本发明属于基因工程和生物催化
技术领域：
，具体涉及同工酶共催化合成2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术：
：2,3-丁二醇可以作为一种潜在的平台化合物，替代传统的平台化合物——碳四烃，用于大规模的合成甲乙酮(优良溶剂)和1,3-丁二烯(广泛应用于合成橡胶、聚酯和聚亚胺酯等领域)。生产2,3-丁二醇的方法可分为化学法和生物法。由于2,3-丁二醇结构特殊，化学法生产2,3-丁二醇主要是以石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温高压下水解得到，成本高、过程烦琐、不易操作，所以一直很难实现大规模的工业化生产。生物法即通过微生物发酵或者酶催化的方法生产2,3-丁二醇。随着传统化学法所带来的环境问题日益严重，各国政府对环境问题越来越关注的前提下，将可再生的生物质转化为化工原料的研究得到广泛的关注；相比于对环境破坏较为严重的化学方法生产2,3-丁二醇，生物法具有以下优点：1、生产成本较低，化学法的生产成本则很高；2、对环境友好，并不会像化学方法给环境保护带来很大压力，2,3-丁二醇作为有机合成中间体取代了许多的化合物和其它石化产品的市场，前景广阔，社会、环境效益显著，非常有利于该产品的广泛应用；3、可再生性，摆脱了化学法对化石原料的依赖性，因此具有很好的应用前景。目前2,3-丁二醇的商业价格达100000元/吨。然而，生物法与化学法相比，亦存在很多不足之处，其中最为重要的就是生物催化剂合成2,3-丁二醇的浓度低、速率低，前体物质转化不彻底，导致了产品后分离纯化困难、碳原料收率低下等问题，其根本原因是生物催化过程中催化2,3-丁二醇合成的蛋白的催化性能不够稳定。生物体内能够催化2,3-丁二醇合成的蛋白种类众多、催化性能各异，然而目前生物法合成2,3-丁二醇的研究中，无论是采用生物发酵还是酶催化的方式，其2,3-丁二醇合成过程均主要由单个2,3-丁二醇脱氢蛋白催化完成。比如cn201480068734.1中提到的乙偶姻向2,3-丁二醇转化即是导入单个2,3-丁二醇脱氢蛋白编码基因，从而增加2,3-丁二醇的产量；chiamyung等研究酵母产2,3-丁二醇的途径时，也只是对单个基因进行操作(ngetal.,microbialcellfactories201211:68)；soojinlee等研究合成左型2,3-丁二醇是在大肠杆菌中对buda(乙酰乳酸脱羧反应蛋白编码基因)和meso-budc(编码内消旋型2,3-丁二醇合成基因)操作合成纯的内消旋型2,3-丁二醇(soojinlee,borimkimetal.,synthesisofpuremeso-2,3-butanediolfromcrudeglycerolusinganengineeredmetabolicpathwayinescherichiacoli20121801-1813)。li等人在大肠杆菌中进行全细胞催化合成2,3-丁二醇也仅仅对单个2,3-丁二醇脱氢酶基因进行表达(lixianglietal.,biocatalyticproductionof(2s,3s)-2,3-butanediolfromdiacetylusingwholecellsofengineeredescherichiacoli2012111-116)。单独采用一种蛋白进行2,3-丁二醇的合成往往导致催化合成效率低、前体物质利用不完全等问题的出现。技术实现要素：本发明要解决的问题是，提供一种同工酶共催化合成2,3-丁二醇的方法。为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：同工酶共催化合成2,3-丁二醇的基因工程菌，其特征在于，该菌株中含有两种或两种以上对2,3-丁二醇具有不同亲和力的2,3-丁二醇脱氢酶同工酶。其中，所述对2,3-丁二醇具有不同亲和力的2,3-丁二醇脱氢酶同工酶的基因序列包括seqidno.65～69所示的核苷酸序列。作为优选，所述2,3-丁二醇脱氢酶同工酶包括：(1)枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的乙酰乳酸脱羧酶；(2)拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckiincimb8052)的2,3-丁二醇脱氢酶；(3)克雷伯氏菌(k.pneumoniaekctc2242)的2,3-丁二醇脱氢酶；(4)产乙醇梭菌(c.autoethanogenum)的2,3-丁二醇脱氢酶；(5)枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脱氢酶。其中，所述枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脱氢酶，其核苷酸序列如seqidno.65所示；所述拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckiincimb8052)的2,3-丁二醇脱氢酶，其核苷酸序列如seqidno.66所示；所述克雷伯氏菌(k.pneumoniaekctc2242)的2,3-丁二醇脱氢酶，其核苷酸序列如seqidno.67所示；所述产乙醇梭菌(c.autoethanogenum)的2,3-丁二醇脱氢酶，其核苷酸序列如seqidno.68所示；所述枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的乙酰乳酸脱羧酶，其核苷酸序列如seqidno.69所示。同工酶共催化合成2,3-丁二醇的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)将seqidno.1～5所示2,3-丁二醇脱氢酶同工酶基因序列中的一种或几种串联连接入表达载体，或者将seqidno.65～69所示基因序列中的一种或几种分别连接入不同的表达载体中，得到重组质粒；(2)将步骤(1)得到的重组质粒导入宿主细胞中，既得到同工酶共催化合成2,3-丁二醇的基因工程菌。其中，所述的宿主细胞为丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumb3。其中，任意两个2,3-丁二醇脱氢酶同工酶基因之间由一段rbs序列连接。其中，所述rbs序列如seqidno.70所示。作为优选，2,3-丁二醇脱氢酶同工酶基因串联连接包括如下组合：(1)枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脱氢酶基因bdha+拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckiincimb8052)的2,3-丁二醇脱氢酶基因acr；(2)枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脱氢酶基因bdha+克雷伯氏菌(k.pneumoniaekctc2242)的2,3-丁二醇脱氢酶基因budc；(3)枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脱氢酶基因bdha+产乙醇梭菌(c.autoethanogenum)的2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh；(4)枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的乙酰乳酸脱羧酶基因alsd+拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckiincimb8052)的2,3-丁二醇脱氢酶基因acr；(5)枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的乙酰乳酸脱羧酶基因alsd+克雷伯氏菌(k.pneumoniaekctc2242)的2,3-丁二醇脱氢酶基因budc；(6)枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的乙酰乳酸脱羧酶基因alsd+产乙醇梭菌(c.autoethanogenum)的2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh；(7)枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的乙酰乳酸脱羧酶基因alsd+枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脱氢酶基因bdha。当任意两个2,3-丁二醇脱氢酶同工酶基因之间由一段rbs序列连接，包括如下组合：(1)枯草芽孢杆菌b.subtilis168的乙酰乳酸脱羧酶基因alsd+rbs+拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)ncimb8052的2,3-丁二醇脱氢酶基因acr；(2)枯草芽孢杆菌b.subtilis168的乙酰乳酸脱羧酶基因alsd+rbs+克雷伯氏菌(k.pneumoniaekctc2242)的2,3-丁二醇脱氢酶基因budc；(3)枯草芽孢杆菌b.subtilis168的乙酰乳酸脱羧酶基因alsd+rbs+产乙醇梭菌(c.autoethanogenum)的2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh；(4)枯草芽孢杆菌b.subtilis168的乙酰乳酸脱羧酶基因alsd+rbs+枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脱氢酶基因bdha。(5)枯草芽孢杆菌b.subtilis168的乙酰乳酸脱羧酶基因alsd+rbs+枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脱氢酶基因bdha+rbs+拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckiincimb8052)的2,3-丁二醇脱氢酶基因acr；(6)枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的乙酰乳酸脱羧酶基因alsd+rbs+枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脱氢酶基因bdha+rbs+克雷伯氏菌(k.pneumoniaekctc2242)的2,3-丁二醇脱氢酶基因budc；(7)枯草芽孢杆菌b.subtilis168)的乙酰乳酸脱羧酶基因alsd+rbs+枯草芽孢杆菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脱氢酶基因bdha+rbs+产乙醇梭菌(c.autoethanogenum)的2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh。从催化反应动力学来讲，酶的底物亲和力以及转换数是酶催化性能的重要表征，而从反应机理上来讲，具有高底物亲和力的酶能够将底物转化的更为彻底，但是转换数通常较低；转换数高的酶具有较快的产物合成速率，但是通常无法将底物转化彻底。本研究考察了多种2,3-丁二醇脱氢酶(又称作乙偶姻还原酶)的催化性能，发现一些蛋白能够高效率、高浓度地合成2,3-丁二醇，但存在前体物质转化不完全的问题；而另一些蛋白虽然合成2,3-丁二醇的速率稍低，但能够将前体物质彻底转化为2,3-丁二醇，亦即此两类酶具有互补性的催化优势。因此，本发明提供的两类同工酶共催化合成2,3-丁二醇的方法，既能实现2,3-丁二醇的高效合成，又能实现前体物质的彻底转化。该方法能够显著提升2,3-丁二醇合成过程的经济性以及相关生物过程的生产性能。本发明公开了一种同工酶共催化合成2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用，主要是通过将对2,3-丁二醇具有不同亲和力的2,3-丁二醇脱氢酶同工酶同时构建到宿主细胞中，然后诱导表达，利用得到的重组菌进行发酵，附图说明图1是不同2,3-丁二醇脱氢蛋白的基因连接与表达方式示意。图1中，r1为多个2,3-丁二醇脱氢蛋白基因分别、独立地连接在表达载体上；r2为多个2,3-丁二醇脱氢蛋白基因通过基因融合表达的方式连接在同一表达载体上；r3为多个2,3-丁二醇脱氢蛋白基因共同连接在同一表达载体上，且各基因之间补充rbs序列(核糖体结合位点序列)，以利于各基因的表达；r4为多个2,3-丁二醇脱氢蛋白基因共同连接在同一表达载体上，并且与其他基因一起表达。bdha，来自于bacillussubtilis的2,3-丁二醇脱氢酶基因(又称为2,3-丁二醇脱氢酶基因)；acr，来自于clostridiumacetobutylicum的2,3-丁二醇脱氢酶基因；p表示表达基因的启动子；rbs表示核糖体结合位点。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。下述实施例中如无特殊说明，所用方法均为常规方法，如《分子克隆：实验室手册》(newyork:coldspringhaborlaboratorypress,1989)中所述的方法。所用试剂均可从商业途径获得。下述实施例以丙酮丁醇梭菌为例阐明本发明的同工酶共催化合成2,3-丁二醇基因工程菌株的构建方法。本实验所要用得到培养基如下表：lb培养基组分浓度(g/l)蛋白胨10酵母粉5nacl10p2种子培养基组分浓度(g/l)葡萄糖10蛋白胨5酵母粉3mgso4·7h2o3nacl2ch3coonh42k2hpo41kh2po41feso4·7h2o0.1p2发酵培养基各组分浓度(g/l)葡萄糖60ch3coonh42.2nacl0.01k2hpo40.5kh2po40.5mgso4·7h2o0.2mnso4·h2o0.01feso4·7h2o0.01对氨基苯酸硫胺0.001硫胺0.001生物素0.00012xytg培养基组分(ph5.2)浓度(g/l)蛋白胨16酵母粉10nacl5葡萄糖5实施例1：体外扩增所需2,3-丁二醇脱氢酶基因片段及乙酰乳酸脱羧反应蛋白编码基因np_391481(seqidno:5)片段，如需进行多基因整合表达，可通过重叠pcr的方式将两个或多个基因完成整合。采用细菌基因组试剂盒(takaracode：dv810a)提取对数生长中后期的枯草芽孢杆菌b.subtilis168基因组dna，用于合成乙酰乳酸脱羧反应蛋白编码基因(对应蛋白编号为np_391481)和2,3-丁二醇脱氢酶基因(np_388505)。以下所述基因组提取均与枯草芽孢杆菌b.subtilis168基因组dna提取的方法相同，按照试剂盒说明进行此操作即可，拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)ncimb8052基因组dna，用于合成2,3-丁二醇脱氢酶基因(abr33642)；克雷伯氏菌k.pneumoniaekctc2242基因组dna，用于合成2,3-丁二醇脱氢酶基因(abr77284)；产乙醇梭菌c.autoethanogenum基因组dna，用于合成2,3-丁二醇脱氢酶基因(yp_001634733)。以上所提到的蛋白编号均为ncbi-proteinid。以下引物在设计时，其前端和后端引物都插入了相对应质粒上的酶切位点，为了更好地进行一步克隆连接反应，载体酶切位点前后15～20bp必须与引物上保持一致，一步克隆原理参见clonexpresstmiionestepcloningkit使用说明书。例如，当选用pimpi-ptb载体进行外源基因表达时，即可选择限制性内切酶ndei进行酶切，然后进行前后端各含有15～20bp相同序列的引物设计(不仅限于此种表达载体)。下面将以表格的形式列举扩增目的基因的引物。f代表前端引物，r代表后端引物，均为5'到3'。表1单个2,3-丁二醇脱氢酶基因体外扩增引物表2np_391481(乙酰乳酸脱羧反应蛋白编码基因，下文出现时不再标示)与上述四种2,3-丁二醇脱氢酶编码基因体外组装引物表3np_391481与单个2,3-丁二醇脱氢酶基因之间加入一个rbs序列：aggaggttagttaga的扩增引物表4用于体外扩增三基因之间含有两个rbs序列的np_391481与两个2,3-丁二醇脱氢酶编码基因整合片段的引物：表5pcr反应体系(100ul)pcr反应组分体积(ul)5×psbuffer20dntpmix10primer11primer21模板dna1primestar(高保真酶)0.5ddh2o67.5表6pcr扩增反应程序设计通过以上方法即可得到目的基因，使用胶回收试剂盒进行胶回收。具体步骤参见takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0试剂盒。实施例2：将扩增的2,3-丁二醇脱氢酶基因与表达载体连接，通过热击转化或电转化的方法导入细胞中，获得具有催化活力的2,3-丁二醇脱氢酶蛋白。(1)一步克隆法进行基因片段与载体连接：实施例1中所设计的引物，其两端都是含有ndei酶切位点的，并且都人为的加上了一段与载体ndei酶切位点两端相同的15-20bp的碱基序列。因此，可以直接用一步克隆试剂盒，具体操作步骤详见clonexpresstmiionestepcloningkit使用说明书；表7一步克隆反应体系：反应体系组分体积ddh2oupto20ul5×ceiibuffer4ul线性化克隆载体1ul(50-200ng)插入片段扩增产物1ul(20-200ng)exnasetmii2ul(2)将一步克隆反应液导入细胞中，从而使上述组装的基因获得表达，合成出催化2,3丁二醇合成的蛋白，以下以热击转化大肠杆菌和电击转化丙酮丁醇梭菌为例来说明。表8大肠杆菌热击转化步骤(3)丙酮丁醇梭菌电击转化：将一步克隆反应液与e.colitop10混合，e.colitop10购自北京天根生化科技有限公司(目录号cb104)。pan2为甲基化质粒(heap,j.t.,pennington,o.j.,cartman,s.t.,carter,g.p.,minton,n.p.,2007.theclostron:auniversalgeneknock-outsystemforthegenusclostridium.jmicrobiolmethods70,452-464)。并将转化后细胞涂布于含有氨苄青霉素和四环素素的lb平板上，挑取单菌落富集培养后提取质粒，提取到的质粒即是甲基化后的质粒。(4)厌氧条件下，取2xytg培养基培养的生长至对数中期的c.acetobutylicumb3(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，cgmccno.5234；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该菌株的信息在申请号为201210075094.x的中国专利中详细公开)培养液60ml，4℃、4000rpm离心10min弃去上清，加入足量预冷的电转缓冲液epb(270mm蔗糖，5mmnah2po4，ph7.4)，洗涤两次，并用2.3mlepb重悬。然后取570ul加入0.4cm电转杯放置在冰浴中冷却，并加入20ul甲基化的构建质粒，冰浴放置2min。2.0kv电压，25uf电容进行电转化。随后将电转液加入到1ml37℃的2xytg培养基中复苏培养4h，离心收集细胞100ul并将细胞涂布于含有20ug/ml甲砜霉素的p2平板中。厌氧培养24-36h后，获得含有构建质粒的重组丙酮丁醇梭菌。实施例3：为了更好的展示同工酶催化合成2,3-丁二醇这一方法的应用，在此以丙酮丁醇梭菌为同工酶表达的宿主、以葡萄糖为发酵底物催化合成2,3-丁二醇。培养条件：丙酮丁醇梭菌(c.acetobutylicumb3(cgmcc5234),以下简称b3)基因工程菌在平板上(加入1.5g/l琼脂粉的p2液体培养基)进行活化后，转接入种子液静止培养12-16h后，以10％(v/v)的接种量接入到含有50-60g/l的葡萄糖培养基中发酵120h。发酵液组分用气相色谱检测，气相色谱检测条件如下：火焰离子检测器(fid)，agilenthp-innowax19091n-236毛细管色谱柱(60m×0.25mm×0.25um)，n2为载气，流速2ml/min，分流比10：1，h2流速30ml/min，空气流速300ml/min，进样口温度240℃，检测器250℃，柱温(程序升温)：70℃保留0.5min，然后以20℃/min的速率升温到190℃，保留4min。表9表达不同2,3-丁二醇脱氢酶基因的发酵数据a表示abr33642和yp_001634733各自单独连接在表达载体上于细胞中共表达；b表示abr33642和yp_001634733两个基因一起连接在表达载体于细胞中共表达；由表9数据可知，通过将2,3-丁二醇脱氢酶蛋白的合成基因导入细胞中，能够表达出催化2,3-丁二醇合成的蛋白进而成功生产出2,3-丁二醇。然而，各种基因编码出来的2,3-丁二醇合成蛋白的催化性能有所差异。如上表中abr33642、yp_001634733表达出来的蛋白催化2,3-丁二醇合成的能力相对降低，但是能够将前体物质乙偶姻转化完全。np_388505、abr77284表达出来的蛋白催化2,3-丁二醇合成的能力较强，但是乙偶姻的转化不完全。因此，本研究以这些催化性能能够优势互补的2,3-丁二醇脱氢酶蛋白进行共同催化合成2,3-丁二醇，结果表明既能提高2,3-丁二醇产量又能实现前体物质转化的彻底性，是一种创新而有应用价值的方法。表10np_391481与2,3-丁二醇脱氢酶基因共表达的工程菌发酵数据催化乙偶姻合成2,3-丁二醇的主要蛋白是2,3-丁二醇脱氢酶，但是为了提高2,3-丁二醇的合成效率，可以将2,3-丁二醇脱氢酶基因与其他相关基因进行共表达，从而实现合成通量的提高。比如本研究除了2,3-丁二醇脱氢酶基因之外，还同时表达了用于乙偶姻合成的乙酰乳酸脱羧反应蛋白编码基因，与只有2,3-丁二醇脱氢酶基因表达的实施例(表9)相比，2,3-丁二醇的产量明显提高。表11np_391481与2,3-丁二醇脱氢酶编码基因之间加入rbs序列进行表达的发酵数据菌株名称乙偶姻(g/l)2,3-丁二醇(g/l)b3(np_391481-rbs-np_388505)0.97.9b3(np_391481-rbs-abr33642)0.015.0b3(np_391481-rbs-abr77284)1.36.5b3(np_391481-rbs-yp_001634733)0.024.3当多个基因连接在同一个表达载体上进行表达时，为了提高各基因的表达，可以通过在基因之间加入核糖体结合位点rbs的方式提高基因的表达强度。本例在两个基因之间加入rbs序列(aggaggttagttaga)后，质粒上的基因得到更好地表达，2,3-丁二醇的产量进一步提升。表12np_391481及多个2,3-丁二醇脱氢酶基因共表达的数据通过将多个不同来源的2,3-丁二醇脱氢酶基因与单个乙酰乳酸脱羧反应编码基因共表达，以b3(np_391481-rbs-np_388505-rbs-abr33642)工程菌株为例，发酵终产物中乙偶姻的含量仅为0.01g/l，几乎可以忽略。而b3(np_391481-rbs-np_388505-rbs-abr33642)工程菌株2,3丁二醇的产量则达到7.2g/l。在非目的产物的浓度极低甚至可以忽略的情况下，进行目的产物的分离与纯化将变得更加简单。若将此种方法应用于工业化发酵生产中，不仅可以降低劳动强度，更可以节约经济成本，同时也降低了分离过程中各种化学物质残留对环境产生的影响。实施例4：同工酶共催化合成2,3-丁二醇的方法，不但能应用于以葡萄糖为底物进行细胞发酵合成2,3-丁二醇，也能应用于以2,3-丁二醇合成前体乙偶姻为底物的细胞催化过程中。将实施例3表十二中的b3(np_391481-rbs-np_388505-rbs-yp_001634733)菌株在含有15g/l的葡萄糖的p2培养基中37℃培养12h后，加入10g/l的乙偶姻进行细胞催化反应，反应时间24h，最终能获得2,3-丁二醇17g/l(主要产量由前体物质乙偶姻转化而来，部分来自于以葡萄糖为底物的细胞代谢)，乙偶姻残留不足0.1g/l，可见乙偶姻转化率接近100％。因此，本发明同工酶共催化的方法能用于酶催化或者含有酶的细胞的催化过程中。实施例5：在本发明的应用方面，本发明同工酶共催化合成2,3-丁二醇的方法不但能用于2,3-丁二醇的高效生产过程中，还能用于涉及2,3-丁二醇的其他生物过程中，这些生物过程可能并非以2,3-丁二醇的合成为目标，但是通过采用本发明同工酶共催化合成2,3-丁二醇的方法能够有效地调控这些生物过程，使其有更好的性能。如表十三所示，以生物丁醇发酵为例，丁醇发酵过程产生大约30％(w/w)的廉价副产物丙酮，浓度达到5g/l以上。通过在丁醇发酵中构建同工酶共催化合成2,3-丁二醇的过程，如以实施例3表十二中的b3(np_391481-rbs-np_388505-rbs-yp_001634733)用于生物丁醇发酵，几乎能够彻底消除丁醇发酵过程中大量的廉价副产物丙酮，使其浓度不足0.3g/l，从而整体提升丁醇发酵过程的总产品价值，同时让发酵产物更纯更易于后续的分离。表13本发明在生物丁醇发酵过程中的应用效果sequencelisting<110>南京工业大学<120>同工酶共催化合成2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用<130>sg20170124001<160>69<170>patentinversion3.5<210>1<211>40<212>dna<213>artificialsequence<220><223>np_388505-f<400>1aaa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<211>1083<212>dna<213>来源于拜氏梭菌（clostridiumbeijerinckiincimb8052）的2,3-丁二醇脱氢酶编码基因acr<400>66atgaaagcagcattatggtatgcaaagaaagatgttagagtagaggaaattgaagaacct60aaagttacagttaatggtgtaaagattaaagtaaaatggtgtggaatatgtggatcagat120ttacatgaatatttaggaggacctatatttataccagtaggacaacctcacccattaagt180ggtacaactgctccagtagttctaggacatgaattttcaggagatgtcgttgaagttggt240cctaatgtaaagaattttaaaccaggagatagagtaatagttgaacctatagttgcatgt300ggaaaatgtccagcgtgcttagaaggaaaatataatttatgttcatcattaggtttccat360ggactttgcggaagtggtggaggacttgctgaatatacagttttcccagaagaattcgta420cataagattccagatgaaatgtcttacgaacaagctgctttagttgagccaatggcagta480gcattacattcaattagaattggtaattttagaacaggggatactgcgttagtactagga540tctggtccaataggactagcaactattgagtgcttaaaagcagccggtgcaaaattaata600atagtattacaaagaaaatctataagacaagagtatgctaaaagagcaggggcagatgta660gtattagatcctaatgaagtaaatatagcagaggaagttaagaagcttactaacggatta720ggagttgacgtggcgtttgaaactacaggagctcaaataggttttgatacaggtatagat780agcttaaagtttgaaggaactttagttgtaactagcatatgggaaaatgatgttaaattt840aatcctaatgtattagtattcactgagaagaaaatcattggaacattagcatacagacat900gaattcccagcaactatggctcaaatgaaagatggaagaataaaagcagaaggatatgta960acaaagaaaatacatttagatgatatagttgaagaagggtttggagcattaacaggtcca1020gaaaagaagaaacatgttaagatattagtatctccagacaaagaacttgtatctaaatct1080taa1083<210>67<211>1011<212>dna<213>artificialsequence<220><223>来源于克雷伯氏菌(k.peneumoniaemgh78578)的2,3-丁二醇脱氢酶编码基因budc<400>67atgaaggcagctgttgttacccacgaccatcaggttaacgtcacggaaaaaacgctgcgc60ccgctggaatacggcgaagcgctgttgaaaatggaatgctgcggcgtgtgtcatactgac120ctgcacgtgaaaaacggcgattttggcgataaaaccggcgtcattctcggccatgaaggg180atcggggtggtacaaaaagtcggcccgggcgtcacctccctgaagccgggcgaccgcgcc240agcgtggcgtggttcttcgaaggctgcggccactgcgattactgtaacagcggcaacgag300acgctctgccgctcggtgaaaaacgccggctataccgtcgatggcggcatggcggaagag360tgcatcgtcaccgccaactacgcggtaaaagttccggacggcctcgactccgccgccgcc420agcagcatcacctgcgcgggcgtcaccacctacaaagcggtcaaggtctcccacatcaaa480ccgggccagtggatcgccatctacggcctcggcgggttgggtaacctcgcgctgcagtat540gcgaagaatgtctttaacgccaaagtgatcgctatcgacgtcaacgacggacagctggag600ctggcggcctcgatgggcgccgacctgaccatcaactcccgcaatgaagatgcggcgaaa660gtgattcaggaaaaaaccggcggcgcccacgctgcggtagtaaccgcggtggctaaagcg720gcctttaactcggcggtggatgccgttcgcgccggtggccgcgtggtcgcggtgggcctg780ccgccggaggcgatgagcctcgatattccgcgtctggtgctggacggcatcgaggtggtc840ggttcgctggtcggcacccgtcaggatctggtggaagccttccagtttgccgccgaaggc900aaagtggtgccgaaagtcaccctgcgtccgctggaagatatcaacgctatcttcaaagag960atggagcaaggtcagatccgcggccgtatggttatcgatctgcgtagctaa1011<210>68<211>1047<212>dna<213>来源于产乙醇梭菌(c.autoethanogenum)的2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh<400>68atgcgcgccgtctattatgaagcgtttggtcagatgccatggatcgccacgctgcccgat60ccagccccaacgccagatggtgtcgtgctcgcagtacgcgctaccggcctgtgtcgtagc120gactggcatggctggatggggcatgatcccgatattaagctgccgcatgtgccaggccac180gaactggccggcgagattgttgccgtcggatcacaggttcggcgctggcgaatcggtgat240cgggtcactgttcccttcgtgtgtgcctgtggtttttgccctcagtgtcaggccggtcag300caacaggtgtgtgacaaccagtttcaaccgggattcacgcattggggatcgtttgctgaa360tacgttgccattgatcgcgccgatctgaatctggtgcgcttgcctgccgatatgagcttc420acgactgccgccagtctggggtgtcgttttgcaactgcctttcgcgccgtcgttgatttg480ggccaggtacgtggaggcgagtgggtggcggtttacgggtgtggtggcgttggtctctcg540gcgattatgttagcctctgccctcggtggacaggtgatcggaatcgatattaacctggaa600cggctggcactggctcgggcggtaggggcaacggcggtgattgatgccactaccgaaccg660gatgtggtaagcgtggttcgcgatctcagccgcggtggggtacacctcgcgattgatgcg720ttgggtagtcctatgacctgcgccaatgccattgccagtctgcggaagcgcgggcgccat780gtgcaggttggtctgctgctggccgaccaacggatgcctccgttgccgatggatatcgtg840gttgcgcgtgagttgacgattatgggaagccatgggatgcaggcttaccgctatgatgcg900atgctcgacctcatccagtctggcaaagtacaaccgcagcgcctgattggccgcacgatt960agcctgagtgaagcaccggcggcgctggtcgatctcgatagtttccgtggttctggggtg1020acggtgattacagagtttcagggttag1047<210>69<211>768<212>dna<213>来源于枯草芽孢杆菌（b.subtilis168）的乙酰乳酸脱羧酶基因alsd<400>69atgaaacgagaaagcaacattcaagtgctcagccgtggtcaaaaagatcagcctgtgagc60cagatttatcaagtatcaacaatgacttctctattagacggagtatatgacggagatttt120gaactgtcagagattccgaaatatggagacttcggtatcggaacctttaacaagcttgac180ggagagctgattgggtttgacggcgaattttaccgtcttcgctcagacggaaccgcgaca240ccggtccaaaatggagaccgttcaccgttctgttcatttacgttctttacaccggacatg300acgcacaaaattgatgcgaaaatgacacgcgaagactttgaaaaagagatcaacagcatg360ctgccaagcagaaacttattttatgcaattcgcattgacggattgtttaaaaaggtgcag420acaagaacagtagaacttcaagaaaaaccttacgtgccaatggttgaagcggtcaaaaca480cagccgattttcaacttcgacaacgtgagaggaacgattgtaggtttcttgacaccagct540tatgcaaacggaatcgccgtttctggctatcacctgcacttcattgacgaaggacgcaat600tcaggcggacacgtttttgactatgtgcttgaggattgcacggttacgatttctcaaaaa660atgaacatgaatctcagacttccgaacacagcggatttctttaatgcgaatctggataac720cctgattttgcgaaagatatcgaaacaactgaaggaagccctgaataa768<210>70<211>15<212>dna<213>rbs序列<400>70aggaggttagttaga15当前第1页12