具有主动-被动双重靶向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种具有主动-被动双重祀向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物及其 制备方法；本发明同时还设及该两亲性嵌段共聚物的制备和作为药物载体在制备抗肿瘤药 中的应用，属于高分子化学领域和生物医药应用技术领域。
【背景技术】
[0002] 癌症已经成为人类健康的主要威胁之一，且呈明显上升趋势。现今治疗癌症的主 要方法包括放疗、化疗、手术疗法和基因疗法。其中放疗和化疗是极其重要的非手术疗法， 但是放疗和化疗在杀死肿瘤细胞的同时也对机体正常细胞产生严重损伤。
[000引N-(2-^丙基）甲基丙締酷胺（HPMA)是一种是具有良好的生物相容性的药物载 体，不仅能够降低药物的毒副作用，减少抗药性，提高药物在体内的稳定性，同时增加药物 在肿瘤部位的富集，使药效得到更好的发挥等特点，被作为肿瘤祀向药物载体已应用于临 床。HPM的其结构式如下：
[0004] 叶酸（FA)是一种天然物质，叶酸是一种很重要的能祀向到特定的细胞膜并通过该 细胞膜表面的叶酸受体使得胶束纳米微粒内吞进入细胞溶酶体。叶酸修饰的纳米载药系统 主要是将药物输送到肿瘤细胞，如宫颈癌、子宫内膜、直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾细胞癌、脑转 移上皮癌和神经内分泌癌。此外，叶酸价格低、容易与载体偶联、容易生产和储存。因此，叶 酸是应用较为广泛的祀向分子在抗肿瘤方面，其结构是如下：
[0005] 二硫单体一一双（2-径基乙基)二硫酸是一种重要的医药中间体，具有优异释放性 并且使药物能够长期有效滞留在体内的物质。当该释放物质全身或局部给药时，该物质长 期滞留在机体中的祀部位，由此通过1次给药使药物效力长时间持续成为可能。
[000引因此，将水溶性好的聚N- (2-径丙基）甲基丙締酷胺与功能化的双（2-径基乙基） 二硫酸和功能化叶酸通过一定的方式形成共聚物，使其抗肿瘤活性进行叠加，W促进聚合 物对肿瘤的抑制作用，同时体现出良好的生物相溶性，W减少对正常组织的伤害，有望为抗 癌领域提供了更多的选择。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种具有主动-被动双重祀向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共 聚物。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种制备上述具有主动-被动双重祀向抗肿瘤活性的 两亲性嵌段共聚物的方法； 本发明还有一个更重要的目的，就是提供上述具有主动-被动双重祀向抗肿瘤活性的 两亲性嵌段共聚物作为抗肿瘤药物载体的应用。
[0009] -、具有主动-被动祀向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物的结构 本发明具有主动-被动双重祀向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物，是将功能化的二硫 单体、修饰的叶酸通过RAFT聚合方式连接到N-(2-径丙基）甲基丙締酷胺（HPMA)上形成 的一种生物相容良好的高分子嵌段共聚物一一甲基丙締酷-SS-S甲氧基苯甲酸-N-(2-^ 丙基）甲基丙締酷胺-叶酸共聚物，其结构如下：
式中，m=52~54mol%，n=13~15mol%，o=6~8mol%;数均分子量Mn=1.5X104~1.6X104，Mw/Mn=l. 14~1. 16。
[0010] 由于上述嵌段共聚物中存在二硫键，使得其负载药物到达肿瘤祀向部位之后释放 出小分子抗肿瘤药物，不仅降低了药物毒性，还能在肿瘤细胞内智能释放抗癌药物；共聚物 中的经修饰的祀向分子叶酸，使得药物能够更好地识别肿瘤细胞；高分子载体HPMA的存 在，使共聚物体现出良好的生物相溶性，从而减少了对正常组织的伤害，所W在制备抗肿瘤 药物方面具有很好的应用前景。
[0011] (二）具有主动-被动祀向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物的制备 本发明具有主动被动祀向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物的制备，由W下工艺步骤完 成。
[0012] ( 1)中间体化合物的制备 W二氯甲烧为溶剂，Ξ乙胺作为缚酸剂，甲基丙締酷氯与双（2-径基乙基）二硫酸为反 应底物，于ο~5°C反应20~24小时；反应结束后，用抑等于8.ο的憐酸缓冲溶液洗涂反应液， 无水硫酸钢干燥，硅胶柱层析分离纯化，得无色油状液体为中间体化合物，记为化合物i;化 合物￡的结构式为：
甲基丙締酷氯与双（2-径基乙基）二硫酸的摩尔比为1:1. 9~1:2. 0 乙胺与双（2-径 基乙基）二硫酸的摩尔比为2. 0:1~2. 1:1。
[0013] (2)功能化的二硫单体的制备 W二氯甲烧为溶剂，4-二甲基氨基化晚和Ν，Ν-二环己基碳二亚胺为催化剂，使化合物I与3, 4, 5-Ξ甲氧基苯甲酸于0~5Γ反应20~24小时；过滤除去固体产物后，滤液用乙酸乙 醋与石油酸的混合溶剂进行柱色谱分离，得到白色固体，即为功能化二硫单体，记为化合物 i;化合物變的结构式为：
化合物i与3, 4, 5-Ξ甲氧基苯甲酸的摩尔比为1:1. 5~1:2. 0 ;催化剂N，N-二环己基碳 二亚胺与化合物I的摩尔比为2. 2:1~2. 5:1 ;催化剂4-二甲基氨基化晚与化合物i的摩尔比 为1:0. 9~1:1. 1;混合溶剂中，乙酸乙醋与石油酸的体积比为1:6~1:8。
[0014] (3)功能化叶酸的制备：将叶酸充分溶于二甲基亚讽中，加入活化剂二环己基碳二 亚胺，于50°C~60°C活化5~6h;冷却至室溫，加入催化剂4-二甲氨基化晚及底物締丙基胺， 在室溫反应20~24小时，过滤，滤液用乙酸乙醋沉淀，干燥得黄色固体即得功能化叶酸，记 为化合物懸；化合物懸的结构式为：
叶酸与締丙基胺的摩尔比为1:2~1:2. 5 ;叶酸与活化剂二环己基碳二亚胺的摩尔比为 1:1. 0~1:1. 5 ;催化剂4-二甲氨基化晚与叶酸的摩尔比为2:1~2. 5:1。
[0015] (4)功能化的二硫单体的接枝聚合：W二甲基亚讽为溶剂，偶氮二异下腊为引发 剂，在RAFT试剂作用，55~65Γ下，化合物i自身聚合20-24小时；加入N-(2-^丙基）甲基 丙締酷胺（HPMA)的DMSO溶液，继续反应20~24小时，用乙酸乙醋沉淀，干燥，得白色功能化 的二硫单体的接枝聚合物，记为化合物R';化合物變的结构式为：
所述RAFT试剂为2-(十二烷基Ξ硫代碳酸醋基）-2-甲基丙酸，其结构式为：
RAFT试剂与化合物應的摩尔比为1:15~1:20 ;引发剂偶氮二异下腊的用量为反应物质 量总和的59^20% ;N-(2-径丙基）甲基丙締酷胺（HPMA)与化合物i前摩尔比为3:1~5:1。
[0016] (5)目标化合物的制备：W二甲基亚讽为溶剂，偶氮二异下腊为引发剂，化合物IE 与化合物?辕在55~65Γ下聚合反应20~24小时，反应液用乙酸乙醋沉淀，干燥，得黄色聚合 物即为目标化合物，记为化合物餐;化合物麵与化合物拔的摩尔比为10:1~20:1 ;引发剂 偶氮二异下腊的用量为反应物质量总和的59?^20%。化合物榮惭结构式为：
式中：111二52~54 111〇1%，11二13~15 111〇1%，〇二6~8 111〇1%;数均分子量胞二1.5><1〇4~1.6><1〇4， Mw/Mn=l. 14~1. 16。
[0017]图1为上述方法制备的具有主动-被动双重祀向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物 的核磁共振氨谱。通过核磁共振氨谱分析可W得出，化学位移在7. 18ppm为Ξ甲氧基苯甲 酸苯环上的H，化学位移在3. 70ppm和2. 94ppm左右会出现HPMA上的特征峰-CH-巧P-0H 相连）和-(?巧口 -NH-相连），化学位移在6. 62ppm、7. 64ppm和8. 64ppm为叶酸上的苯 环上的两个Η和杂环上的一个H。核磁共振氨谱说明用上述方法制备的共聚产物与设计的 共聚物结构一致，表明成功合成了该共聚物。
[001引二、抗肿瘤活性实验 1、胶束的制备W及表征 (1)制备共聚物胶束 将本发明制备的两亲性聚合物(化合物物充分溶于Ν，Ν'-二甲基甲酯胺中，缓慢滴加 去离子水，溶液出现蓝色乳光形成胶束溶液；然后将胶束溶液装入透析袋(MWC0=3000)置 于去离子水中透析45~5化，取出胶束溶液，用去离子水调节胶束溶液的浓度至0. 8~1. 2mg/ mL，即得共聚物胶束。
[0019] (2)载药聚合物胶束制备 将本发明制备的两亲性聚合物和阿霉素解于DMF中，揽拌2~5小时，然后在室溫滴 加去离子水，继续揽拌10~1化，然后在去离子水中透析20~24小时，得到载药胶束溶液。 两亲性聚合物和阿霉素质量比为2. 5:1~3.0:1 ;两亲性聚合物与去离子的质量体积比为 0. 8~1. 2mg/mL。
[0020] (3)胶束的表征 首先，用巧光探针技术测定临界胶束浓度CMC,当胶束浓度高于CMC时，溶液中开始形 成胶束，疏水性巧巧光探针就会进入胶束疏水内核而且分散于其中，此时巧光光谱就会发 生突变，通过运个突变点就可W确定CMC值为0. 52mg/L(聚合物據）、0.64mg/L(聚合物餐 )，符合变化范围。此外，用纳米粒径仪对上述制备的聚合物皆载药胶束的粒径及粒径分布 进行检测，粒径大约127皿左右(见图2);采用透射电镜TEM(见图3)观察了胶束的形貌 为纳米级的小球。
[0021] 2、体外抑制肿瘤细胞生长实验 阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RN