靶向肿瘤的珠载体及其使用方法与流程

本申请要求2016年8月17日提交的美国临时申请号62/376,033的权益和优先权，其内容通过引用整体并入本文。

发明领域

本公开文本总体上涉及癌症治疗领域，并且特别涉及使用单核细胞特异性珠载体的靶向癌症治疗。本公开文本提供了通过激活肿瘤相关巨噬细胞以表达程序性死亡蛋白1(pd-1)的细胞外结构域或抗检查点蛋白抗体或其结合片段(例如与细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla4)结合的单结构域抗体)来有效治疗肿瘤的组合物和方法。

背景技术：

仅提供以下讨论以帮助读者理解本公开文本，并且不承认其描述或构成针对其的现有技术。

单核细胞通常在体内巡逻以寻找外来的非自身抗原，例如细菌。单核细胞吞噬细菌，然后将其消化成溶酶体中较小的抗原部分。得到的细菌抗原循环回到这些细胞的细胞表面，以呈递给免疫系统的体液和细胞武器。

单核细胞在从血流迁移到特定组织后可以分化成巨噬细胞或树突细胞。重要的是，许多实体瘤在肿瘤床内存在大量巨噬细胞。这些肿瘤相关巨噬细胞(tam)被吸引到肿瘤的缺氧和/或坏死微环境中，在那里它们可以通过各种途径(例如核因子-κb(nf-κb)的激活和促血管生成信号(例如vegf)的释放)促进肿瘤生长和进展。

因此，按以下方式利用tam将是有益的，即通过使它们表达治疗性蛋白质来逆转它们固有的促肿瘤活性。

技术实现要素：

本文描述了使用单核细胞特异性珠载体处理肿瘤以指导治疗性蛋白表达的组合物和方法。

在一方面，本公开文本提供珠载体，其包含(i)编码pd-1细胞外结构域或结合细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla4)的单结构域抗体的核酸，(ii)溶酶体归避组分，和(iii)能被吞噬的珠颗粒。

另一方面，本公开文本提供用于定向进入单核细胞的珠载体，其包含(i)编码pd-1细胞外结构域或结合ctla4的单结构域抗体的核酸，(ii)溶酶体归避组分，和(iii)约0.5至约2.5微米并允许组合物被单核细胞吞噬的珠颗粒。

另一方面，本公开文本提供了治疗患者癌症的方法，该方法包括向患有癌症的患者给予珠载体，该珠载体包含(i)编码pd-1细胞外结构域或结合ctla4的单结构域抗体的核酸，(ii)溶酶体归避组分，和(iii)约0.5至约2.5微米的珠颗粒(例如酵母细胞壁颗粒)，其中给予该珠载体治疗该患者的癌症。

另一方面，本公开文本提供珠颗粒载体，其包含(i)编码抗检查点蛋白抗体或其结合片段的核酸，(ii)溶酶体归避组分，和(iii)能被吞噬的珠颗粒。

另一方面，本公开文本提供了用于定向进入单核细胞的珠载体，其包含(i)编码抗检查点蛋白抗体或其结合片段的核酸，(ii)溶酶体归避组分，和(iii)约0.5至约2.5微米并允许组合物被单核细胞吞噬的珠颗粒。

另一方面，本公开文本提供了治疗患者癌症的方法，该方法包括向患有癌症的患者给予珠载体，该珠载体包含(i)编码抗检查点蛋白抗体或其结合片段的核酸，(ii)溶酶体归避组分，和(iii)约0.5至约2.5微米的珠颗粒(例如酵母细胞壁颗粒)，其中给予该珠载体治疗该患者的癌症。

在一些实施方案中，溶酶体归避组分可以是非感染性病毒或病毒的非感染性组分。例如，非感染性病毒可以是腺病毒或重组腺病毒。另外，在一些实施方案中，非感染性病毒或病毒的非感染性组分可以是非复制性的。

在一些实施方案中，编码pd-1细胞外结构域或结合ctla4的单结构域抗体的核酸可以选自dna和rna。在一些方面，抗检查点蛋白抗体或其结合片段是抗pd-l1抗体或其结合片段，而在一些实施方案中，抗检查点蛋白抗体是抗ctla4抗体或其结合片段。在一些实施方案中，抗检查点抗体可以是单结构域抗体。

在一些实施方案中，pd-1细胞外结构域包含哺乳动物pd-1细胞外结构域，如人或鼠pd-1细胞外结构域。

在一些实施方案中，编码pd-1细胞外结构域、结合ctla4的单结构域抗体、或抗检查点蛋白抗体或其结合片段的核酸可以在表达载体中被编码。在一些实施方案中，表达载体可包含核启动子，如cmv启动子。在一些实施方案中，表达载体可包含缺氧诱导的启动子，如hrex3+basalsv40启动子的嵌合启动子。在一些实施方案中，表达载体可包含t7启动子、fsv非结构蛋白基因和/或fsv亚基因组启动子。

在一些实施方案中，珠载体可包含核酸保护组分，例如鱼精蛋白、聚精氨酸、聚赖氨酸、组蛋白、组蛋白样蛋白、合成聚阳离子聚合物或具有包括在核酸序列(例如，dna或rna序列)中的适当包装序列的病毒的核心颗粒。

在一些实施方案中，编码pd-1细胞外结构域、结合ctla4的单结构域抗体、或抗检查点蛋白抗体或其结合片段的核酸和溶酶体归避组分可通过链霉抗生物素蛋白和生物素之间的相互作用连接至珠颗粒。在一些实施方案中，编码pd-1细胞外结构域、结合ctla4的单结构域抗体、或抗检查点蛋白抗体或其结合片段的核酸和溶酶体归避组分可通过抗体连接与珠颗粒连接。

在一些实施方案中，珠颗粒可包含铁磁性颗粒、微珠、微球或酵母细胞壁颗粒(ycwp)。

在一些实施方案中，吞噬珠载体的单核细胞是巨噬细胞，例如肿瘤相关巨噬细胞(tam)。

在一些实施方案中，所治疗的癌症表达pd-1配体或ctla4。并且在一些实施方案中，癌症包含至少一种可具有缺氧微环境的肿瘤，并且还可包含肿瘤相关巨噬细胞(tam)。

在一些实施方案中，所公开的珠载体是皮内或皮下给予的。例如，在一些实施方案中，所公开的珠载体可以在靶淋巴结(即，最接近待治疗的肿瘤的淋巴结)附近皮内或皮下给予。

前面的一般描述和以下的详细描述是示例性和说明性的，而非对本公开文本的限制。

附图说明

图1显示了人pd-1(a)和鼠pd-1(b)的全长氨基酸序列。每种蛋白质的细胞外结构域以粗体表示。

图2显示了用于表达小鼠pd-1胞外域的示例性病毒进入载体。

图3显示了用于将重组病毒载体连接到珠颗粒上以形成示例性珠颗粒载体递送系统的示例性逐步方案。

图4显示了用于产生重组病毒颗粒以连接至所公开的珠颗粒的示例性逐步方案。

图5显示肿瘤内注射对照颗粒(用于表达gfp)和用于表达pd-1细胞外结构域的颗粒后具有b16鼠黑素瘤异种移植物的小鼠的肿瘤体积。

图6显示了在单次肿瘤内注射对照颗粒(用于表达gfp)和用于表达pd-1细胞外结构域的颗粒后四周具有b16黑素瘤异种移植物的示例性小鼠。图(a)中的小鼠是对照小鼠，而图(b)中的小鼠接受用于表达pd-1细胞外结构域的珠颗粒。

图7显示了用于表达抗ctla4单结构域抗体的示例性载体。

图8显示了用于表达抗ctla4单结构域抗体的示例性载体的全长序列。

具体实施方式

通常，本公开文本提供了新的靶向基因递送载体和使用它们的方法。特别地，本公开文本提供了基于珠或酵母细胞壁颗粒(ycwp)的递送载体，其用于表达结合ctla4的单结构域抗体或用于在肿瘤相关巨噬细胞(tam)细胞和肿瘤的微环境中表达pd-1的胞外域或细胞外结构域，并且可以通过肿瘤微环境中的缺氧诱导抗体或pd-1胞外域或细胞外结构域的表达。

贯穿本公开文本，各种出版物、专利和公开的专利说明书通过识别引用来引用。特此将这些出版物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用结合到本公开文本中，以更全面地描述本公开文本所属领域的现有技术。

定义

除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。可以使用本领域普通技术人员已知的任何合适的材料和/或方法来实施本文所述的方法。

如本文所用，术语“约”将为本领域普通技术人员所理解，并且在某种程度上取决于其使用的上下文而变化。如果该术语的使用在本领域普通技术人员使用的上下文中是不明确的，则“约”将意味着高达特定术语的正负10％。

如本文所用，术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”应意指排除对组合物或方法具有任何重要意义的其他元素。“由……组成”是指对于要求保护的组合物和实质方法步骤排除微量要素的其他成分。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本公开文本的范围内。因此，意图是该方法和组合物可以包括另外的步骤和组分(包含)或者可替代地包括不重要的步骤和组合物(基本上由……组成)或者可替代地仅包括所述方法步骤或组合物(由……组成)。

如本文所用，短语“治疗有效量”是指所公开的珠颗粒的剂量提供特定的药理学作用，为此在需要这种治疗的受试者中给予药物，即以减少、改善或消除癌症/肿瘤生长、进展或复发。需要强调的是，治疗有效量的珠颗粒(即使这种剂量被本领域技术人员认为是治疗有效量)，在治疗每个个体受试者的癌症/肿瘤的过程中，也并不总是有效的。本领域技术人员可以根据治疗特定受试者和/或特定类型的癌症或肿瘤所需的标准实践来调整被认为的物质的治疗有效量。治疗有效量可以基于给予途径和剂型、受试者的年龄和体重和/或受试者的状况(包括治疗时癌症或肿瘤的进展、阶段和/或类别)而变化。

本文所用的关于癌症或肿瘤的术语“治疗(treatment或treating)”是指减少、改善或消除癌症/肿瘤生长和/或进展，或引起癌/肿瘤细胞死亡。

本文所用的术语“预防(prevent或preventing)”是指停止癌/肿瘤细胞的形成或抑制癌/肿瘤生长的复发。

术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且指任何个体哺乳动物受试者，例如，牛、犬、猫、马或人。

本发明的组合物和方法可适当地在不存在本文未文本具体公开的任何要素、限制的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被可扩张地阅读而不受限制。另外，本文采用的术语和表达已经被用作说明的术语并且没有限制性，并且并非旨在使用此类术语以及表达而将本发明示出或描述的特征的任何等效物或其一部分排除在外，但是将认识到的是提出要求保护的公开文本的范围之内的不同修改是有可能的。

程序性死亡蛋白-1(pd-1)

pd-1是50-55kda的i型跨膜受体，其最初在经历活化诱导的细胞凋亡的t细胞系中被鉴定。pd-1在t细胞、b细胞和巨噬细胞上表达。pd-1的配体是b7家族成员pd-l1(b7-h1)和pd-l2(b7-dc)。

pd-1是免疫球蛋白(ig)超家族的成员，其在细胞外区域含有单个igv样结构域。pd-1细胞质结构域含有两个酪氨酸，最接近膜的酪氨酸(小鼠pd-1中的vayeel)位于itim(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)内。在pd-1上存在itim表明该分子通过募集细胞质磷酸酶来减弱抗原受体信号传导。

实验数据暗示pd-1与其配体在中枢和外周免疫应答的下调中的相互作用。

本公开文本提供了通过改造肿瘤相关巨噬细胞(tam)来产生和分泌pd-1的细胞外结构域来激活免疫系统的组合物和方法。肿瘤床内pd-1细胞外结构域的表达可竞争性地阻断肿瘤表面上的所有pd-1配体(即，pd-l1和pd-l2)。在这样做时，所公开的组合物和方法引起强烈的肿瘤特异性肿瘤内检查点抑制，其导致肿瘤的破坏和疾病的治疗。

细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla4)

ctla4，也称为cd152(分化簇152)，是一种蛋白质受体，通过作为免疫检查点起作用来下调免疫应答。ctla4在treg中组成型表达，但在激活后仅在常规t细胞中上调。当与抗原呈递细胞表面上的cd80或cd86结合时，它充当“关闭”开关。ctla4蛋白由小鼠中的ctla4基因和人中的ctla4基因编码。

ctla4与t细胞共刺激蛋白cd28同源，并且两种分子在抗原呈递细胞上分别与cd80和cd86(也称为b7-1和b7-2)结合。ctla4以比cd28更大的亲和力和亲合力结合cd80和cd86，因此使其能够胜过cd28结合其配体。ctla4向t细胞传递抑制信号，而cd28传递刺激信号。ctla4也在调节性t细胞中发现并有助于其抑制功能。通过t细胞受体和cd28的t细胞激活导致ctla4的表达增加。

ctla4在t细胞中起作用的机制仍然存在争议。生化证据表明，ctla4为t细胞受体(tcr)募集磷酸酶，从而减弱信号。最近的研究表明，ctla4可以通过从抗原呈递细胞的膜中捕获和去除b7-1和b7-2而在体内起作用，从而使得它们不能用于触发cd28。

另外，已经发现，树突细胞(dc)-treg相互作用引起肌成束蛋白-1的隔离，并且使抗原呈递dc中的肌成束蛋白-1依赖性肌动蛋白极化偏向treg细胞粘附区。虽然它在t调节细胞脱离后是可逆的，但是这种必需的细胞骨架组分的隔离导致dc的慢化状态，导致t细胞引发减少。这表明treg介导的免疫抑制是一个多步骤的过程。除ctla-4cd80/cd86相互作用外，细胞骨架朝向dc-treg免疫突触的肌成束蛋白依赖性极化可能起关键作用。

本公开文本提供了通过改造肿瘤相关巨噬细胞(tam)来产生和分泌结合ctla4的抗体(特别是单结构域抗体)来激活免疫系统的组合物和方法。肿瘤床内抗ctla4抗体的表达可以竞争性地阻断ctla4的所有配体与肿瘤表面上的受体结合。在这样做时，所公开的组合物和方法引起强烈的肿瘤特异性肿瘤内检查点抑制，其导致肿瘤的破坏和疾病的治疗。

珠载体

本公开文本提供了用于定向进入单核细胞的基于固体基质的组合物(下文称为“珠载体”)。根据本公开文本的基础珠颗粒载体通常由核酸组分、溶酶体归避组分和可被单核细胞吞噬的珠颗粒组成。珠载体对单核细胞如包括树突细胞和巨噬细胞在内的吞噬细胞具有高度特异性。这种对单核细胞的高选择性使得珠载体对基因治疗和其他基因医学方法(需要将基因导入和表达到单核细胞谱系的细胞中，例如癌症治疗)非常有用。

本文使用的珠载体的基本结构公开在美国专利6,875,612中，该专利在此引入作为参考。

珠颗粒

所公开的珠载体通过“看起来”像细菌而利用单核细胞的吞噬活性。因此，珠颗粒的优选大小是接近单核细胞通常摄取的细菌抗原大小的大小。通常，载体颗粒为约0.5至约2.5微米，或约0.5至约1微米。因此，载体颗粒可以是约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4或约2.5微米。

从摄取的角度来看，范围的较小端是优选的，因为它更接近细菌的大小。另一方面，出于制造目的，稍微更大的珠是优选的，因为它们不太可能粘在一起，因此使用较大的珠更容易从结合的组分中洗涤。

此外，珠颗粒不受形状或材料的限制。珠颗粒可以是任何形状、大小或材料，其允许珠颗粒载体被单核细胞吞噬。

例如，珠颗粒可包括被聚合物涂层覆盖的铁磁中心。潜在有用的铁磁颗粒包括但不限于微珠、微球和硅酸盐珠。这种珠在某些应用中可能是优选的，因为在加工过程中可以采用磁分离来从珠结合的组分中分离出来。然而，用于所公开的珠颗粒载体的珠颗粒不限于特定类型的材料，并且可以由合成材料如聚苯乙烯或其他塑料以及生物材料制成。

可适合作为珠颗粒的其他颗粒包括酵母细胞壁颗粒(ycwp)，例如酵母葡聚糖颗粒。ycwp在所公开的珠载体中可能是特别有益的，因为它们可以包含β-葡聚糖，其促进巨噬细胞对颗粒的吞噬作用。

可以从酵母细胞壁制备ycwp，使得颗粒对于各种大分子的递送是多孔的。在一个实施方案中，ycwp可以从酿酒酵母制备。在另一个实施方案中，ycwp可以是酵母聚糖颗粒。在另一个实施方案中，ycwp近似于单核吞噬细胞系统的细胞和其他吞噬细胞通常摄取的微生物结构(例如，细菌)的大小。在具体实施方案中，ycwp可为约1-5μm。

在一些实施方案中，ycwp可以通过(a)悬浮酵母以产生悬浮液，(b)孵育悬浮液，(c)离心悬浮液并除去上清液和(d)回收所得ycwp来制备。在一些实施方案中，步骤(a)-(d)重复至少1、2、3或4次。

在一些实施方案中，ycwp可以通过以下方法制备：(a)将酵母悬浮在溶液中以产生第一悬浮液，(b)孵育第一悬浮液，(c)离心第一悬浮液并除去上清液，(d)悬浮所得的沉淀以产生第二悬浮液，(e)孵育第二悬浮液，(f)离心第二悬浮液并除去上清液，和(g)洗涤所得沉淀物以回收ycwp。在一些实施方案中，ycwp是经过灭菌的。

在一些实施方案中，将酵母悬浮在naoh中(包括1mnaoh)。在一些实施方案中，将第一悬浮液在约80℃下温育约1小时或1小时。在一些实施方案中，离心在约2000倍重力下进行约10分钟，或在2000倍重力下进行10分钟。在一些实施方案中，将沉淀物悬浮在水中，包括约ph4.5或ph4.5的水。在一些实施方案中，将第二悬浮液在约55℃下温育约1小时或在55℃下温育1小时。在一些实施方案中，将沉淀在水中洗涤至少1、2、3或4次。在一些实施方案中，将沉淀洗涤一次。

在一些实施方案中，在洗涤沉淀后使用异丙醇和/或丙酮对ycwp进行灭菌。在具体实施方案中，其他已知的醇是合适的。在一些实施方案中，允许ycwp在灭菌后完全干燥。在一些实施方案中，在允许干燥后重悬ycwp。在一些实施方案中，ycwp是pbs例如1xpbs中的一些。在一些实施方案中，使ycwp干燥，然后在将肿瘤裂解物加载到ycwp中之前冷冻，以便在使用前将其置于储存。在一些实施方案中，将ycwp冷冻干燥并储存在约4℃或更低的温度下。在一些实施方案中，将ycwp冷冻干燥并储存在4℃中。

核酸组分

本公开文本的基础珠载体可以附着有核酸组分。核酸组分通常编码治疗性核酸或蛋白质。核酸组分由dna、rna或dna和rna组成。该组分通常含有翻译和/或转录所必需的信号(即，它可以编码可以在靶细胞上表达或由靶细胞分泌的蛋白质或rna产物)。

本领域技术人员将理解可以在本发明的载体系统中使用的大量治疗性蛋白质。通常，它们将是抗肿瘤蛋白质。例如，在一些实施方案中，核酸组分将编码pd-1的细胞外结构域。pd-1细胞外结构域可以来自人(np_005009、nm_005018)、小鼠(np_032824、nm_008798)、牛(np_001277851、nm_001290922)或其他动物来源。本领域技术人员将能够鉴定合适的pd-1细胞外结构域。例如，人pd-1的长度为288个氨基酸，氨基酸14-130代表细胞外结构域，而鼠pd-1也是288个氨基酸，而氨基酸21-169代表细胞外结构域(见图1)。

在一些实施方案中，核酸组分将编码抗ctla4抗体，特别地，其可编码结合ctla4的单结构域(即短链)抗体(如图7中所示)。本领域已知许多抗ctla4抗体，包括但不限于伊匹单抗(ipilimumab)和替西木单抗(tremelimumab)，并且本领域技术人员将容易理解如何在公开的珠载体中表达这些抗体或包含这些抗体的可变区的单结构域抗体。一种示例性抗ctla4抗体公开于us2011/0044953中，其通过引用并入本文，并且用于表达该抗体的单结构域形式的表达载体的序列示于图8中。

可替代地，在一些实施方案中，核酸组分可以编码对免疫检查点蛋白特异的抗体或其结合片段。免疫检查点是抑制途径，其在正常条件下对于维持自身耐受性和调节外周组织中生理免疫应答的持续时间和幅度是至关重要的，以便使得响应于病原性感染的附带组织损伤最小化。然而，免疫检查点蛋白的表达经常被肿瘤失调，作为重要的免疫抗性和逃逸机制。

因为许多免疫检查点是由配体-受体相互作用引发的，所以它们可以容易地被对检查点配体和/或受体特异的抗体或结合片段阻断。因此，所公开的珠载体的核酸组分可以表达对检查点蛋白特异的抗体或其结合片段，包括但不限于表1中所示的那些蛋白质。

靶向检查点蛋白的抗体或其结合片段没有特别限制。例如，由核酸组分编码的抗体或结合片段可以是人的、嵌合的、人源的或非人(例如小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、牛、猪等)的。抗体可以是igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、ige或igm，或其变体或片段。

可用于所公开的珠载体和方法的抗检查点蛋白抗体序列可通过任何方式获得，包括通过体外来源(例如，杂交瘤或重组产生抗体的细胞系)和体内来源。人的、部分人源化的、完全人源化的和嵌合抗体可以由核酸组分表达。

通常，抗体由四种多肽组成：重(h)链多肽的两个相同拷贝和轻(l)链多肽的两个拷贝。通常，每条重链含有一个n端可变区(vh)和三个c端恒定区(ch1、ch2和ch3)，每条轻链含有一个n端可变区(vl)和一个c端恒定区(cl)。每对轻链和重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。

然而，在一些实施方案中，核酸组分可以编码结合片段，而不是整个抗体。如本文所用，结合片段是指保留结合靶蛋白的能力的抗检查点蛋白抗体的一个或多个片段。结合片段的例子包括(i)fab片段(由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段)；(ii)f(ab′)2片段(包含在铰链区通过二硫键连接的两个fab片段的二价片段)；(iii)fd片段(包含vh和ch1结构域)；(iv)fv片段(包含抗体单臂的vl和vh结构域)；(v)dab片段(包含vh结构域)；(vi)分离的互补决定区(cdr)，例如vhcdr3。结合片段的其他例子包括单链fv(scfv)构建体。参见例如，bird等人,science,242:423-26(1988)；huston等人,proc.natl.acad.sci.usa,85:5879-83(1988)。

在一些实施方案中，核酸组分可以编码单结构域抗体，其包含单个单体可变抗体结构域。单结构域抗体的分子量仅为12-15kda，远小于普通抗体(150-160kda)，它们由两条重蛋白链和两条轻链组成，甚至小于fab片段(约50kda，一条轻链和一条重链)和单链可变片段(约25kda，两个可变结构域，一个来自轻链，一个来自重链)。这种“单结构域抗体”首先从骆驼科动物中发现的重链抗体进行改造，并且被称为vhh片段，但这些抗体也可以重组表达。

因此，在一些实施方案中，所公开的珠载体的核酸组分可包含用于表达抗pd-l1抗体或其结合片段、抗ctla4抗体或其结合片段、或对表1中公开的任何一种检查点蛋白特异的另一种抗体或其结合片段的序列。

在一些实施方案中，核酸组分在表达载体中被编码，该表达载体能够表达核酸组分的rna和/或蛋白质产物。编码的蛋白质产物可以在靶细胞上表达或从靶细胞分泌。载体通常还包含调控序列，包括例如与编码序列可操作连接的启动子。载体可以进一步包含选择性标记序列，例如用于在体外细菌或细胞培养系统中繁殖。

优选的表达载体包含复制起点、合适的启动子和增强子、以及任何必需的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5'侧翼非转录序列。衍生自sv40的dna序列或巨细胞病毒(cmv)病毒基因组(例如sv40起点、早期启动子、增强子、剪接和多腺苷酸化位点)可用于提供所需的非转录遗传元件。示例性病毒进入载体显示在图2和7中。在一些实施方案中，启动子可以是t7启动子。

为了有效翻译插入的靶基因编码序列，也可能需要特定的起始信号。这些信号可包括atg起始密码子和相邻序列。在一些实施方案中，核酸组分包括其自身的起始密码子，并且可以将相邻序列插入合适的表达载体中，并且可以不需要额外的翻译控制信号。然而，在一些实施方案中，仅使用开放阅读框(orf)的一部分，并且可以提供外源翻译控制信号，包括例如atg起始密码子。此外，起始密码子可以与所需编码序列的阅读框同相，以确保整个靶标的翻译。

这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然和合成的多种来源。通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等可以提高表达效率。(参见bittner等人,methodsinenzymol.153:516-544(1987))。一些合适的表达载体由sambrook等人在molecularcloning：alaboratorymanual,第二版,冷泉港,纽约(1989)中描述，其公开内容在此引入作为参考。如果需要，为了增强表达并促进适当的蛋白质折叠，可以优化序列的密码子上下文和密码子配对，如hatfield等人，美国专利号5,082,767所述。

启动子包括cmv立即早期、hsv胸苷激酶、早期和晚期sv40、来自逆转录病毒的ltr和小鼠金属硫蛋白-i。优选的启动子是cmv。示例性载体包括pwlneo、psv2cat、pog44、pxt1、psg(stratagene)psvk3、pbpv、pmsg和psvl(pharmacia)。选择性标记包括cat(氯霉素转移酶)。优选的载体还包括细胞质载体，如t7载体系统。参见wagner等人，美国专利号5,591,601(1997年1月7日)。

在一些实施方案中，载体可另外包含其他功能序列，例如fsv非结构蛋白基因和/或fsv亚基因组启动子，如图7中所示。

在一些实施方案中，启动子可以是诱导型的。诱导型启动子可操作地将靶基因(例如，pd-1胞外域或抗ctla4抗体)的表达与特定信号或特定生物或非生物因子的表达联系起来。可以在公开的表达系统中使用的诱导型启动子的类型包括但不限于化学诱导型启动子(即，抗生素、类固醇、金属等)、光诱导型启动子、热诱导型启动子、和缺氧诱导型启动子。

在一些实施方案中，靶基因(例如，pd-1胞外域或抗ctla4抗体)的转录可以通过缺氧诱导型启动子控制。缺氧条件下基因表达的转录调控可以通过缺氧诱导因子1(hif1)介导。hif1与启动子的增强子序列中的hif1应答元件(hre)结合导致基因表达。已发现几种基因启动子是缺氧诱导的，包括但不限于促红细胞生成素基因，磷酸甘油酸激酶-1和vegf(thejournalofexperimentalbiology201,1153-1162,1998)。

由于天然启动子受多种转录因子调节，因此可以制备对缺氧更具特异性的嵌合启动子(genetherapy(2002)9,1403-1411)。因此，在一些实施方案中，嵌合启动子可以用无增强基础病毒启动子(例如sv40和cmv)以及几个hre拷贝构建。例如，在一些实施方案中，所公开的表达系统可包含hrex3+basalsv40启动子的嵌合启动子。

将缺氧诱导型启动子掺入所公开的珠载体的核酸组分中可以增加肿瘤靶向，因为肿瘤的微环境通常是健康体内唯一的缺氧环境。因此，如果公开的珠载体全身性地给予于受试者并且被循环中的单核细胞吞噬，则直到单核细胞已经渗入肿瘤床并暴露于缺氧条件时核酸组分才表达一个或多个靶基因。这将导致靶向肿瘤的核酸组分的表达。

溶酶体归避组分

除了珠颗粒和核酸组分之外，本公开文本的珠载体还可以包含溶酶体归避组分。溶酶体归避组分相对于珠载体的作用是在单核细胞吞噬作用后帮助载体躲避溶酶体的恶劣环境。除了本文公开的那些之外，本领域普通技术人员将意识到可以用作溶酶体归避组分的许多分子。

当单核细胞摄取大抗原时，形成吞噬抗原的吞噬囊泡(吞噬体)。接下来，单核细胞中含有的特化溶酶体与新形成的吞噬体融合。融合后，吞噬的抗原暴露于几种高反应性分子以及溶酶体水解酶的浓缩混合物。这些高反应性分子和溶酶体水解酶消化吞噬体的内容物。因此，通过将溶酶体归避组分连接到颗粒上，也连接在颗粒上的核酸逃脱溶酶体中的物质的消化并完整地进入单核细胞的细胞质。现有系统未能认识到该特征的重要性，因此获得比本公开文本的表达系统低得多的表达水平。参见falo等人，wo97/11605(1997)。应注意，术语“溶酶体归避组分”包括上述融合的溶酶体/吞噬体。

溶酶体归避组分是能够躲避或破坏溶酶体的任何组分。例如，溶酶体归避组分可包括蛋白质、碳水化合物、脂质、脂肪酸、仿生聚合物、微生物及其组合。应注意，术语“蛋白质”包括含有任何数量氨基酸的聚合物分子。因此，本领域普通技术人员会知道“蛋白质”包括肽，其通常被理解为“短”蛋白质。在一些实施方案中，溶酶体归避组分包括但不限于蛋白质、病毒或病毒的部分。

在一些实施方案中，溶酶体归避组分是表达靶基因或组分编码的基因的病毒。病毒可以是rna病毒(如逆转录病毒)或dna病毒(如腺病毒)。在一些实施方案中，病毒可以是重组的和/或非复制性的和/或非感染性的。本领域技术人员将知道使病毒具有非复制性和/或非感染性的常用方法。

在一些实施方案中，溶酶体归避组分可包含特异性病毒蛋白。例如，腺病毒五邻体蛋白是使病毒能够躲避/破坏溶酶体/吞噬体的复合物。因此，完整的腺病毒或分离的五邻体蛋白或其部分(参见，例如，bal等人,eurjbiochem267:6074-81(2000))可用作溶酶体归避组分。在一些实施方案中，衍生自流感病毒血凝素亚基ha-2的n-末端序列的融合肽也可用作溶酶体归避组分(wagner等人,proc.natl.acad.sci.usa,89:7934-7938,1992)。

其他溶酶体归避组分包括但不限于仿生聚合物，例如聚(2-丙基丙烯酸)(ppaac)，由于含有目的质粒的缀合物的内体释放增强，已证明其可增强细胞转染效率(参见lackey等人，abstractsofscientificpresentations:thethirdannualmeetingoftheamericansocietyofgenetherapy,摘要号33,2000年5月31日-2000年6月4日,丹佛市,科罗拉多州)本发明所设想的其他溶酶体归避组分的例子在stayton等人j.controlrelease,1；65(1-2):203-20,2000中被讨论。

除了上述组分之外，本公开文本的珠载体还可以包含直接或通过彼此连接的核酸保护组分(例如，编码核酸组分的重组腺病毒)。例如，可以任选地将dna保护组分添加到上述碱基础珠载体中，特别是在核酸组分不与病毒或其部分缔合的情况下。通常，dna保护组分不会直接连接在珠颗粒上。核酸保护组分包括在溶酶体破坏之前或期间短暂暴露于裂解酶期间可以保护珠结合的dna或rna免于消化的任何组分。在一些实施方案中，核酸保护组分包括但不限于鱼精蛋白、聚精氨酸、聚赖氨酸、组蛋白、组蛋白样蛋白、合成聚阳离子聚合物和逆转录病毒的核心蛋白、合成聚阳离子聚合物或具有包括在核酸序列(即dna或rna序列)中的适当包装序列的逆转录病毒的核心颗粒。

在本公开文本的一些实施方案中，核酸保护组分包含(1)任选地非复制性和/或非感染性的重组病毒形式，其含有编码抗原或治疗基因的核酸，该核酸与能被吞噬的珠颗粒连接。病毒可以是rna病毒(如逆转录病毒)或dna病毒(如腺病毒)。在一些实施方案中，病毒本身可能能够溶酶体破坏。因此，核酸保护组分和溶酶体归避组分都是连接在珠颗粒上的病毒的组分。可替代地，病毒可能不能溶酶体破坏。在这种情况下，可以添加单独的溶酶体归避组分。优选的病毒包括hiv、腺病毒、辛德毕斯病毒及其杂合和重组形式，例如hiv-腺病毒杂交体，其基本上是已被工程化以表达hiv抗原的重组腺病毒。病毒可以使用常规方法直接连接在珠上，也可以间接连接在珠上。参见hammond等人,virology254:37-49(1999)。

例如，在一些实施方案中，靶核酸可以在重组腺病毒中递送，该重组腺病毒通过生物素-链霉抗生物素蛋白连接与珠载体缀合。可以修饰珠颗粒以连接包含链霉抗生物素蛋白的接头，并且可以将重组病毒生物素化，如图3所示。

因为病毒感染对于公开的珠载体的核苷酸组分到达单核细胞的细胞质不是必需的，所以病毒也可以是复制/感染缺陷的。例如，可以通过改变病毒纤维蛋白来实现一种产生复制/感染缺陷型腺病毒的方法。因此，在一些实施方案中，其中通过特定突变改造纤维蛋白以允许纤维蛋白结合抗体而不结合其同源细胞受体的病毒可用于本公开文本的颗粒中。

产生复制/感染缺陷型病毒的另一种方法是故意引起导致感染性的病毒组分的变性。例如，在腺病毒的情况下，纤维蛋白可能在病毒制备过程中被破坏。对于hiv，这可能包括包膜(env)蛋白。因此，在一些实施方案中，用于产生感染缺陷型病毒以连接于所公开的珠颗粒的方法包括除去病毒的外膜以便仅保留病毒核心。如果如上所述制备的复制/感染缺陷型病毒连接于珠颗粒，则如上所述的核酸保护组分也可以连接于该颗粒。

在一些实施方案中，载体稳定整合到靶细胞染色体中可能是有益的。例如，实现稳定整合的一种模式是通过使用腺病毒杂交体。这种腺病毒杂交体可包括，例如，携带逆转录病毒5'和3'长末端重复(ltr)序列(位于编码治疗性核酸或蛋白质(例如，pd-1胞外域或抗ctla4抗体)的dna组分的侧翼)和逆转录病毒整合酶基因(参见zheng等人naturebiotechnology,18:176-180,2000)的腺病毒载体。

在一些实施方案中，瞬时表达可能是优选的，因此可以使用细胞质病毒，例如辛德毕斯病毒。

在一些实施方案中，当病毒上没有天然存在溶酶体归避组分时，可以添加一种。例如，在辛德毕斯病毒或其他此类病毒的情况下，可以将病毒工程化以表达全部或部分腺病毒五邻体蛋白，以躲避溶酶体。

将组分连接到颗粒的方法

上述组分与珠载体颗粒的连接可以通过任何已知的方法完成。如上所述，各种组分可包括靶核酸(例如，pd-1胞外域或抗ctla4抗体)，可以同时存在于病毒中的溶酶体归避组分和核酸保护组分。尽管本领域已知许多连接这些组分的方法，但连接的具体方法可包括但不限于抗体连接、生物素-抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白相互作用和化学交联。珠颗粒可以用化学连接的抗体、抗生物素蛋白、生物素或其他选择性连接位点制备。

抗体连接可以通过任何抗体相互作用发生。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mab)、人源化或嵌合抗体、包括单链fv(scfv)片段的单链抗体、fab片段、f(ab')2片段、由fab表达库产生的片段、抗独特型(抗id)抗体、表位结合片段、单结构域抗体和任何上述的人源化形式。

用于制备多克隆和单克隆抗体的技术以及能够产生所需抗体的杂交瘤(campbell,a.m.,monoclonalantibodytechnology:laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology,elseviersciencepublishers,amsterdam,thenetherlands(1984)；st.groth等人,j.immunol.methods35:1-21(1980)；kohler和milstein,nature256:495-497(1975))、三聚体技术、人b细胞杂交瘤技术(kozbor等人,immunologytoday4:72(1983)；cole等人,inmonoclonalantibodiesandcancertherapyalanr.liss,inc.(1985),77-96页)是本领域众所周知的。

所涵盖的抗体连接的一个例子可包括化学附着于珠载体颗粒的单一抗体。抗体对有待连接于颗粒的组分是特异性的。

可替代地，可以使用两种或更多种抗体。在这种情况下，连接于珠的一种抗体可以对第二抗体具有特异性。第二抗体对有待连接于珠的组分是特异性的。因此，组分特异性抗体结合组分，并且该抗体又与珠结合的抗体结合。例如，山羊或兔抗小鼠抗体可与珠结合，小鼠单克隆抗体用于结合特定组分。可替代地，在另一种替代形式中，两种或更多种抗体的每一种都特异于有待连接至颗粒的不同组分，这样颗粒就会被两种或多种不同的组分(即，两种不同的病毒颗粒，两种不同的蛋白质等)所装饰。

在抗体连接的另一个例子中，使用蛋白a或对抗体具有亲和力的任何类似分子。在该实施例中，珠用蛋白质a包被，蛋白质a与抗体结合，然后与连接于珠的组分结合。

通过生物素-抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白相互作用的连接可以通过例如将抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白连接到珠载体颗粒上并将生物素连接到有待连接的组分上来实现。化学交联可以通过技术人员已知的常规方法完成。参见，例如，图3。

另一种连接机制可包括用作多重结合载体的核酸。设计合成的“夹子”蛋白质核酸(pna)寡核苷酸以特异性结合不同的核酸序列。pna是具有肽骨架而不是脱氧核糖磷酸骨架的多核酸类似物。pna可以直接连接在珠上或衍生化以便于连接，从而提供连接核酸的序列特异性手段。每个夹子寡核苷酸可以衍生化或连接到不同的配体或分子上，并设计成结合不同的核酸序列。认为pna通过hoogsteen碱基配对相互作用与dna相互作用，并形成稳定的pna-dna-pna三链体钳(zelphati等人biotechniques,28:304-316,2000)。

因此，在一个实施方案中，使用一个夹子将核酸组分结合到珠上，另一个夹子用于将溶酶体归避组分结合到核酸组分上。许多这样的迭代是可能的。例如，包含生物素的“夹子”可以在一个位点与核酸特异性结合。通过生物素-抗生物素蛋白相互作用发生与包被抗生物素蛋白的颗粒的连接。在核酸上的另一个位点，具有溶酶体/噬菌体归避组分的另一个“夹子”可以是序列特异性结合的。任选地，具有dna保护组分的“夹子”可以是在另一个位点与核酸特异性结合的序列。先前已经描述了示例性的夹子寡核苷酸。

在将病毒连接到珠颗粒上的情况下，这也可以通过改造病毒以在其表面上表达某些蛋白质来实现。例如，hivenv蛋白可以用腺病毒五邻体蛋白或其部分替代。然后可以通过抗五邻体抗体连接重组病毒，例如通过另一种抗体或蛋白a介导与珠的连接。在一些实施方案中，五邻体蛋白也可以作为溶酶体归避组分。

制剂

适用于本文所述方法的药物组合物可包括所公开的珠载体和药学上可接受的载体或稀释剂。

该组合物可以配制用于静脉内、瘤内皮下、腹膜内、肌肉内、口服、鼻、肺、眼、阴道或直肠给予。在一些实施方案中，所公开的珠载体被配制用于静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内给予，例如以溶液、悬浮液、乳液等。在一些实施方案中，所公开的珠载体被配制用于口服给予，例如以适于口服给予的片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂或液体。可以使用本领域已知的技术将药物组合物配制成速释组合物、缓释组合物、延迟释放组合物等。

在一些实施方案中，所公开的珠载体可以配制用于肠胃外给予，例如通过静脉内、肌肉内或皮下注射。用于注射的制剂可以以单位剂型存在(例如在安瓿或多剂量容器中)，任选地添加防腐剂。该组合物可以采取诸如油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂(例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂)。还可以使用药学上可接受的赋形剂配制珠载体。此类赋形剂是本领域熟知的，但通常是生理学上可耐受的水溶液。生理上可耐受的溶液是基本上无毒的溶液。优选的赋形剂可以是惰性的或增强的。

在一些实施方案中，可以将珠载体配制成与另一种治疗剂同时给予。在一些实施方案中，可以将珠载体配制成与另一种治疗剂依次给予。例如，可以在受试者接受化学疗法治疗之前或之后给予珠载体。

治疗方法

本文提供了用所公开的珠载体治疗肿瘤、癌症、恶性疾病或癌细胞增殖的方法。更具体地，本公开文本提供了通过表达pd-1的细胞外结构域或pd-l1特异性抗体或其结合片段来抑制肿瘤/癌细胞中pd-1检查点的方法。类似地，本文提供了通过表达抗ctla4抗体或其结合片段(包括单结构域抗体)来抑制肿瘤/癌细胞中ctla4检查点的方法。在一些实施方案中，所公开的珠载体可用于驱动其他检查点抑制剂的表达，例如对表1中所示的蛋白质靶标特异的抗体或片段。此类方法可包括给予治疗有效量的公开的珠载体，其含有用于表达pd-1细胞外结构域的核酸组分、抗ctla4抗体、或对检查点蛋白特异的抗体或结合片段。

所公开的珠载体对单核细胞(例如，巨噬细胞或tam)具有高度选择性。因此，它适用于涉及选择性地将核酸组分引入单核细胞的任何应用。在一些实施方案中，给予所公开的载体以治疗癌症，特别是实体瘤。典型的方法包括使单核细胞与珠载体接触。由于所公开的珠载体起作用的方式，珠载体的给予不受特别限制。

珠载体可以直接注射到肿瘤中，或者皮内、皮下或全身给予(即，进入受试者的腹膜)。巨噬细胞不断涌入实体瘤中，因此即使是全身吞噬珠颗粒的巨噬细胞仍然可以渗入肿瘤床并起到治疗肿瘤或阻止肿瘤生长的作用。此外，在一些实施方案中，珠载体的核酸组分可以在缺氧诱导的启动子的控制下，在这种情况下，只有吞噬它的单核细胞浸润肿瘤床后才会表达一个或多个靶基因(即，pd-1细胞外结构域、抗ctla4抗体或抗检查点蛋白抗体)。

可替代地或另外地，珠载体可通过在待治疗的肿瘤或癌症附近的淋巴结中表达而一旦被巨噬细胞吞噬就起作用。在这些实施方案中，所公开的珠载体可以在接近最接近的淋巴结(即“靶淋巴结”)的区域内皮内或皮下给予于靶向治疗的肿瘤。在这种意义上，靠近靶淋巴结的给予意味着尽可能地进入或接近靶淋巴结，至少比任何其他淋巴结更接近靶淋巴结。一旦进入靶淋巴结，吞噬珠载体的巨噬细胞将表达核酸以产生pd-1细胞外结构域、抗ctla4抗体或抗检查点蛋白抗体，其将传播至肿瘤部位并抑制肿瘤微环境中的靶向检查点。

所公开的珠载体的这种独特作用机制是对检查点抑制治疗剂的当前状态的显著改进。目前，检查点抑制剂如派姆单抗(pembrolizumab)(凯特鲁达(keytruda))、纳武单抗(nivolumab)(欧狄沃(opdivo))、阿特朱单抗(atezolizumab)(特森组克(tecentriq))和伊匹单抗(ipilimumab)(伊沃伊(yervoy))在治疗各种类型的癌症方面是有效的。然而，这些药物是全身使用的，因此会导致可能危及生命的脱靶效应。实际上，已知检查点抑制剂引起称为免疫相关不良事件(irae)的独特副作用谱，其可包括皮肤病、胃肠道、肝脏、内分泌和其他器官系统效应。所公开的珠载体通过仅在肿瘤微环境内或附近表达编码的检查点抑制剂来防止或最小化这些脱靶效应，从而通过肿瘤靶向降低副作用。如上所述，由于新巨噬细胞不断渗入肿瘤床，所公开的珠载体在全身(例如肠胃外)、皮内、皮下使用或通过将它们直接注射到肿瘤或靶淋巴结中时可产生这些改善的效果。

珠载体可以在体内或体外与单核细胞接触。因此，本文考虑了体内和离体方法。

在一些实施方案中，体内方法包括肠内给予珠载体，例如静脉内、肌肉内、皮下或皮内给予。在一些实施方案中，珠载体被直接注射到肿瘤中。在一些实施方案中，珠载体可以通过推注或连续输注给予。

在一些实施方案中，离体方法包括使体外的单核细胞接触，然后将接触的细胞给予给有需要的患者。细胞也可以胃肠外给予，例如通过输注给药。在离体方法中，与珠载体接触的单核细胞可以是自体的或同种异体的。用于离体方法的单核细胞可以通过已知的白细胞去除术方法从供体或患者(即，有待与所公开的珠载体接触的单核细胞的最终受体)中分离。

所公开的珠载体可以直接注射到患者体内，但仍然能够将一个或多个靶基因(即pd-1胞外域、抗ctla4抗体或抗检查点蛋白抗体)递送到身体的单核细胞中以达到治疗癌症的目的，例如tam。靶向这些细胞的现有方法主要依赖于分离的患者的单核细胞并在体外对它们进行操作，然后将细胞送回患者体内。尽管在本公开文本中考虑了这样的实施方案，但是所公开的珠载体提供了实质性的改善，因为它们可以用于体内和离体方法。此外，改变给予途径可以改变靶向的单核细胞。例如，在静脉内注射的情况下，可以靶向巨噬细胞，并且在皮下注射的情况下，可以靶向树突细胞。

因此，在一些实施方案中，使用所公开的珠载体将pd-1胞外域或抗ctla4抗体的基因表达靶向单核细胞谱系对于癌症治疗是有效的。本公开文本涵盖的一种类型的癌症治疗涉及将pd-1胞外域或抗ctla4抗体的表达靶向实体瘤。在一些实施方案中，使用所公开的珠载体将抗检查点蛋白抗体(即抗-pd-l1抗体或抗ctla4抗体)的基因表达靶向单核细胞谱系对于癌症治疗是有效的。

已知的是，随着肿瘤(原发性肿瘤和转移瘤等)的直径增长超过几毫米并且缺氧，在肿瘤内产生缺氧微环境。当这样的肿瘤变得缺氧时，它们分泌信号蛋白(例如血管生成因子)以增加进入肿瘤缺氧区域的血液供应。

作为血管生成诱导机制的一部分，缺氧肿瘤分泌信号趋化因子蛋白，其吸引单核细胞进入肿瘤。吸引到肿瘤生长部位的单核细胞然后变成巨噬细胞并有助于诱导肿瘤血管生成。因此，肿瘤靶向的有效方法包括直接或通过离体接触单核细胞向癌症患者给予治疗有效量的含有pd-1胞外域序列、抗ctla4抗体或抗检查点蛋白抗体序列的珠载体。含有吞噬的珠载体的单核细胞被吸引到肿瘤部位并将在肿瘤微环境中选择性地表达pd-1胞外域、抗ctla4抗体或抗检查点蛋白抗体序列。

在一些实施方案中，靶基因可以编码pd-1胞外域或细胞外结构域。pd-1序列可以源自人、小鼠、大鼠、牛或其他哺乳动物形式的pd-1。pd-1序列可包含信号传导结构域、细胞外结构域或其组合。在一些实施方案中，靶基因可编码抗检查点蛋白抗体或结合片段，例如特异性结合表1中的蛋白之一的抗体或结合片段。

在一些实施方案中，所治疗的肿瘤或癌症可表达pd-1配体，例如pd-l1和pd-l2。因此，在一些实施方案中，所公开的珠载体的给予将导致肿瘤相关巨噬细胞表达pd-1胞外或胞外域蛋白。这种pd-1细胞外或胞外域蛋白在肿瘤微环境中的表达可以隔离肿瘤微环境中的所有pd-1配体并导致pd-1检查点的抑制。

在一些实施方案中，靶基因可以编码抗ctla4抗体(例如，单结构域抗体)。抗ctla4抗体可以衍生自任何已知的抗ctla4抗体，例如u.s.2011/0044953中公开的抗ctla4抗体。

在一些实施方案中，所治疗的肿瘤或癌症可以表达ctla4或ctla4配体，例如cd80和/或cd86。因此，在一些实施方案中，所公开的珠载体的给予将导致肿瘤相关巨噬细胞表达抗ctla4和/或抗ctla4配体(例如，cd80或cd86)抗体。这种抗体(例如，单结构域抗体)在肿瘤微环境中的表达可以隔离肿瘤微环境中的所有ctla4或ctla4配体，并导致ctla4检查点的抑制。

在一些实施方案中，珠载体的给予将导致肿瘤相关巨噬细胞表达抗检查点蛋白抗体。例如，吞噬珠载体的tam将在肿瘤微环境中表达抗pd-l1和/或抗ctla4抗体，导致pd-1和/或ctla4检查点的抑制。

在一些实施方案中，所治疗的肿瘤或癌症包括但不限于神经癌、乳腺癌、胃肠癌(例如结肠癌)、肾细胞癌(例如，透明细胞肾细胞癌)或泌尿生殖系统癌(例如，卵巢癌)。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、头颈癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、膀胱癌或血管癌。实际上，所公开的方法提供了治疗肿瘤、癌症、恶性疾病或癌细胞增殖的广谱方法，因此待治疗的疾病类型没有特别限制。

可以调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，如肿瘤消退或缓解的治疗应答)。例如，在一些实施方案中，可以给予单次推注的珠载体，而在一些实施方案中，可以随时间给予几个分开的剂量，或者可以按照情况指示按比例减少或增加剂量。例如，在一些实施方案中，所公开的珠载体可以通过皮下或静脉内注射每周给予一次或两次。在一些实施方案中，所公开的珠载体可以通过皮下注射每月给予一次或两次。在一些实施方案中，所公开的珠载体可以每周给予一次、每隔一周给予一次、每三周给予一次、每四周给予一次、每隔一个月给予一次、每三个月给予一次、每四个月给予一次、每五个月给予一次、或每六个月一次。

此外，除了公开的珠载体之外，所公开的治疗方法还可以包括给予第二治疗化合物。例如，在一些实施方案中，另外的治疗化合物可以是car-t细胞、肿瘤靶向抗体、免疫应答增强方式、检查点抑制剂或小分子药物(例如btk抑制剂(例如依鲁替尼(ibrutinib))、egfr抑制剂(例如ck-101)、bet抑制剂(例如ck-103)、parp抑制剂(例如奥拉帕尼(olaparib)或ck-102)、pi3kδ抑制剂(例如tgr-1202)、braf抑制剂(例如维莫非尼(vemurafenib)))或本领域已知的其他化学治疗剂。

可以根据它们是否会改善给定患者的结果来评估特定的治疗方案，这意味着治疗将降低复发的风险或增加给定癌症或肿瘤的无进展存活的可能性。

因此，为了本公开文本的目的，如果获得一种或多种有益或期望的结果，包括期望的临床结果，则对受试者进行治疗。例如，有益或期望的临床结果包括但不限于以下一种或多种：减少由疾病引起的一种或多种症状、提高患有该疾病的患者的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、延迟疾病的进展和/或延长个体的存活。

此外，虽然该方法的受试者通常是癌症患者，但患者的年龄不受限制。所公开的方法可用于治疗跨所有年龄组和群组的具有各种复发和预后结果的肿瘤、癌症、恶性疾病或癌细胞增殖。因此，在一些实施方案中，受试者可以是儿童，而在其他实施方案中，受试者可以是成年人。

给出以下实施例以说明本公开文本。应该理解，本发明不限于这些实施例中描述的具体条件或细节。

实施例

实施例1-产生用于表达pd-1细胞外结构域的重组病毒

用paci限制酶消化至少5μgpad-dest表达构建体的纯化质粒dna，并将消化的质粒dna凝胶纯化。

将纯化的质粒重悬浮于ph8.0的te缓冲液中至终浓度为0.1-3.0μg/μl。将大约5×10⁵个ad293细胞接种到6孔板的一个孔中并培养过夜。

使用lipofactamine2000，将约1μg的paci消化的质粒dna转染到ad293细胞中。每2-3天用新鲜的完全培养基替换培养基，直至观察到细胞病变效应(cpe)的可见区域(通常在转染后7-10天)。通过用10ml组织培养移液管从板上喷出细胞，以约80％cpe收获含有腺病毒的细胞。将细胞和培养基转移到无菌的15ml盖帽管中。

通过进行至少三次冻融循环来制备粗制病毒裂解物。将裂解物在室温下以3000rpm离心15分钟以沉淀细胞碎片。将含有病毒颗粒的上清液以1ml等分试样转移至冷冻瓶中，并在-80℃下作为病毒原液储存。该原液用于病毒扩增。

图4显示了根据该方法制备重组病毒的示例性方案。可以使用任何方法将此类重组病毒连接于本公开文本的珠颗粒，例如，通过如图3中所示的生物素/链霉抗生物素蛋白缀合。

实施例2-治疗载有黑素瘤的小鼠

向c57b6小鼠注射1×10⁶个b16鼠黑素瘤细胞。十二(12)天后，小鼠有可触知的异种移植肿瘤。

注射b16鼠黑色素瘤细胞12天后，用两种珠颗粒中的一种处理小鼠。对照小鼠接受直接瘤内注射1×10⁶个珠颗粒，其含有1×10⁷个表达绿色荧光蛋白(gfp)的腺病毒。实验组中的小鼠接受直接瘤内注射1×10⁶个珠颗粒，其含有1×10⁷个pd-1腺病毒(设计用于表达小鼠pd-1的细胞外结构域)。

在肿瘤内注射后测量每只小鼠肿瘤的体积。肿瘤体积如图5所示。对照组中的所有小鼠在肿瘤内注射后第28天或之前死亡。实验组中接受用于表达pd-1细胞外结构域的珠颗粒的所有小鼠在肿瘤内注射后第45天存活，并且它们的肿瘤体积缩小。

图6分别显示在对照或实验颗粒的单剂量处理后四周的对照小鼠(a)和接收用于表达pd-1细胞外结构域珠颗粒的小鼠(b)。从图中可以看出，对照小鼠具有大体积肿瘤，而来自治疗组的小鼠具有很少或没有可见的肿瘤生长。

实施例3-预示的人类治疗

该实施例说明了在癌症治疗中使用公开的珠载体的方法。

通过静脉内、皮内注射或皮下注射向已知患有或怀疑患有癌症的患者给予治疗有效量的包含编码pd-1细胞外结构域或抗ctla4抗体(例如，单结构域抗体)的核酸的珠载体。评估患者与癌症相关的体征和症状的存在和/或严重程度(包括但不限于疼痛、虚弱、肿瘤大小等)并且治疗患者直至一种或多种体征/症状减轻、改善或消除。任选地，可以从患者取样以监测治疗后的癌症进展。任选地，如果体征/症状持续和/或如果癌症进展或复发，则给予包含编码pd-1细胞外结构域或抗ctla4抗体的核酸的另一剂量的珠载体。

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本领域技术人员容易理解，本公开文本非常适合于实现该目的并获得所提及的结果和优点，以及其中固有的那些。本领域技术人员将想到其中的修改和其他用途。这些修改包含在本公开文本的精神内，并且由权利要求的范围限定，权利要求的范围阐述了本公开文本的非限制性实施方案。