物的培养基中进行本发明的第二个方面的菌株的培养。在液体培养基中的培养方法是优选的，特别是烧瓶培养或者在发酵罐或恒化器样反应器中培养。
在本发明的第五个方面的另一个特定实施方案中，可以通过将培养基与环境氧隔离开来而实现培养的厌氧特征。在烧瓶培养的情形下，可以通过缺少振荡或将其密封而实现隔离。在培养反应器的情形下，可以通过将其密封和/或使无氧气的气体流通过培养基而实现隔离。可以在以250-1000rpm，优选400-600rpm运行的搅拌器或叶轮的帮助下，进行培养反应器中的培养基混合。
在本发明的第三个、第四个和第五个方面的另一个特定实施方案中，当必需将ph维持在固定值时，可以通过使用缓冲剂(在为该目的通常使用的那些中选择)，或者根据培养的特定要求添加碱或酸(以分别抵消可能造成微生物生长的酸化或碱化)，来实现培养基的ph控制。
因此，本发明还提供了乳酸乳球菌的改良菌株，当在需氧条件下培养时，其具有增加其所来源的野生型菌株产生量至少10倍，优选地，20倍的产生2,3-bdo的能力、增加其所来源的野生型菌株产生量至少10倍，优选地，20倍的产生乙偶姻的能力，以及降低其所来源的野生型菌株产生量至少10倍的产生乳酸的能力。可选地或另外，本发明的菌株根据培养的ph主要产生2,3-bdo或乙偶姻。例如，当在富含碳水化合物的培养基中于20-40℃，ph5.5-6.0和5％-100％溶氧浓度下培养时，本发明的菌株产生2,3-bdo的量对应于总发酵产物的70％-95％，并且当在富含碳水化合物的培养基中于20-40℃，ph6.5-7.5和30-100％溶氧浓度下培养时，产生乙偶姻的量对应于发酵产物的45％-80％。优选地，当在富含碳水化合物的培养基中于20-40℃，ph5.5-6.0和10％-90％溶氧浓度下培养时，本发明的菌株产生2,3-bdo的量对应于总发酵产物的80％-95％，并且当在富含碳水化合物的培养基中于20-40℃，ph6.8-7.2(例如ph7)和30-100％溶氧浓度下培养时，产生乙偶姻的量对应于发酵产物的65％-80％。乳酸乳球菌的野生型菌株可以为乳酸乳球菌ncimb702118。此外，可通过两种过量产生2,3-bdo和/或乙偶姻的乳酸乳球菌亲本菌株的原生质体融合而获得本发明的菌株，所述亲本菌株来源于如上文所公开的野生型菌株。所述野生型菌株可以为乳酸乳球菌ncimb702118。
为了提高在此描述的主题的清晰度，提供了以下定义，其在贯穿整个文件且特别是权利要求中适用。
本文中使用的术语“基因组重排”是指基于原生质体融合和重组过程将两种或更多种菌株或微生物的基因组混合成一种中的方法。重组最终随机发生，这使得能够产生显示大量基因组和表型的重组衍生菌株的大型文库。可以对重组菌株进行进一步选择或筛选过程，以便仅分离赋予寻找的表型特征和性质的那些菌株。通常，使用显示一些遗传多样性的两种或更多种突变菌株进行“基因组重排”，以寻找这些多样性的有利组合。
本文中使用的术语“野生型菌株”是指天然存在的微生物菌株，即未经人工操纵任何技术以改变其遗传和表型特征的菌株。
本文中使用的术语“预培养”是指用于接种将在其中进行发酵的肉汤的菌株的初步小规模培养。可以在以下的“通用方法”部分中解释的需氧培养条件下，于yec培养基中进行本发明第二个方面的菌株的预培养，持续24小时。
本文中使用的术语“富含碳水化合物的培养基”是指这样的任何培养基，其包含可被本发明的第二个方面的菌株同化的能源、碳源和氮源，且允许其生长和由相同菌株根据培养条件以较高量产生2,3-bdo、乙偶姻或乳酸。例如且非限制性目的，其中合适的碳源和能源包括葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、糖蜜和以上的混合物。合适的氮源可以包括但不限于酵母提取物、肉膏、玉米浆(csl)、肉、大豆或酪蛋白冻、来自富含蛋白的农产品副产品的蛋白水解产物，如大豆粉/面粉、乳清、干酒糟及其可溶物(ddgs)，和以上的混合物。
本文中使用的术语“原生质体”是指通过在渗透稳定的培养基中进行酶处理而除去了其细胞壁的细菌细胞。
本文中使用的术语“需氧发酵”是指在需氧条件下，即在氧存在下进行的发酵。本文中使用的术语“厌氧发酵”，是指在厌氧条件下，即在无氧下进行的发酵。从广义上讲，发酵是一种将碳水化合物转化为各种生物产品的代谢过程。
本文中关于改良菌株使用的术语“相比乳酸乳球菌的野生型菌株，增加的产生乙偶姻和/或2,3-bdo的能力”，是指以下事实，即如本发明中提供的实施例中通过使用“通用方法”部分中描述的方法检测到的，上述菌株产生比野生型菌株更大量的这类代谢物(乙偶姻和/或2,3-bdo)。
本文中关于改良菌株使用的术语“相比乳酸乳球菌的野生型菌株，降低的产生乳酸的能力”，是指以下事实，即如本发明中提供的实施例中通过使用“通用方法”部分中描述的方法检测到的，上述菌株产生比野生型菌株更低的量的这类代谢物(乳酸)。
实施例
通过以下实施例的方式进一步阐述了本发明，实施例的给出仅为说明目的，且不旨在以任何方式限制本发明。
通用方法
微生物：本发明中使用的微生物为细菌菌株-乳酸乳球菌cmlb4(西班牙专利es2352633b1)、乳酸乳球菌cmlb3和乳酸乳球菌43103。所有这些菌株均来源于野生型菌株-乳酸乳球菌ncimb702118。
培养基：在yec培养基中进行摇瓶培养，所述yec培养基的组成如下：10g/l葡萄糖，5g/l酵母提取物和20mm柠檬酸钠缓冲液(ph7.0)。
在富含碳水化合物的培养基中进行发酵罐培养。本文中所使用的术语“富含碳水化合物的培养基”是指本领域已知的这样的任何培养基，其包含可被菌株乳酸乳球菌43103同化的能源、碳源和氮源，且允许细菌生长和相同的细菌根据培养条件较高地产生2,3-bdo、乙偶姻或乳酸。具体地，本发明提供的实施例中使用的富含碳水化合物的培养基包含纯的或来自甜菜蜜糖的葡萄糖或蔗糖形式的100g/l的初始碳水化合物浓度。
培养方法：在整个本发明中使用了以下类型的培养：
a.摇瓶培养：在室温和250rpm旋转振荡下，于包含20mlyec培养基的100ml爱伦美氏瓶(erlenmeyerflasks)中进行需氧摇瓶培养。通过用1％(v/v)接种物接种培养基来开始培养，所述接种物作为用在yec琼脂培养基的平板上生长3天的菌株菌落接种之后，在yec培养基中生长24小时的预培养物而获得。
b.发酵罐培养(分批)：使用配备有1l反应器且包含750ml富含碳水化合物的培养基的实验室发酵罐进行发酵罐分批培养。在30℃和500或750rpm的搅拌速率下进行发酵。在需氧培养中，通过将1l/l/min的空气流(其为单独的或富含氧的)通过培养基，而将溶氧浓度设定在相对于培养基饱和浓度的10％-30％。在厌氧培养中，搅拌速率设定在500rpm且移除了空气供应。在实验间，发酵ph设定为不同的值，且通过自动添加5mnaoh来维持。通过用100ml预培养物接种培养基来开始发酵，所述预培养物为用在-80℃下1ml冷冻管中的保存在10％甘油中的菌株接种之后，在500ml爱伦美氏瓶中的yec培养基中生长24小时获得的。
c.发酵罐培养(补料-分批)：按方法b中所述的(除了包括在碳源接近耗尽时另外补给100g/l的葡萄糖)进行发酵罐补料-分批培养。
代谢物浓度的测量：使用aminexhpx-87h300x7.8mm(biorad)柱和microguardcationhrefillcartridge预置柱，采用以下条件，通过hplc测量发酵液中的2,3-bdo、乙偶姻、乳酸盐、乙酸盐、乙醇和葡萄糖或蔗糖浓度：流动相，0.01nh2so4；流速，0.7ml/min；柱温度，55℃；检测器温度：35℃。利用折射率检测器进行峰值定量。
细菌生长测量：yec培养基中的细菌生长或生物质浓度测量为600nm(od600)处适当稀释的细胞悬液的光密度。当在富含碳水化合物的培养基中进行培养时，不能测量生物质，这是由于培养基中存在干扰测量的不溶性颗粒。
实施例1
突变菌株乳酸乳球菌b3的分离
于30℃(250rpm)，在包含10ml的补充有1％葡萄糖的m17培养基(terzaghibe,sandinewe,"improvedmediumforlacticstreptococciandtheirbacteriophages",appl.microbiol.,1975,第29卷,pp.807–813；组分以g/l计：胰蛋白胨，2.5；肉蛋白胨，2.5；大豆蛋白胨，5.0；肉膏，5.0；酵母提取物，2.5；甘油磷酸钠，19.0；硫酸镁，0.25；和抗坏血酸，0.50)的100ml爱伦美氏瓶中，将野生型菌株乳酸乳球菌ncimb702118的单个菌落培养24小时。通过离心/重悬于100mm磷酸钾缓冲液(ph7.5)中，将细菌细胞洗涤两次，并最终重悬于1ml的相同缓冲液中。向该浓缩的细胞悬液中，加入120μl的化学诱变剂甲磺酸乙酯(ems)，并在轻轻振荡下，将产生的悬液于25℃下孵育15分钟。然后，将细胞用10ml的相同磷酸钾缓冲液再洗涤两次，重悬于具有1％葡萄糖的10mlm17培养基中，并在振荡下孵育1小时。
最后，将产生的细胞悬液的合适稀释液铺板于选择性培养基琼脂板上。选择培养基为包含较低缓冲能力(仅为标准缓冲剂的5％)，且另外补充有100mg/l2,3,5-三苯基四唑的改良的m17培养基。在该选择培养基上，在野生型菌株形成粉红色菌落时，预期产生较少乳酸的菌株显现为红色/棕色菌落。
从铺板在选择培养基上的总共26,000个菌落中，分离了4个红色的菌落，并分析了其代谢物产生(方法a)。在这些分离的菌落中，最终选择了菌株乳酸乳球菌b3，因为其显示最高的2,3-bdo产生和最少的乳酸产生。生长和代谢物产生示于表1中。
实施例2
菌株乳酸乳球菌43103的分离
使用基因组重排的方法，通过突变菌株乳酸乳球菌b4和b3的原生质体融合，获得了菌株乳酸乳球菌43103。
从生长20小时的菌株乳酸乳球菌b4和b3的yec培养基中的摇瓶培养物，分别采集了1ml的每种培养物，并于14,000rpm离心5min。将细胞于pm中(原生质化培养基：10mmtris-hcl(ph7.0)，20mmcacl2和0.5m蔗糖)洗涤3次，最后重悬于补充有5mg/ml溶菌酶和100u/ml变溶菌素的650μlpm中。在轻轻振荡下，将细菌悬液于37℃下孵育2小时，以获得其各自的原生质体。将原生质体于pm中洗涤两次，并重悬于0.5ml的相同培养基中。
在60℃的水浴中，将100μl的菌株乳酸乳球菌b4的原生质体悬液的样品加热30min，以灭活原生质体。
在1.5mleppendorf管中，将菌株乳酸乳球菌b4(热灭活的)和b3(未灭活的)的各自50μl的原生质体悬液混合，然后加入900μl补充有50％peg6000的pm，轻轻混合，并在37℃下孵育10min，以诱导原生质体融合。然后，将悬液用pm洗涤两次以停止原生质体融合过程。将产生的所有悬液用于接种包含5mlrm(再生培养基：1％葡萄糖，5g/l酵母提取物，20mm柠檬酸(ph7,0)，25mmmgcl2，25mmcacl2，2.5％明胶，0.5m蔗糖)的100ml爱伦美氏瓶，并在室温下培养(125rpm)过夜。
将上述培养物的合适稀释液铺板于补充有100mg/l2,3,5-三苯基四唑的无缓冲的yec培养板(无柠檬酸盐)上，并孵育48小时，直至出现菌落。在相同培养基的新鲜板上分离显示独特方面的总共18个菌落，然后分析其生长和代谢物产生(方法a)，并与菌株乳酸乳球菌b4、b3和野生型比较。在所有分离的菌株中，其中的一种(名称为乳酸乳球菌43103)显示关于乙偶姻/2,3-bdo/乳酸产生的最佳特性。结果示于表1中。
表1.yec培养基中乳酸乳球菌的野生型和b4、b3及43103突变菌株的生长和代谢物产生(方法a)。
代谢物浓度表示为mm。
*由于培养基的有限缓冲能力和大量的乳酸产生，多于50％的葡萄糖未被使用。
实施例3-6
在不同的ph值下，用菌株乳酸乳球菌43103进行甜菜糖蜜培养基的需氧发酵
根据“通用方法”部分中描述的方法b，在7.0-5.5的不同的ph值下，将菌株乳酸乳球菌43103用于进行包含甜菜糖蜜作为碳源的富含碳水化合物的培养基的一系列的需氧发酵。溶氧浓度设定为30％，且搅拌速率设定为750rpm。代谢物产生的结果示于表2中。
表2.在不同的ph值下，用菌株乳酸乳球菌43103进行甜菜糖蜜培养基的需氧发酵(方法b)中的代谢物产生。
代谢物浓度表示为mm。
实施例7-11
在ph5.5和不同数值的溶氧浓度及搅拌速率下，用菌株乳酸乳球菌43103进行甜菜糖蜜培养基的需氧发酵
根据“通用方法”部分中描述的方法b，在ph5.5和10％-30％的不同数值的溶氧浓度，及500-750rpm的搅拌速率下，将菌株乳酸乳球菌43103用于进行包含甜菜糖蜜作为碳源的富含碳水化合物的培养基的一系列的需氧发酵。代谢物产生的结果示于表3中，其中将先前于30％溶解氧和750rpm处获得的数值纳入作为参照。
表3.在ph5.5和不同数值的溶氧浓度及搅拌速率下，用菌株乳酸乳球菌43103进行的甜菜糖蜜培养基的需氧发酵(方法b)中的代谢物产生。
代谢物浓度表示为mm。
1do，溶氧浓度，表示为相对于培养基饱和浓度的％。
2搅拌速率，搅拌速率，表示为rpm。
实施例12-14
在ph5.5下，用菌株乳酸乳球菌43103进行包含不同碳源的培养基的需氧发酵
根据“通用方法”部分中描述的方法b，在ph5.5，10％溶氧浓度和750rpm搅拌速率下，将菌株乳酸乳球菌43103用于进行包含纯的葡萄糖、葡萄糖浆或纯的蔗糖作为碳源的富含碳水化合物的培养基的一系列的需氧发酵。代谢物产生的结果示于表4中。
表4.在ph5.5下，用菌株乳酸乳球菌43103进行葡萄糖、葡萄糖浆或蔗糖培养基的需氧发酵(方法b)中的代谢物产生。
代谢物浓度表示为mm。
实施例15
在ph6.0下，用菌株乳酸乳球菌43103进行包含葡萄糖的培养基的需氧补料-分批发酵
根据“通用方法”部分中描述的方法c，在ph6.0，10％溶氧浓度和750rpm搅拌速率下，在包含葡萄糖作为碳源的、富含碳水化合物的培养基的补料-分批模式下，将菌株乳酸乳球菌43103用于进行需氧发酵。代谢物产生的结果示于表5中。
表5.在ph6.0下，用菌株乳酸乳球菌43103进行葡萄糖培养基的需氧补料-分批发酵(方法c)中的代谢物产生。
代谢物浓度表示为mm。
实施例16
用菌株乳酸乳球菌43103进行甜菜糖蜜培养基的厌氧发酵
根据“通用方法”部分中描述的方法b，将菌株乳酸乳球菌43103用于进行包含甜菜糖蜜作为碳源的富含碳水化合物的培养基的厌氧发酵。代谢物产生的结果示于表5中。
表6.用菌株乳酸乳球菌43103进行的甜菜糖蜜培养基的厌氧发酵(方法b)中的代谢物产生。
代谢物浓度表示为mm。
本申请中引用的参考文献
ge,y.,etal.“contractedbuteffective:productionofenantiopure2,3-butanediolbythermophilicandgrasbacilluslicheniformis”.greenchemistry,2016
nielsen,d.r.,etal."metabolicengineeringofacetoinandmeso-2,3-butanediolbiosynthesisine.coli.",biotechnol.j.2010,vol.5,pp.274-284
lian,j.,etal.“metabolicengineeringofasaccharomycescerevisiaestraincapableofsimultaneouslyutilizingglucoseandgalactosetoproduceenantiopure(2r,3r)-butanediol”metabolicengineering2014,vol.23,pp.92-99
platteeuwc,etal."metabolicengineeringoflactococcuslactis—influenceoftheoverproductionofalpha-acetolactatesynthaseinstrainsdeficientinlactate-dehydrogenaseasafunctionofcultureconditions",appl.environ.microbiol.1995,vol.61,pp.3967–71
gasparp,etal."highyieldsof2,3-butanediolandmannitolinlactococcuslactisthroughengineeringofnad(+)cofactorrecycling",appl.environ.microbiol.2011,vol.77,pp.6826–35
liuj,etal.“combiningmetabolicengineeringandbiocompatiblechemistryforhigh-yieldproductionofhomo-diacetylandhomo-(s,s)-2,3-butanediol”,metabolicengineering2016,vol.36,pp.57–67
pct/us2009/058834
zhangyx,etal.“genomeshufflingleadstorapidphenotypicimprovementinbacteria”,nature2002,vol.415,pp.644–646
fr2777905
es2352633b1
terzaghibe,sandinewe,"improvedmediumforlacticstreptococciandtheirbacteriophages",appl.microbiol.,1975,vol.29,pp.807–813
条款
1.产生细菌乳酸乳球菌的改良菌株的方法，所述方法包括将来自两种乳酸乳球菌亲本菌株的两个原生质体融合的步骤，当在需氧条件下培养时，所述乳酸乳球菌亲本菌株相比乳酸乳球菌的野生型菌株显示：(a)增加的产生乙偶姻和/或2,3-丁二醇的能力，和(b)降低的产生乳酸的能力。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述乳酸乳球菌亲本菌株中的每一种通过对乳酸乳球菌的野生型菌株进行诱变处理而获得。
3.如权利要求2所述的方法，其中使用甲磺酸乙酯(ems)进行所述诱变处理。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中当在需氧条件下培养时，相比乳酸乳球菌的野生型菌株，所述乳酸乳球菌亲本菌株中的一种具有增加的产生乙偶姻的能力，且另一种具有增加的产生2,3-丁二醇的能力。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中进行原生质体融合步骤的两种乳酸乳球菌亲本菌株中的一种为菌株乳酸乳球菌cmlb4，其以登录号cect7512保藏于西班牙典型培养物保藏中心，其中当在需氧条件下培养时，相比乳酸乳球菌的野生型菌株，该菌株具有增加的产生乙偶姻的能力和降低的产生乳酸的能力。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中进行原生质体融合步骤的两种乳酸乳球菌亲本菌株中的一种为菌株乳酸乳球菌cmlb3，其中当在需氧条件下培养时，相比乳酸乳球菌的野生型菌株，该菌株具有增加的产生2,3-丁二醇和乙偶姻的能力，以及降低的产生乳酸的能力。
7.通过权利要求1-6中任一项所述的方法能获得的细菌乳酸乳球菌的改良菌株。
8.如权利要求7所述的细菌乳酸乳球菌的改良菌株，其以登录号cect9139保藏于西班牙典型培养物保藏中心。
9.生产2,3-丁二醇的方法，其包括用权利要求7-8中任一项所限定的细菌菌株对富含碳水化合物的培养基进行需氧发酵。
10.如权利要求9所述的生产2,3-丁二醇的方法，包括以下步骤：
(a)对权利要求7-8中任一项所限定的菌株进行预培养；
(b)用步骤(a)中获得的预培养物接种富含碳水化合物的培养基；
(c)在20-40℃，ph5.5-6.0和5％-100％溶氧浓度下，对步骤(b)中接种的培养基中存在的碳水化合物进行发酵；以及
(d)从步骤(c)得到的发酵液中分离细胞。
11.如权利要求10所述的生产2,3-丁二醇的方法，还包括将由步骤(d)得到的无细胞的发酵液中存在的2,3-丁二醇纯化的步骤。
12.生产乙偶姻的方法，其包括用权利要求7-8中任一项所限定的细菌菌株对富含碳水化合物的培养基进行需氧发酵。
13.如权利要求12所述的生产乙偶姻的方法，包括以下步骤：
(a)对权利要求7-8中任一项所限定的菌株进行预培养；
(b)用步骤(a)中获得的预培养物接种富含碳水化合物的培养基；
(c)在20-40℃，ph6.5-7.5和30％-100％溶氧浓度下，对步骤(b)中接种的培养基中存在的碳水化合物进行发酵；以及
(d)从步骤(c)得到的发酵液中分离细胞。
14.如权利要求13所述的生产乙偶姻的方法，还包括将由步骤(d)得到的无细胞的发酵液中存在的乙偶姻纯化的步骤。
15.生产乳酸的方法，其包括用权利要求7-8中任一项所限定的细菌菌株对富含碳水化合物的培养基进行厌氧发酵。