用于增强基因表达的组合物和方法与流程

本申请要求于2016年12月5日提交的美国临时申请序列号62/430,250、2017年4月17日提交的美国临时申请序列号62/486,361、和2017年11月17日提交的美国临时申请序列号62/587,954的优先权。上述申请的内容在此通过引用明确地并入本文。序列表的并入所附序列表中的材料通过引用结合到本申请中。所附序列表文本文件名为sgi012wo_seqlisting.txt，创建于2017年12月4日且为169kb。本公开涉及分子生物学和基因工程领域，包括用于调节基因表达的核酸分子，以及核酸分子在例如细胞培养物的合适宿主细胞中或在受试者中产生所需产物，并且赋予宿主细胞或受试者有益特征的用途。
背景技术：
：生物技术和分子生物学的进步为开发具有商业上所需特征或性状的重组细胞和生物体提供了许多机会。特别是现代基因工程技术极大地加速了基因的引入，从而加速了重组细胞和生物体的新特性。在例如宿主细胞或转基因生物体中所需基因的适当表达水平有助于实现该目标。然而，尽管存在许多分子工具，但宿主细胞和生物体的遗传修饰通常受到目的基因表达水平不足或不受控表达的限制。因此，仍然需要能够增强宿主细胞和生物体中转基因表达的调节元件。包括在各种类型的生物中起作用的调节元件、表达载体和表达系统的新型分子工具的鉴定可用于开发遗传增强的细胞和生物体。技术实现要素：本节提供了本申请的一般概述，并未全面描述其全部范围或其所有特征。本公开一般涉及用于在体外、离体或体内调节例如增加基因表达的方法和组合物。基因表达可以是例如在动物细胞和其它真核细胞中。该基因可以是例如编码目的蛋白质的异源基因。在一个方面，本文公开的一些实施方式涉及核酸分子，包括(i)编码病毒衣壳增强子或其变体的一个或多个rna茎环的第一核酸序列；(ii)可操作地连接至第一核酸序列的第二核酸序列，其中第二核酸序列包含目的基因(goi)的编码序列。根据本公开的核酸分子的实施方式的实施可包括一个或多个下列特征。在一些实施方式中，第一核酸序列可操作地连接在goi的编码序列的上游。在一些实施方式中，核酸分子还包括可操作地连接在第一核酸序列的上游的启动子。在一些实施方式中，核酸分子还包括可操作地连接在第一核酸序列的上游的5’utr序列。在一些实施方式中，5’utr序列可操作地连接在启动子下游和第一核酸序列的上游。在一些实施方式中，核酸分子还包括可操作地连接在第二核酸序列的上游的自身蛋白酶肽的编码序列。在一些实施方式中，自身蛋白酶肽的编码序列可操作地连接在第一核酸序列的下游和第二核酸序列的上游。在一些实施方式中，自身蛋白酶肽包含选自由以下组成的组中的肽序列：猪捷申病毒-12a(p2a)，口蹄疫病毒(fmdv)2a(f2a)，马鼻炎a病毒(erav)2a(e2a)，托西埃塞(thoseaasigna)病毒2a(t2a)，细胞质多角体病毒2a(bmcpv2a)，软化病病毒2a(bmifv2a)及其组合。在一些实施方式中，核酸分子还包括下游可操作地在第二序列核酸序列的连接的3’utr序列。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子衍生自属于披膜病毒科(togaviridae)的病毒种的衣壳基因。在一些实施方式中，病毒种属于披膜病毒科的甲病毒属。在一些实施方式中，甲病毒种是东部马脑炎病毒(eeev)，委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，everglades病毒(evev)，mucambo病毒(mucv)，semlikiforest病毒(sfv)，pixuna病毒(pixv)，middleburg病毒(midv)，chikungunya病毒(chikv)，o’nyong-nyong病毒(onnv)，rossriver病毒(rrv)，barmahforest病毒(bf)，getah病毒(get)，sagiyama病毒(sagv)，bebaru病毒(bebv)，mayaro病毒(mayv)，una病毒(unav)，sindbis病毒(sinv)，aura病毒(aurav)，whataroa病毒(whav)，babanki病毒(babv)，kyzylagach病毒(kyzv)，西部马脑炎病毒(weev)，highlandj病毒(hjv)，fortmorgan病毒(fmv)，ndumu(nduv)，salmonid甲病毒(sav)或buggycreek病毒。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子包含病毒种的下游环(dlp)基序，并且其中dlp基序包含一个或多个rna茎环中的至少一个。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子包含与seqidno：1和46-52中的至少一个显示出至少80％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，核酸序列与seqidno：1和46-52中的至少一个表现出至少95％的序列同一性。在一些实施方式中，goi的编码序列编码多肽。在一些实施方式中，多肽是治疗性多肽，预防性多肽，诊断性多肽，营养保健多肽，工业酶，报告多肽或其组合。在一些实施方式中，多肽是抗体，抗原，免疫调节剂，细胞因子，酶或其组合。在一些实施方式中，本公开的核酸分子还包含编码第二病毒衣壳增强子或其变体的一个或多个rna茎环的第三核酸序列；和可操作地连接至第三核酸序列的第四核酸序列，其中第四核酸序列包含第二目的基因(goi)的编码序列。在一些实施方式中，核酸分子还包括第二自身蛋白酶肽的编码序列，其可操作地连接在第三核酸序列的下游和第四核酸序列的上游。在一些实施方式中，本公开的核酸分子是mrna分子或rna复制子。在一些实施方式中，核酸分子是表达载体或转录载体。在一些实施方式中，表达载体或转录载体还包含一种或多种另外的转录调节序列。在一些实施方式中，表达载体或转录载体还包含一种或多种另外的转录调节序列。在一些实施方式中，表达载体或转录载体还包含一种或多种另外的翻译调节序列。在一些实施方式中，核酸分子是质粒，噬菌体载体，粘粒(cosmid)，黏粒(fosmid)，病毒复制子，穿梭载体或其组合。在一些实施方式中，核酸分子是原核载体或真核载体。在一些实施方式中，核酸分子通过从头合成产生。在一些实施方式中还公开了包括在细胞中产生目的多肽的方法，其包括将根据本公开的核酸分子引入细胞中，从而产生由细胞中的goi编码的多肽。在另一个相关方面，本文公开的一些实施方式涉及在细胞中产生目的多肽的方法，其包括将rna分子引入细胞，其中rna分子包含病毒衣壳增强子或其变体的一个或多个rna茎环，以及目的多肽的编码序列，从而在细胞中产生目的多肽。在一些实施方式中，rna分子是信使rna(mrna)分子或复制rna分子。在一些实施方式中，rna分子在引入细胞之前通过从头合成和/或体外转录产生。在一些实施方式中，rna分子包含病毒种的下游环(dlp)基序，并且其中dlp基序包含病毒衣壳增强子的一个或多个rna茎环中的至少一个。在一些实施方式中，rna分子还包含在一个或多个rna茎环中至少一个的下游和目的多肽的编码序列上游的自身蛋白酶肽的编码序列。在一些实施方式中，自身蛋白酶肽包含选自由以下组成的组中的肽序列：猪捷申病毒-12a(p2a)，口蹄疫病毒(fmdv)2a(f2a)，马鼻炎a病毒(erav)2a(e2a)，托西埃塞病毒2a(t2a)，细胞质多角体病毒2a(bmcpv2a)，软化病病毒2a(bmifv2a)及其组合。在一些实施方式中，多肽是治疗性多肽，预防性多肽，诊断性多肽，营养保健多肽，工业酶，报告多肽或其组合。在一些实施方式中，多肽是抗体，抗原，免疫调节剂，细胞因子，酶或其组合。在一些实施方式中，细胞存在于组织，器官或受试者中。在一些实施方式中，受试者是人，马，猪，灵长类动物，小鼠，雪貂，大鼠，棉鼠，牛，猪，绵羊，兔，猫，狗，鸟，鱼，山羊，驴，仓鼠或水牛。一些实施方式公开了用于在细胞中产生信使rna(mrna)的方法。在一些实施方式中，该方法包括向细胞施用核酸分子，所述核酸分子包含编码病毒衣壳增强子或其变体的一个或多个rna茎环的第一核酸序列，和与第一核酸序列可操作地连接的第二核酸序列，其中第二核酸序列包含目的基因(goi)的编码序列，从而产生goi的mrna。在一些实施方式中，第一核酸序列可操作地连接在goi的编码序列的上游。在一些实施方式中，核酸分子还包括可操作地连接在第一核酸序列的上游的启动子。在一些实施方式中，核酸分子还包括可操作地连接在第一核酸序列的上游的5’utr序列。在一些实施方式中，5’utr序列可操作地连接在启动子下游和第一核酸序列的上游。在一些实施方式中，核酸分子还包括可操作地连接在第二核酸序列的上游的自身蛋白酶肽的编码序列。在一些实施方式中，自身蛋白酶肽的编码序列可操作地连接在第一核酸序列的下游和第二核酸序列的上游。在一些实施方式中，自身蛋白酶肽包含选自由以下组成的组中的肽序列：猪捷申病毒-12a(p2a)，口蹄疫病毒(fmdv)2a(f2a)，马鼻炎a病毒(erav)2a(e2a)，托西埃塞病毒2a(t2a)，细胞质多角体病毒2a(bmcpv2a)，软化病病毒2a(bmifv2a)及其组合。在一些实施方式中，核酸分子还包括可操作地连接在第二序列核酸序列的下游的3’utr序列。在本文公开的一些实施方式中，病毒衣壳增强子衍生自属于披膜病毒科的病毒种的衣壳基因。在一些实施方式中，病毒种属于披膜病毒科的甲病毒属。在一些实施方式中，甲病毒种是东部马脑炎病毒(eeev)，委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，everglades病毒(evev)，mucambo病毒(mucv)，semlikiforest病毒(sfv)，pixuna病毒(pixv)，middleburg病毒(midv)，chikungunya病毒(chikv)，o’nyong-nyong病毒(onnv)，rossriver病毒(rrv)，barmahforest病毒(bf)，getah病毒(get)，sagiyama病毒(sagv)，bebaru病毒(bebv)，mayaro病毒(mayv)，una病毒(unav)，sindbis病毒(sinv)，aura病毒(aurav)，whataroa病毒(whav)，babanki病毒(babv)，kyzylagach病毒(kyzv)，西部马脑炎病毒(weev)，highlandj病毒(hjv)，fortmorgan病毒(fmv)，ndumu(nduv)，salmonid甲病毒(sav)或buggycreek病毒。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子包含病毒种的下游环(dlp)基序，并且其中dlp基序包含一个或多个rna茎环中的至少一个。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子包含与seqidno：1和46-52中的至少一个显示出至少80％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，核酸序列与seqidno：1和46-52中的至少一个表现出至少95％的序列同一性。在本文公开的一些实施方式中，goi的编码序列编码多肽。在一些实施方式中，多肽选自由治疗性多肽，预防性多肽，诊断性多肽，营养保健多肽，工业酶，报告多肽及其组合组成的组。在一些实施方式中，多肽是抗体，抗原，免疫调节剂，细胞因子，酶或其组合。在根据本公开的用于产生信使rna(mrna)的方法的一些实施方式中，核酸分子还包含编码第二病毒衣壳增强子或其变体的一个或多个rna茎环的第三核酸序列；和可操作地连接至第三核酸序列的第四核酸序列，其中第四核酸序列包含第二目的基因(goi)的编码序列。在一些实施方式中，核酸分子还包括第二自身蛋白酶肽的编码序列，其可操作地连接在第三核酸序列的下游和第四核酸序列的上游。在一些实施方式中，本公开的核酸分子可以是rna复制子。在一些实施方式中，核酸分子是表达载体或转录载体。在一些实施方式中，核酸分子还包含一种或多种另外的转录调节序列。在一些实施方式中，核酸分子还包含。在一些实施方式中，一种或多种另外的翻译调节序列。在一些实施方式中，核酸分子是选自由以下组成的组中的表达载体：质粒，噬菌体载体，粘粒，黏粒，病毒复制子，穿梭载体，及其组合。在一些实施方式中，核酸分子是原核表达载体或真核表达载体。在一些实施方式中，细胞存在于组织，器官或受试者中。在一些实施方式中，受试者是人，马，猪，灵长类动物，小鼠，雪貂，大鼠，棉鼠，牛，猪，绵羊，兔，猫，狗，鸟，鱼，山羊，驴，仓鼠或水牛。在根据本公开的用于产生信使rna(mrna)的方法的一些实施方式中，进一步包括产生由细胞中goi的mrna编码的多肽。在一些实施方式中，该方法还包括获得产生的goimrna并将获得的mrna引入第二细胞，用于在第二细胞中表达由goi的mrna编码的多肽。在一个方面，本公开的一些实施方式涉及包含编码经修饰的病毒rna复制子的核酸序列的核酸分子，其中经修饰的病毒rna复制子包含(i)编码病毒衣壳增强子或其变体的一种或多种结构元件的第一核酸序列，其中病毒衣壳增强子对病毒rna复制子是异源的，和(ii)编码至少一种非结构病毒蛋白或其部分的第二核酸序列，其中第一核酸序列可操作地连接在第二核酸序列的上游。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件中的至少一种包含一个或多个rna茎环。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子衍生自属于披膜病毒科的病毒种的衣壳基因。在一些实施方式中，病毒种属于披膜病毒科的甲病毒属。在一些实施方式中，甲病毒种东部马脑炎病毒(eeev)，委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，everglades病毒(evev)，mucambo病毒(mucv)，semlikiforest病毒(sfv)，pixuna病毒(pixv)，middleburg病毒(midv)，chikungunya病毒(chikv)，o’nyong-nyong病毒(onnv)，rossriver病毒(rrv)，barmahforest病毒(bf)，getah病毒(get)，sagiyama病毒(sagv)，bebaru病毒(bebv)，mayaro病毒(mayv)，una病毒(unav)，sindbis病毒(sinv)，aura病毒(aurav)，whataroa病毒(whav)，babanki病毒(babv)，kyzylagach病毒(kyzv)，西部马脑炎病毒(weev)，highlandj病毒(hjv)，fortmorgan病毒(fmv)，ndumu(nduv)或buggycreek病毒。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子包含病毒种的下游环(dlp)基序，并且其中dlp基序包含一个或多个rna茎环中的至少一个。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子包含与seqidno：1和46-52中的至少一个显示出至少80％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，核酸序列与seqidno：1和46-52中的至少一个表现出至少95％的序列同一性。在一些实施方式中，编码经修饰的病毒rna复制子的核酸序列还包含自身蛋白酶肽的编码序列，其在第一核酸序列的下游和第二核酸序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，自身蛋白酶肽包含选自由以下组成的组中的肽序列：猪捷申病毒-12a(p2a)，口蹄疫病毒(fmdv)2a(f2a)，马鼻炎a病毒(erav)2a(e2a)，托西埃塞病毒2a(t2a)，细胞质多角体病毒2a(bmcpv2a)，软化病病毒2a(bmifv2a)及其组合。在一些实施方式中，第一核酸序列可操作地定位在经修饰的病毒rna复制子的5’末端下游约1至1000个核苷酸的区域内。第二核酸序列包含相应未经修饰的病毒rna复制子的天然病毒非结构蛋白的基本上所有编码序列。在本文公开的一些实施方式中，经修饰的病毒rna复制子包含衍生自属于披膜病毒科的甲病毒属或属于动脉病毒科的动脉炎病毒属的病毒种的经修饰的rna复制子。在一些实施方式中，动脉炎病毒种是马动脉炎病毒(eav)，猪呼吸和生殖综合征病毒(prrsv)，乳酸脱氢酶升高病毒(ldv)或猿猴出血热病毒(shfv)。在一些实施方式中，第一核酸序列在编码经修饰的动脉炎病毒rna复制子的部分或整个pp1ab非结构蛋白的第二核酸序列的上游可操作地定位。在一些实施方式中，编码经修饰的动脉炎病毒rna复制子的核酸序列还包含一个或多个表达盒，其中一个或多个表达盒中的至少一个包含可操作地连接至目的基因(goi)的编码序列的启动子。在一些实施方式中，经修饰的动脉炎病毒rna复制子包含至少两个，三个，四个，五个或六个表达盒。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个在编码经修饰的动脉炎病毒rna复制子的部分或整个pp1ab非结构蛋白的第二核酸序列的下游可操作地连接。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个在经修饰的动脉炎病毒rna复制子的转录调节序列(trs)的下游可操作地定位，其中trs是trs1，trs2，trs3，trs4，trs5，trs6或trs7。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个还包含编码病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件的第三核酸序列，其中第三核酸序列在goi的编码序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，编码经修饰的动脉炎病毒rna复制子的核酸序列还包含自身蛋白酶肽的编码序列，其在第三核酸序列的下游和goi的编码序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，goi的编码序列编码治疗性多肽，预防性多肽，诊断性多肽，营养保健多肽，工业酶，报告多肽或其任何组合。在一些实施方式中，goi的编码序列编码抗体，抗原，免疫调节剂，细胞因子，酶或其任何组合。在一些实施方式中，经修饰的病毒rna复制子包含衍生自甲病毒种的经修饰的rna复制子，所述甲病毒种选自由东部马脑炎病毒(eeev)，委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，everglades病毒(evev)，mucambo病毒(mucv)，semlikiforest病毒(sfv)，pixuna病毒(pixv)，middleburg病毒(midv)，chikungunya病毒(chikv)，o’nyong-nyong病毒(onnv)，rossriver病毒(rrv)，barmahforest病毒(bf)，getah病毒(get)，sagiyama病毒(sagv)，bebaru病毒(bebv)，mayaro病毒(mayv)，una病毒(unav)，sindbis病毒(sinv)，aura病毒(aurav)，whataroa病毒(whav)，babanki病毒(babv)，kyzylagach病毒(kyzv)，西部马脑炎病毒(weev)，highlandj病毒(hjv)，fortmorgan病毒(fmv)，ndumu(nduv)，salmonid甲病毒(sav)和buggycreek病毒组成的组。在一些实施方式中，第一核酸序列在编码经修饰的甲病毒rna复制子的一种或多种非结构蛋白nsp1-4或其部分的第二核酸序列的上游可操作地定位。在一些实施方式中，编码经修饰的甲病毒属rna复制子的核酸序列还包含一个或多个表达盒，其中每个表达盒包含可操作地连接至目的基因(goi)的编码序列的启动子。在一些实施方式中，经修饰的甲病毒rna复制子包含至少两个，三个，四个，五个或六个表达盒。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个在编码经修饰的甲病毒rna复制子的一种或多种非结构蛋白nsp1-4或其部分的核酸序列的下游可操作地连接。在一些实施方式中，所述一个或多个表达盒中的至少一个还包含编码病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件的第三核酸序列，其中第三核酸序列在goi的编码序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，编码经修饰的甲病毒属rna复制子的核酸序列还包含自身蛋白酶肽的编码序列，其在第三核酸序列的下游和goi的编码序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，goi的编码序列编码治疗性多肽，预防性多肽，诊断性多肽，营养保健多肽，工业酶，报告多肽或其组合。在一些实施方式中，goi的编码序列编码抗体，抗原，免疫调节剂，酶，细胞因子或其组合。在一个方面，本公开的一些实施方式涉及包含编码经修饰的非甲病毒rna复制子的核酸序列的核酸分子，其中经修饰的非甲病毒rna复制子包含编码病毒衣壳增强子或其变体的一种或多种结构元件的第一核酸序列。在一些实施方式中，编码经修饰的非甲病毒rna复制子的核酸序列还包含编码至少一种非结构病毒蛋白或其部分的第二核酸序列，其中第一核酸序列在第二核酸序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，编码经修饰的非甲病毒属rna复制子的核酸序列还包含在第一核酸序列下游和第二核酸序列上游可操作地连接的自身蛋白酶肽的编码序列。在一些实施方式中，自身蛋白酶肽包含选自由以下组成的组中的肽序列：猪捷申病毒-12a(p2a)，口蹄疫病毒(fmdv)2a(f2a)，马鼻炎a病毒(erav)2a(e2a)，托西埃塞病毒2a(t2a)，细胞质多角体病毒2a(bmcpv2a)，软化病病毒2a(bmifv2a)及其组合。在一些实施方式中，编码经修饰的非甲病毒rna复制子的核酸序列包含衍生自正链rna病毒的经修饰的rna复制子。在一些实施方式中，正链rna病毒是属于选自由披膜病毒科，黄病毒科，正粘病毒科，弹状病毒科和副粘病毒科组成的组中的科的病毒种。在一些实施方式中，正链rna病毒是属于动脉炎病毒科的动脉炎病毒属的病毒种。在本文公开的一些实施方式中，编码经修饰的非甲病毒rna复制子的核酸序列还包含一个或多个表达盒，其中每个表达盒包含与目的基因(goi)的编码序列可操作地连接的启动子。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒rna复制子包含至少两个，三个，四个，五个或六个表达盒。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个在编码至少一种非结构病毒蛋白或其部分的第二核酸序列的下游可操作地连接。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个还包含编码病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件的第三核酸序列，其中第三核酸序列在goi的编码序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，编码经修饰的非甲病毒rna复制子的核酸序列还包含自身蛋白酶肽的编码序列，其在第三核酸序列的下游和goi的编码序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，核酸分子通过从头合成产生。在一个方面，本文公开的一些实施方式涉及包含本文公开的核酸分子的重组细胞。在一些实施方式中，重组细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方式中，重组细胞是动物细胞。在一些实施方式中，核酸分子包含编码经修饰的rna复制子的核酸序列，并且其中经修饰的复制子rna的表达赋予重组细胞对先天免疫应答的抗性。在相关方面，本文公开的一些实施方式涉及细胞培养物，其包括至少一种本文公开的重组细胞。在一些方面，本文公开的一些实施方式涉及赋予受试者对先天免疫系统抗性的方法，其包括向受试者施用包含编码经修饰的病毒rna复制子的核酸序列的核酸分子，其中经修饰的病毒rna复制子包含(i)编码病毒衣壳增强子或其变体的一种或多种结构元件的第一核酸序列，其中病毒衣壳增强子对病毒rna复制子是异源的，和(ii)编码至少一种非结构蛋白或其部分的第二核酸序列，其中第一核酸序列在第二核酸序列的上游可操作地连接，并且其中由核酸分子编码的经修饰的复制子rna的表达赋予受试者对先天免疫应答的抗性。在一些实施方式中，受试者选自由人，马，猪，灵长类动物，小鼠，雪貂，大鼠，棉鼠，牛，猪，绵羊，兔，猫，狗，鸟，鱼，山羊，驴，仓鼠和水牛组成的组。在一些方面，本文公开的一些实施方式涉及用于在受试者中产生目的多肽的方法，其包括向受试者施用包含编码经修饰的病毒rna复制子的核酸序列的核酸分子，其中经修饰的病毒rna复制子包含(i)编码病毒衣壳增强子或其变体的一种或多种结构元件的第一核酸序列，其中病毒衣壳增强子对病毒rna复制子是异源的，和(ii)编码至少一种非结构蛋白或其部分的第二核酸序列，其中第一核酸序列在第二核酸序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，受试者是人，马，猪，灵长类动物，小鼠，雪貂，大鼠，棉鼠，牛，猪，绵羊，兔，猫，狗，鸟，鱼，山羊，驴，仓鼠或水牛。在一些方面，本文公开的一些实施方式涉及用于产生目的多肽的方法，其包括获得包含核酸分子的宿主细胞，所述核酸分子包含编码经修饰的病毒rna复制子的核酸序列，其中经修饰的病毒rna复制子包含(i)编码病毒衣壳增强子或其变体的一种或多种结构元件的第一核酸序列，其中病毒衣壳增强子对病毒rna复制子是异源的，和(ii)编码至少一种非结构蛋白或其部分的第二核酸序列，其中第一核酸序列在第二核酸序列的上游可操作地连接。在根据本发明的用于产生目的多肽的方法的一些实施方式中，受试者选自由人，马，猪，灵长类动物，小鼠，雪貂，大鼠，棉鼠，牛，猪，绵羊，兔子，猫，狗，鸟，鱼，山羊，驴，仓鼠和水牛组成的组。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件中的至少一种包含一个或多个rna茎环。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子衍生自属于披膜病毒科的病毒种的衣壳基因。在一些实施方式中，病毒种属于披膜病毒科的甲病毒属。在一些实施方式中，甲病毒种是东部马脑炎病毒(eeev)，委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，everglades病毒(evev)，mucambo病毒(mucv)，semlikiforest病毒(sfv)，pixuna病毒(pixv)，middleburg病毒(midv)，chikungunya病毒(chikv)，o’nyong-nyong病毒(onnv)，rossriver病毒(rrv)，barmahforest病毒(bf)，getah病毒(get)，sagiyama病毒(sagv)，bebaru病毒(bebv)，mayaro病毒(mayv)，una病毒(unav)，sindbis病毒(sinv)，aura病毒(aurav)，whataroa病毒(whav)，babanki病毒(babv)，kyzylagach病毒(kyzv)，西部马脑炎病毒(weev)，highlandj病毒(hjv)，fortmorgan病毒(fmv)，ndumu(nduv)或buggycreek病毒。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子包含病毒种的下游环(dlp)基序，并且其中dlp基序包含一个或多个rna茎环中的至少一个。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子包含与seqidno：1和46-52中的至少一个显示出至少80％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，核酸序列与seqidno：1和46-52中的至少一个表现出至少95％的序列同一性。在本文公开的一些实施方式中，编码经修饰的病毒rna复制子的核酸序列还包含自身蛋白酶肽的编码序列，其在第一核酸序列的下游和第二核酸序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，自身蛋白酶肽包含选自由以下组成的组中的肽序列：猪捷申病毒-12a(p2a)，口蹄疫病毒(fmdv)2a(f2a)，马鼻炎a病毒(erav)2a(e2a)，托西埃塞病毒2a(t2a)，细胞质多角体病毒2a(bmcpv2a)，软化病病毒2a(bmifv2a)及其组合。在一些实施方式中，第一核酸序列在修饰的病毒rna复制子的5’末端下游约1至1000个核苷酸的区域内可操作地定位。第二核酸序列包含相应未经修饰的病毒rna复制子的天然病毒非结构蛋白的基本上所有编码序列。在一些实施方式中，经修饰的病毒rna复制子包含衍生自属于披膜病毒科的甲病毒属或动脉病毒科的动脉炎病毒属的病毒种的修饰的rna复制子。在一些实施方式中，动脉炎病毒种类是马动脉炎病毒(eav)，猪呼吸和生殖综合征病毒(prrsv)，乳酸脱氢酶升高病毒(ldv)或猿猴出血热病毒(shfv)。在本文公开的一些实施方式中，编码经修饰的动脉炎病毒rna复制子的核酸序列还包含一个或多个表达盒，并且其中至少一个表达盒包含可操作地连接至目的基因(goi)的编码序列的启动子。在一些实施方式中，病毒种是动脉炎病毒，并且其中第一核酸序列在编码修饰的动脉炎病毒rna复制子的部分或全部pp1ab非结构蛋白的核酸序列的上游可操作地定位。在一些实施方式中，经修饰的动脉炎病毒rna复制子还包含至少两个，三个，四个，五个或六个表达盒。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个在编码修饰的动脉炎病毒rna复制子的部分或整个pp1ab非结构蛋白的第二核酸序列的下游可操作地连接。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个在修饰的动脉炎病毒rna复制子的转录调节序列(trs)的下游可操作地定位，其中trs是trs1，trs2，trs3，trs4，trs5，trs6或trs7。在一些实施方式中，所述一个或多个表达盒中的至少一个还包含编码病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件的第三核酸序列，其中第三核酸序列在goi的编码序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，编码经修饰的动脉炎病毒rna复制子的核酸序列还包含自身蛋白酶肽的编码序列，其在第三核酸序列的下游和goi的编码序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，goi的编码序列编码治疗性多肽，预防性多肽，诊断性多肽，营养保健多肽，工业酶，报告多肽或其任何组合。在一些实施方式中，goi的编码序列编码抗体，抗原，免疫调节剂，细胞因子，酶或其任何组合。在一些实施方式中，经修饰的病毒rna复制子包含衍生自甲病毒种的经修饰的rna复制子，所述甲病毒种选自由东部马脑炎病毒(eeev)，委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，everglades病毒(evev)，mucambo病毒(mucv)，semlikiforest病毒(sfv)，pixuna病毒(pixv)，middleburg病毒(midv)，chikungunya病毒(chikv)，o’nyong-nyong病毒(onnv)，rossriver病毒(rrv)，barmahforest病毒(bf)，getah病毒(get)，sagiyama病毒(sagv)，bebaru病毒(bebv)，mayaro病毒(mayv)，una病毒(unav)，sindbis病毒(sinv)，aura病毒(aurav)，whataroa病毒(whav)，babanki病毒(babv)，kyzylagach病毒(kyzv)，西部马脑炎病毒(weev)，highlandj病毒(hjv)，fortmorgan病毒(fmv)，ndumu(nduv)，salmonid甲病毒(sav)和buggycreek病毒组成的组。在一些实施方式中，第一核酸序列在编码经修饰的甲病毒rna复制子的一种或多种非结构蛋白nsp1-4或其部分的核酸序列的上游可操作地定位。在一些实施方式中，编码经修饰的甲病毒属rna复制子的核酸序列还包含一个或多个表达盒，其中每个表达盒包含可操作地连接至目的基因(goi)的编码序列的启动子。在一些实施方式中，修饰的甲病毒rna复制子包含至少两个，三个，四个，五个或六个表达盒。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个在编码经修饰的甲病毒rna复制子的一种或多种非结构蛋白nsp1-4或其部分的核酸序列的下游可操作地连接。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个还包含编码病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件的第三核酸序列，其中第三核酸序列在goi的编码序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，经修饰的甲病毒属rna复制子还包含自身蛋白酶肽的编码序列，其在第三核酸序列的下游和goi的编码序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，goi的编码序列编码治疗性多肽，预防性多肽，诊断性多肽，营养保健多肽，工业酶，报告多肽或其任何组合。在一些实施方式中，goi的编码序列编码抗体，抗原，免疫调节剂，细胞因子，酶或其任何组合。在另一个方面，本文公开的一些实施方式涉及赋予受试者对先天免疫系统的抗性的方法，包括向受试者施用包含编码经修饰的非甲病毒rna复制子的核酸序列的核酸分子，其中经修饰的非甲病毒rna复制子包含编码甲病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件的第一核酸序列，并且其中由核酸分子编码的修饰的非甲病毒rna复制子的表达赋予受试者对先天免疫应答的抗性。在一些实施方式中，受试者选自由人，马，猪，灵长类动物，小鼠，雪貂，大鼠，棉鼠，牛，猪，绵羊，兔，猫，狗，鸟，鱼，山羊，驴，仓鼠和水牛组成的组。本文还公开了用于在受试者中产生目的多肽的方法，其中该方法包括向受试者施用包含编码经修饰的非甲病毒rna复制子的核酸序列的核酸分子，其中经修饰的非复制子甲病毒rna复制子包含编码甲病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件的第一核酸序列。在一些实施方式中，受试者是人，马，猪，灵长类动物，小鼠，雪貂，大鼠，棉鼠，牛，猪，绵羊，兔，猫，狗，鸟，鱼，山羊，驴，仓鼠或水牛。本文公开的一些实施方式涉及用于产生目的多肽的方法，其中该方法包括培养包含核酸分子的宿主细胞，所述核酸分子包含编码经修饰的非甲病毒rna复制子的核酸序列，其中经修饰的非甲病毒rna复制子包含编码甲病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件的第一核酸序列。在根据本公开的上述方面的一些实施方式中，经修饰的非甲病毒rna复制子还包含编码至少一种非结构病毒蛋白或其部分的第二核酸序列，其中第一核酸序列在第二核酸序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒属rna复制子还包含自身蛋白酶肽的编码序列，其在第一核酸序列的下游和第二核酸序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，自身蛋白酶肽包含选自由下组成的组中的肽序列：猪捷申病毒-12a(p2a)，口蹄疫病毒(fmdv)2a(f2a)，马鼻炎a病毒(erav)2a(e2a)，托西埃塞病毒2a(t2a)，细胞质多角体病毒2a(bmcpv2a)，软化病病毒2a(bmifv2a)及其组合。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒rna复制子包含衍生自正链rna病毒的经修饰的rna复制子。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒属rna复制子包含衍生自属于披膜病毒科，黄病毒科，正粘病毒科，弹状病毒科或副粘病毒科的病毒种的经修饰的rna复制子。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒属rna复制子包含衍生自属于动脉炎病毒科的动脉炎病毒属的病毒种的经修饰的rna复制子。在一些实施方式中，编码经修饰的非甲病毒rna复制子的序列还包含一个或多个表达盒，其中每个表达盒包含与目的基因(goi)的编码序列可操作地连接的启动子。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒rna复制子包含至少两个，三个，四个，五个或六个表达盒。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个在编码经修饰的非甲病毒rna复制子的至少一种非结构病毒蛋白或其部分的第二核酸序列的下游可操作地连接。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个还包含编码甲病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件的第三核酸序列，其中第三核酸序列在goi的编码序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒rna复制子还包含自身蛋白酶肽的编码序列，其在第三核酸序列的下游和goi的编码序列的上游可操作地连接。在一些方面，本文公开的一些实施方式涉及通过根据本文描述的一个或多个实施方式的方法产生的重组多肽。本文公开的一些实施方式涉及包含如本文所述的重组多肽和药学上可接受的载体的组合物。本文公开的一些实施方式涉及包含本文公开的核酸分子和药学上可接受的载体的组合物。在一些实施方式中，将本申请的一种或多种组合物和/或分子例如核酸分子、rna复制子和多肽进一步配制成药物制剂。在一些实施方式中，将本申请的一种或多种组合物和/或分子配制成具有共价化合物，非共价化合物，物理组合物或药学上可接受的缓冲剂的药物制剂。在本文公开的一些实施方式中，将本申请的一种或多种组合物和/或分子例如核酸分子、rna复制子和多肽进一步配制用作保护性组合物(例如疫苗)或治疗性组合物。特别地，根据本公开制备的保护性组合物具有多种用途，包括但不限于用作疫苗和其它治疗剂，用作诊断剂和在多克隆或单克隆抗体的生产中用作抗原。前述
发明内容仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了本文描述的说明性实施方式和特征之外，本申请的其它方面、实施方式、目的和特征将从附图和详细描述以及权利要求中变得完全显而易见。附图说明图1是甲病毒衣壳增强子的非限制性示例性茎环rna结构的图解说明。图2a-2d是本公开的四种非限制性示例性核酸分子的图示说明，其中每种核酸分子包含甲病毒衣壳增强子(例如dlp基序)的编码序列和目的基因(goi)例如红萤火虫(rff)报告基因的编码序列。图2a：rex-dlp-rff；图2b：rex-dlp-pp1ab-rff；图2c：rex-dlp-2a-pp1ab-rff；和图2d：rex-dlp-2a-pp1ab-dlp-rff。dlp：下游环序列；2a：自身蛋白酶肽；pp1ab：非结构多肽序列；和rff：红萤火虫报告基因的编码序列。图3a-3d是本公开的四种非限制性示例性核酸分子的图解说明，其中每种核酸分子包含甲病毒衣壳增强子(例如dlp基序)的编码序列和目的基因(goi)例如红萤火虫(rff)报告基因的编码序列。图3a：α-r-rff；图3b：α-r-dlp-rff；图3c：α-r-dlp-2a-nsp-rff；和图3d：α-r-dlp-2a-nsp-dlp-rff。dlp：下游环序列；2a：自身蛋白酶肽；nsp1-4：非结构多肽序列；和rff：红萤火虫报告基因的编码序列。图4a-4b是本公开的两种其它非限制性示例性核酸分子的图解说明，其中每种核酸分子包含编码甲病毒衣壳增强子(例如dlp基序)的编码序列和目的基因(goi)例如红萤火虫(rff)报告基因的编码序列。图4a：α-r-dlp-2a-rff；和图4b：α-r-dlp-2a-nsp-dlp-2a-rff。dlp：下游环序列；2a：自身蛋白酶肽；nspl-4：非结构多肽序列；和rff：红萤火虫报告基因的编码序列。图5a-5b图示总结了进行流式细胞术分析和大量荧光素酶分析的结果，以证明在编码位于亚基因组rna中的eav非结构蛋白基因或目的基因的核酸序列上游掺入dlp基序即rff报告基因没有对基因组rna复制产生负面影响。在这些实验中，在电穿孔细胞上进行facs分析(图5a)和大量细胞荧光素酶测定(图5b)。图6a-b图示总结了进行另一个示例性流式细胞术分析和大量荧光素酶分析的结果，以证明在编码非结构蛋白基因的序列上游掺入dlp基序的经修饰的动脉病毒复制子rna可以在已用ifn处理的宿主细胞中有效复制和表达以诱导细胞先天免疫系统。在这些实验中，在电穿孔细胞上进行facs分析(图6a)和大量细胞荧光素酶测定(图6b)。在电穿孔后5小时将ifn加入细胞培养基中。在电穿孔后18小时一式三份收集样品用于分析。图7a-c图示总结了进行另一个示例性大量荧光素酶分析的结果，以证明在编码非结构蛋白基因的序列上游掺入dlp基序的修饰的甲病毒复制子rna可以在已用ifn处理的宿主细胞中有效复制和表达以诱导细胞先天免疫系统。在这些实验中，对电穿孔细胞进行了大量细胞荧光素酶测定。在电穿孔后立即或在电穿孔后3小时将ifn加入细胞培养基中。在电穿孔后18小时一式三份收集样品用于分析。图7a：α-rff对α-r-rff构建体；图7b：α-rff对α-dlp-2a-nsp-rff；和图7c：α-rff对α-r-dlp-2a-nsp-rff构建体。图8图示总结了进行示例性体内实验的结果，以证明在编码非结构蛋白基因的序列上游掺入dlp基序的经修饰的甲病毒复制子rna可在ba1b/c小鼠中有效复制和表达。在这些实验中，进行了注射经修饰的甲病毒复制子rna的动物的全身成像。每只动物肌内注射7.5μg复制子rna。在第1天，第3天和第7天对个体动物成像。原始：注射α-r-rff构建体的小鼠；dlp：注射α-r-dlp-2a-nsp-rff构建体的小鼠。图9示意性地描绘了非限制性示例性甲病毒基因组结构和基因组表达(改编自strauss等人，microbiologicalreviews，pp.491-562，1994年9月)。显示了sindbis病毒(sinv)的基因组组织。给出了非结构基因和结构蛋白基因的名称。参考基因和蛋白质的命名可以在strauss等人，同上，1994中找到。49s基因组rna在中心示意性地说明，其翻译的orf显示为空心框。小黑框是保守的序列元素；空心菱形表示渗漏的蛋白石终止密码子。非结构性多蛋白及其加工产品如上所示。蛋白石密码子的终止产生p123，其在复制中的主要功能被认为是一种蛋白酶，其在反式中起作用以加工活性rna复制酶中的多蛋白；这种蛋白酶结构域存在于nsp2区域。对蛋白石终止密码子的通读产生p1234，其可以形成活性复制酶。下面扩展26s亚基因组mrna以显示结构orf及其翻译产物。存在于病毒粒子中的多肽是阴影的。vcrna是基因组rna的负链互补物。图10示意性地描绘了eav基因组结构和基因组表达策略。给出了复制酶基因和结构蛋白基因的名称(参考基因和蛋白质的命名可以在snijder等人，2005中找到)。在基因组组织下方，描绘了基因组和sgmrna的结构关系。在eavmrna的5’末端发现的前导序列和trs分别表示为蓝色和橙色框。指示在基因组长度mrna1中发现的核糖体移码元件(rfs)，并且每个mrna的翻译区域用绿线突出显示，而翻译沉默区域用红线表示。仅针对每种mrna指示翻译的开放阅读框。右侧图显示了从感染细胞分离的eavmrna的典型模式，通过与基因组3’末端互补的探针杂交可视化，因此识别所有病毒mrna种类。图11a-b示意性地显示了具有谷-峰拓扑结构的甲病毒mrna26s的5’cds区的预测的茎环rna结构。rna结构的二维(2d)模型基于来自七种代表性甲病毒mrna(sinv，sfv，rrv，sagv，getv，midv，unav，bebv，mayv和aurav)的cds的前70-140个核苷酸。序列从起始密码子(augi)编号，a是+1位。基于shape(选择性2’-羟基酰化和引物延伸)数据构建预测的结构(toribio等人，2016)。图12a-c图示总结了进行示例性体内实验的结果，以证明在ba1b/c小鼠中具有dlp基序的经修饰的甲病毒复制子rna对免疫原性的影响。在该实验中，使用不同剂量的复制子rna在第0天和第42天对6-8周龄的balb/c动物进行引发。在第56天收集脾和血清，和(a)使用检测用dextramers(h-2kd[iystvassl；seqidno：44]])和(b，c)ifn-γelispot进行ha特异性t细胞记忆(cd8+cd44+cd62lloklrg-1loil-7rahicxcr3hi)的流式细胞术以定量cd8+和cd4+t细胞效应子反应。统计学是使用普通单向方差分析(anova)使用匹配剂量之间的多重比较的统计学。图12a：与每种可比较剂量的未修饰复制子相比，在含有dlp基序的构建体中观察到记忆前体效应细胞(mpec)的显著增加。图12b：效应t细胞应答通过用cd8+t细胞肽刺激后分泌ifn-γ的抗原特异性ha细胞的数量来测量。图12c：效应t细胞应答通过用cd4+t细胞肽刺激后分泌ifn-γ的抗原特异性ha细胞的数量来测量。图13图示总结了进行示例性体内实验的结果，以证明在编码非结构蛋白基因的序列上游掺入dlp基序的经修饰的甲病毒复制子rna在ba1b/cmic中有效地防止在用模拟病毒感染的试剂预处理后抑制免疫应答。在接种前24小时，通过流体动力学尾静脉注射给予6-8周龄balb/c动物预处理20μgpoly(i∶c)或盐水，以模拟正在进行的病毒感染。然后在第0天引发小鼠并在第28天使用1.5μg剂量的编码ha的rna复制子加强免疫。在第42天收集血清，并在血清中测量ha特异性抗体。通过在四参数逻辑回归上使用8d2ha特异性单克隆抗体作为标准，稀释对光密度的内插来计算血清抗体浓度。使用mann-whitney(非参数)测试进行各组之间的统计学。图14a-14c图示总结了进行体内实验的结果，以证明根据本公开的含dlp的复制子与lnp(阳离子脂质纳米颗粒)制剂相容。在该实验中，在第0天引发6-8周龄的balb/c动物，并在第28天使用不同剂量的编码ha的rna复制子加强免疫。在第42天收集脾和血清。图14a：在血清中测量ha特异性抗体。血清抗体滴度是ec20％的倒数，并且通过在四参数逻辑回归上的稀释对光密度的插值来计算。图14b：ifn-γelispot用于定量cd8+细胞效应子反应。为了检测抗原特异性cd8+t细胞，将脾细胞与h-2kd(iystvassl；seqidno：44)肽一起温育。图14c：ifn-γelispot用于定量cd4+t细胞效应子反应。为了检测抗原特异性cd4+t细胞，将脾细胞与h2-d限制性cd4t细胞表位kssffrnvvwlikkn(seqidno：45)一起温育。使用mann-whitney(非参数)测试进行各组之间的统计学。图15图解说明了含有dlp的mrna的非限制性示例性构型，其中sindbis病毒dlp元件位于目的基因(goi；dsgfp)的编码序列的上游，并且5’utr直接位于t7启动子的下游和sindbis病毒dlp序列的上游。dsgfp的编码序列通过p2a信号与dlp元件连接，p2a信号是源自猪捷申病毒-1的自催化自切割肽(例如自身蛋白酶肽)。在该图的底部还显示了含dlp的mrna的另一种非限制性示例性构型，其中用作goi的去稳定形式的egfp报道基因(dsgfp)的编码序列与来源于小鼠鸟氨酸脱羧酶基因(modc)的蛋白水解pest降解信号可操作地连接。图16a-d图示总结了进行实验的结果，以证明含dlp的修饰mrna可赋予干扰素抗性。图16a：在mrna中包含dlp导致在ifn存在下gfp阳性细胞的频率在统计学上显著增加。在kruskai-wallist检验(非参数)中具有95％置信区间的平均值。图16b：未修饰的mrna对ifn治疗敏感(在双向anova中具有95％置信区间的平均值。相互作用：p＝0.0083。行：p＝＜0.0001。列：p＝0.0273。sidak的多重比较检验，*p＝0.0217和#p＝＜0.0241)。图16c：与存在ifn下，与未修饰的mrna相比，dlp修饰的mrna在每个细胞中产生统计学上显著的蛋白质产生增加30％(在双向anova中具有95％置信区间的平均值：p＝＜0.0001。sidak的多重比较测试，***p＝＜0.0002，****p＝＜0.0001)。图16d：在ifn存在下，与未修饰的mrna相比，dlp修饰的mrna产生等量的蛋白质(在双向anova中具有95％置信区间的平均值。相互作用：p＝＜0.0001。行：p＝＜0.0001。列：p＝0.0023。sidak的多重比较试验，****p＝＜0.0001，**p＝＜0.0023)。从以下描述和所附权利要求结合附图，本公开的前述和其它特征将变得更加明显。应理解，这些附图仅描述了根据本发明的若干实施方式，并且不应视为限制其范围；将通过使用附图以另外的特征和细节来描述本公开。具体实施方式本公开一般涉及用于调节细胞中基因表达的组合物和方法。本公开的一些实施方式涉及表达系统，例如基于病毒的表达系统，其具有优异的表达潜力，其适于在重组细胞中表达异源分子，例如疫苗和治疗性多肽。例如，本公开的一些实施方式涉及含有病毒衣壳增强子或其变体的一种或多种结构元件的核酸分子。在一些实施方式中，一种或多种结构元件中的至少一种包含rna茎环。在一些实施方式中，一种或多种结构元件中的至少一种与目的基因的编码序列可操作地连接。本公开的一些实施方式涉及核酸分子，例如转录和/或表达构建体和载体，其含有编码病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件的核酸序列。本文还在一些实施方式中公开了转录载体和表达载体，例如基于病毒的载体，其包含目的基因的编码序列。在一些实施方式中，本公开的核酸分子例如信使(mrna)和rna复制子通过从头合成和/或体外转录产生。经遗传修饰以包括一种或多种本文公开的核酸分子的重组细胞，以及衍生自这些细胞的生物材料和重组产物也在本申请的范围内。本文进一步提供了包含一种或多种本文公开的核酸分子和/或重组细胞的组合物和试剂盒，以及赋予宿主细胞中对先天免疫系统抗性的方法。在以下详细描述中，参考了附图，该附图形成本文的一部分。在附图中，除非上下文另有指示，否则类似的符号通常标识类似的组件。在具体实施方式，附图和权利要求中描述的说明性替代方案并不意味着是限制性的。在不脱离这里呈现的主题的精神或范围的情况下，可以使用其它替代方案，并且可以进行其它改变。容易理解的是，如本文一般描述的和图中所示的方面可以以各种不同的配置来布置、替换、组合和设计，所有这些都是明确预期的并且构成本申请的一部分。除非另外定义，否则本文使用的所有术语，符号和其它科学术语或术语旨在具有本申请所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的这些定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。本领域技术人员使用常规方法很好地理解并且通常采用本文描述或引用的许多技术和程序。一些定义除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一种”，“一个”和“该”包括复数指代。例如，术语“细胞”包括一种或多种细胞，包括其混合物。如本文所用，术语“约”具有大约的普通含义。如果上下文中没有明确的近似程度，则“约”表示在提供值的正或负10％范围内，或四舍五入到最接近的有效数字，在所有情况下均包括提供的值。在提供范围的情况下，它们包括边界值。本文使用的术语“细胞”，“细胞培养物”，“细胞系”，“重组宿主细胞”，“受体细胞”和“宿主细胞”包括原代受试细胞及其任何后代，没有关于转移的数量。在某些情况下，后代与亲代细胞不完全相同(由于故意或无意的突变或环境差异)；然而，这些改变的后代包括在这些术语中，只要后代保留与最初转化的细胞相同或基本相似的功能即可。如本文所用，术语“构建体”旨在表示任何重组核酸分子，例如表达盒，质粒，粘粒，黏粒，病毒复制子，穿梭载体，自主复制的多核苷酸分子，噬菌体，或线性或圆形、单链或双链、dna或rna多核苷酸分子，其衍生自任何来源，能够进行基因组整合或自主复制，包含核酸分子，其中核酸序列以功能可操作的方式连接，例如可操作地连接。本文使用的术语“衍生自”是指起源或来源，并且可包括天然存在的、重组的、未纯化的或纯化的分子。本公开的分子可以衍生自病毒或非病毒分子。源自原始蛋白质或多肽的蛋白质或多肽可以部分或全部包括原始蛋白质或多肽，并且可以是原始蛋白质或多肽的片段或变体。术语“基因”广泛用于指编码蛋白质或可转录成功能性rna的核酸分子的任何区段。基因可包括转录但不是最终、成熟和/或功能性rna转录物的一部分的序列，编码蛋白质的基因可进一步包含转录但未翻译的序列，例如5’非翻译区，3’非翻译区、内含子等。此外，基因可任选地进一步包含其表达所需的调节序列，并且此类序列可以是例如未转录或翻译的序列。基因可以从多种来源获得，包括从感兴趣的来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并且可以包括设计为具有所需参数的序列。本文使用的术语“天然的”是指核酸序列或氨基酸序列，因为它们天然存在于宿主中。术语“非天然的”在本文中用于指在宿主中不天然存在的核酸序列或氨基酸序列，或者不配置为它们在宿主中天然配置的核酸序列或氨基酸序列。已从宿主细胞中除去、经过实验室操作并导入或重新引入宿主细胞的核酸序列或氨基酸序列被认为是“非天然的”。引入宿主细胞或生物体的合成基因或部分合成基因是“非天然的”。非天然基因进一步包括宿主细胞内源的基因，其可操作地连接到已经重组到宿主基因组中的一种或多种异源调节序列，或在基因组的基因座而不是它们天然存在的地方中的宿主细胞或生物体内源的基因。如本文所用，术语“天然存在的”和“野生型”是指天然存在的形式。例如，天然存在的或野生型核酸分子，核酸序列或蛋白质可以存在于天然来源中并从天然来源分离，并且没有通过人为操作有意修饰的。如下文详细描述的，根据本公开的一些实施方式的核酸分子是非天然存在的核酸分子。当用于提及多核苷酸、基因或核酸分子时，术语“异源的”是指不源自宿主物种的多核苷酸、基因或核酸分子。例如，如本文所用的“异源基因”或“异源核酸序列”是指来自与其所引入的宿主生物的物种不同的物种的基因或核酸序列。当提及基因调控序列，例如增强子序列，或用于操纵基因序列表达的辅助核酸序列时(例如5’非翻译区，3’非翻译区，polya添加序列等)或编码蛋白质结构域或蛋白质定位序列的核酸序列，“异源”是指调节或辅助序列或者编码蛋白质结构域或定位序列的序列来自与调节或辅助核酸序列或者编码蛋白质结构域或定位序列的核酸序列并入基因组的基因不同的来源。因此，与其天然状态下不可操作地连接的基因可操作地连接的启动子(例如在非基因工程生物的基因组中)在本文中称为“异源启动子”，即使启动子可以来自与其连接的基因相同的物种(或在某些情况下，相同的生物体)。例如，在本文公开的一些实施方式中，异源目的基因(goi)的编码序列不以其天然状态与重组rna复制子序列连接。在一些实施方式中，编码goi序列源自另一种生物，例如另一种病毒，细菌，真菌，人细胞(肿瘤ag)，寄生虫(疟疾)等)。术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且指rna和dna分子，包括包含cdna的核酸分子，基因组dna，合成dna和含有核酸类似物的dna或rna分子。核酸分子可具有任何三维结构。核酸分子可以是双链或单链的(例如有义链或反义链)。核酸分子的非限制性实例包括基因，基因片段，外显子，内含子，信使rna(mrna)，转移rna，核糖体rna，sirna，微rna，tracrrna，crrna，指导rna，核酶，cdna，重组多核苷酸，支链多核苷酸，核酸探针和核酸引物。核酸分子可含有非常规或修饰的核苷酸。如本文所用的术语“多核苷酸序列”和“核酸序列”可互换地指多核苷酸分子的序列。本文使用37cfr§1.822中所述的核苷酸碱基的命名法。本公开的核酸分子可以通过本领域已知的任何方法在体外合成，例如，使用一种或多种化学或酶技术(例如，通过使用化学核酸合成，或通过使用用于复制，聚合，核酸外切消化，核酸内切酶消化，连接，逆转录，转录，碱基修饰(包括例如甲基化)或核酸分子重组(包括同源和位点特异性重组)的酶)。在一些实施方式中，本公开的核酸分子由从头合成产生。在一些实施方式中，核酸分子可以使用已知的化学方法，已知的酶技术或其任何组合从头全部或部分合成。例如，组分核酸序列可以通过固相技术合成，从树脂中除去，并通过制备性高性能1纯化液相色谱，然后进行化学连接和/或酶促连接以形成嵌合核酸分子。合成核酸分子的组成可以通过核酸分析或测序来确认。在一些实施方式中，可以使用本领域已知的技术从化学合成的寡核苷酸酶促组装本公开的核酸分子。本公开的核酸分子可以是任何长度的核酸分子，例如介于约0.5kb和约1000kb之间，介于约0.5kb和约500kb之间，介于约1kb和约100kb之间，介于约2kb和约50kb之间，或介于约5kb和约20kb。在一些实施方式中，核酸分子是或约为0.5kb，1kb，2kb，3kb，4kb，5kb，6kb，7kb，8kb，9kb，10kb，15kb，20kb，25kb，30kb，40kb，50kb，100kb，200kb，500kb，1mb或更多，或这些值中的任何两个之间的范围。就结构属性而言，本公开的多核苷酸可以是“生物学活性的”，例如核酸与另一核酸杂交的能力，或多核苷酸序列通过转录因子、核糖体和核酸聚合酶中的一种或多种被识别和结合的能力。如本文所用的术语“重组的”或“工程化的”核酸分子是指通过人为干预而改变的核酸分子。作为非限制性实例，cdna是重组dna分子，如通过体外聚合酶反应产生的任何核酸分子，或已连接有接头的任何核酸分子，或已整合到载体中的核酸分子，例如克隆载体或表达载体。作为非限制性实例，重组核酸分子：1)已经在体外合成或修饰，例如，使用化学或酶技术(例如，通过使用化学核酸合成，或通过使用复制，聚合，核酸外切消化，核酸内切酶消化，连接，逆转录，转录，碱基修饰(包括例如甲基化)，或核酸分子重组(包括同源和位点特异性重组)的酶；2)包括连接的核苷酸序列，其在自然界中没有结合，3)已经使用分子克隆技术设计，使得它相对于天然存在的核酸分子序列缺少一个或多个核苷酸，和/或4)已经使用分子克隆技术操纵，使得它具有相对于天然存在的核酸序列的一个或多个序列改变或重排。作为非限制性实例，cdna是重组dna分子，如通过体外聚合酶反应产生的任何核酸分子，或已连接有接头的任何核酸分子，或已整合到载体中的核酸分子，例如克隆载体或表达载体。在本文公开的一些实施方式中，本申请的重组核酸分子由从头合成产生。本文使用的术语“变体”是指具有与参考蛋白质的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的多肽，除了具有至少一个修饰的氨基酸，例如分别为缺失，插入或替换。氨基酸置换可以是保守氨基酸取代，优选在蛋白质中的非必需氨基酸残基上。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族是本领域已知的。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，β-分支侧链(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)的氨基酸。蛋白质的变体可具有与蛋白质的氨基酸序列至少约80％，90％，95％或99％，优选至少约90％，更优选至少约95％的氨基酸序列。优选地，变体是蛋白质的功能变体，其保留与蛋白质相同的功能。当用于提及核酸序列时，术语“变体”是指与另一个通常相关的核苷酸序列相差一个或多个核苷酸的核酸序列。因此，术语“变体”可以指参考核酸的一个或多个核苷酸的变化，其包括插入一个或多个新核苷酸，缺失一个或多个核苷酸，以及取代一个或多个现有核苷酸。“变异”是两种不同核苷酸序列之间的差异；通常，一个序列是参考序列。概括地说，本文所用的术语“核苷酸变异”包括点突变，多重突变，单核苷酸多态性(snp)，缺失，插入和易位。术语“参考核酸”在本文中用于描述具有已知目的参考序列的核苷酸序列。如本文所用，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当比较并对齐以在比较窗口上最大对应时，两个或更多个相同或具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同的序列或子序列。除非另有说明，否则所选序列的比较窗口，例如“seqidno：x”是seqidno：x的整个长度，并且例如，“seqidno：x的100bp”的比较窗口是规定的100bp。氨基酸或核酸序列同一性的程度可以通过各种计算机程序确定，用于基于指定的程序参数比对待比较的序列。例如，可以使用smith&watermanadv.app1.math.2：482-89，1981的局部同源性算法，needleman&wunschj.mo1.bio1.48：443-53，1970的同源性比对算法，pearson&lipmanproc.nat’1.acad.sci.usa85：2444-48，1988的相似性方法的研究来对齐和比较序列，并且可以基于目视检查进行对齐和比较，或者可以使用计算机程序进行分析(例如，wisconsingeneticssoftwarepackage，geneticscomputergroup，575sciencedr.，madison，wi中的gap，bestfit，fasta和tfasta)。除了计算序列同一性百分比之外，blast算法还对两个序列之间的相似性进行统计学分析(参见例如karlin&altschul，proc.nat’1.acad.sci.usa90：5873-87，1993)。最小和概率(p(n))提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.1，优选小于约0.01，更优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。如本文所用，术语“载体”是指设计用于转移至宿主细胞或宿主细胞之间的重组多核苷酸构建体，其可用于转化的目的，例如将异源dna导入宿主细胞。载体可以是例如复制子，例如质粒，噬菌体或粘粒，其中可以插入另一个dna片段以引起插入片段的复制。通常，当与适当的控制元件相关联时，载体能够复制。术语“载体”包括克隆载体和表达载体，以及病毒载体和整合载体。“表达载体”是包含调节区的载体，从而能够表达dna序列和片段，例如体外、离体和体内。在一些实施方式中，载体是质粒，噬菌体载体，粘粒，黏粒，病毒复制子或其组合。在一些实施方式中，载体是真核载体，原核载体(例如细菌质粒)或穿梭载体。表达系统可以是例如表达载体或表达盒。在一些实施方式中，载体是转录载体。术语“转录载体”是指能够转录但不翻译的载体。例如，转录载体可用于扩增其插入物。基于病毒的“复制子”表达载体可以用作例如疫苗和治疗组合物。复制子载体可以以几种形式使用，包括dna，rna和重组病毒颗粒。现在已有大量文献证明了病毒复制子载体对诸如疫苗的应用的有效性。而且，这些术语可统称为载体，载体构建体或基因递送载体。如本领域普通技术人员将理解的，出于任何和所有目的，例如就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围和其自范围的组合。任何列出的范围可以容易地被识别为充分描述并且使得相同的范围被分解为至少相等的二分之一，三分之一，四分之一，五分之一，十分之一等。作为非限制性示例，这里讨论的每个范围可以容易地分解。本领域技术人员还将理解所有语言，例如“多达”，“至少”，“大于”和“小于”等包括所述的数字，并且指的是可以随后分解成如上所述子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个物品的组。类似地，具有1-5个制品的组是指具有1、2、3、4或5个制品的组，等等。病毒衣壳增强子一些病毒具有能够形成一个或多个茎环结构的序列，其调节例如衣壳基因表达的增加。术语“病毒衣壳增强子”在本文中用于指包含能够形成这种茎环结构的序列的调节元件。在一些实例中，茎环结构由衣壳蛋白的编码序列内的序列形成，并命名为下游环(dlp)序列。如本文所公开，这些茎环结构或其变体可用于调节，例如增加目的基因的表达水平。例如，这些茎环结构或其变体可用于重组载体(例如在异源病毒基因组中)，用于增强与其下游可操作地连接的编码序列的转录和/或翻译。例如，通过病毒26s转录物中存在的显著rna结构，甲病毒属的成员可以抵抗抗病毒rna活化蛋白激酶(pkr)的活化，这允许这些mrna的eif2非依赖性翻译起始。该结构称为下游环(dlp)，位于sinv26smrna中和甲病毒属的其它成员中的aug的下游。在sindbis病毒的情况下，dlp基序位于sindbis亚基因组rna的前150个核苷酸中。发夹位于sindbis衣壳aug起始密码子的下游(aug在sindbis亚基因组rna的核苷酸50处整理)。先前对序列比较和结构rna分析的研究揭示了sinv中dlp的进化保守性，并预测了在甲病毒属的许多成员中存在等同的dlp结构(参见例如ventoso，j.virol.9484-9494，第86卷，2012年9月)。pkr使真核翻译起始因子2α(eif2α)磷酸化。eif2α的磷酸化阻断mrna的翻译起始，并且这样做可以使病毒免于完成有效的复制周期。pkr由干扰素和双链rna激活。已知宿主细胞中的甲病毒复制诱导双链rna依赖性蛋白激酶(pkr)。例如，sindbis病毒感染细胞诱导pkr，导致eif2α的磷酸化，但病毒亚基因组mrna被有效翻译，而所有其它细胞mrna的翻译受到限制。sindbis病毒的亚基因组mrna具有稳定的rna发夹环，其位于病毒衣壳蛋白(例如衣壳增强子)的野生型aug起始密码子的下游。该发夹环也称为茎环，rna结构通常称为下游loop结构(或dlp基序)。据报道，dlp结构可以阻止野生型aug上的核糖体，并且这支持亚基因组mrna的翻译而不需要功能性eif2α。因此，即使在具有高活性pkr的细胞中，sindbis病毒(sinv)以及其它甲病毒的亚基因组mrna也被有效翻译，导致eif2α的完全磷酸化。甲病毒dlp的结构首先在sindbis病毒(sinv)26smrna中表征dlp结构，并且还在semlikiforest病毒(sfv)中检测到dlp结构。据报道，类似的dlp结构存在于甲病毒属的至少14个其它成员中，包括新世界(例如，mayv，unav，eeev(na)，eeev(sa)，aurav)和旧世界(sv，sfv，bebv，rrv，sag，getv，midv，chikv和onnv)成员。基于shape(选择性2’-羟基酰化和引物延伸)数据构建这些甲病毒26smrna的预测结构(toribio等人，nucleicacidsres.may19；44(9)：4368-80，2016)，其内容在此引入作为参考)。除了chikv和onnv之外，在所有情况下都检测到稳定的茎环结构，而mayv和eeev显示出稳定性较低的dlp(参见图11a-b和toribio等人，2016，同上)。据报道，含有最稳定dlp结构的甲病毒的dlp活性最高。在一些情况下，dlp活性取决于dlp基序和起始密码子aug(augi)之间的距离。将甲病毒26smrna中的aug-dlp间距调整为核糖体18srrna的es6s区域的拓扑结构，其方式允许将augi置于由dlp停滞的40s亚基的p位点，允许掺入met-trna而没有eif2参与。检测到两种主要拓扑结构：sfv分支中的紧凑且稳定的结构，以及sinv组中更加扩展的结构。在两种情况下，观察到dlp结构之前是强烈的shape反应性区域，表明aug-dlp伸展的单链构象。因此，与全缺失小鼠mrna转录组或缺乏dlp的那些甲病毒属mrna中的等同位置相比，该区域显示高a含量和低g含量导致形成二级结构的低倾向。toribio等人(2016，同上)报道的这些结果表明甲病毒中dlp的出现可能与前一区域的扁平化有关，导致该mrna区域的谷-峰拓扑结构。在sindbis病毒的情况下，dlp基序位于sindbis亚基因组rna的前150个核苷酸中。发夹位于sindbis衣壳aug起始密码子(sindbis亚基因组rna的核苷酸50处的aug)的下游，导致核糖体停滞，使得正确的衣壳基因aug用于启动翻译。这是因为发夹导致核糖体暂停eif2α不需要支持翻译起始。不受任何特定理论的束缚，据信将dlp基序置于任何goi的编码序列的上游通常导致在发夹区域中编码为goi编码的蛋白质的n末端衣壳氨基酸的融合蛋白。因为起始发生在衣壳aug而不是goiaug。在本文公开的一些实施方式中，在dlp序列之后立即在体内设计猪捷申病毒-12a(p2a)肽序列，并且紧接在所有goi的上游框内设计。在本公开的经修饰的病毒rna复制子中掺入p2a肽允许从衣壳-g01融合体释放几乎原始的goi蛋白；向所有goi蛋白中加入单个脯氨酸残基。不受任何特定理论的束缚，据信dlp允许翻译以不依赖eif2α的方式发生，核酸分子和表达载体(例如rna复制子载体)被工程化为使用它来启动非结构蛋白的翻译，其在先天免疫系统激活的细胞中具有增加的功能。因此，预期dlp工程化的核酸分子和表达载体(例如rna复制子载体)在不同细胞、个体或个体群体中也具有更均匀的功能，因为每种细胞中先天免疫激活水平的差异自然会引起变化性。在一些实施方式中，dlp可以帮助去除该可变性，因为rna复制子载体的翻译和复制(以及goi表达)可以较少地受到预先存在的先天免疫应答的影响。本文公开的组合物和方法的重要价值之一是可以在处于慢性或急性免疫激活状态的个体中增加疫苗功效。慢性或急性免疫激活的原因可见于患有亚临床或临床感染的个体或接受癌症或其它疾病的医学治疗的个体(例如糖尿病，营养不良，高血压，心脏病，克罗恩病，肌肉硬化等)。如本文所述，本文公开的含dlp的核酸分子(例如，转录和表达载体(例如rna病毒复制子))可用于赋予受试者对先天免疫系统的抗性。未经修饰的rna复制子对它们被引入的细胞的初始先天免疫系统状态敏感。如果细胞/个体处于高活性先天免疫系统状态，则rna复制子性能(例如goi的复制和表达)可能受到负面影响。通过工程化dlp来控制蛋白质翻译的启动，特别是非结构蛋白质的启动，先天免疫系统的预先存在的活化状态影响有效的rna复制子复制的作用被消除或减少。结果是更均匀和/或增强的goi表达，其可影响疫苗效力或治疗的治疗效果。动脉炎动脉炎病毒(家族动脉炎病毒科，动脉炎病毒属)包括感染家畜和野生动物的一组重要的包膜单链正义rna病毒。动脉炎病毒与冠状病毒科的成员(冠状病毒和托罗沃病毒属)具有相似的基因组组织和复制策略，但它们的遗传复杂性，基因组长度，生物物理特性，大小，结构和病毒颗粒(例如病毒粒子)的结构蛋白组成存在很大差异。目前，动脉炎病毒属被认为包括马动脉炎病毒(eav)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)，乳酸脱氢酶升高病毒(ldv)，猿猴出血热病毒(shfv)和摇晃负鼠病病毒(wpdv)。典型的动脉炎病毒基因组长度在12.7和15.7kb之间变化，但它们的基因组组织与一些微小变化相对一致。动脉炎病毒的示例性基因组组织和病毒粒子结构示于图10中。动脉炎病毒基因组是多顺反子+rna，具有5’和3’非翻译区(ntr)，其位于10-15个已知orf的阵列侧翼。大的复制酶orf1a和1b占据基因组的5’近端四分之三，orf1a的大小比orf1b的大小多得多。orf1a的翻译产生复制酶多蛋白(pp)1a，而orf1b由-1编程的核糖体移码(prf)表达，其在c末端将pp1a延伸到pp1ab。另外，据报道，短反式框架orf在+1框架中与orf1a的nsp2编码区重叠，并由-2prf表示。3’近端基因组部分具有紧凑的组织并且包含8至12个相对较小的基因，其中大多数与相邻基因重叠。这些orf编码结构蛋白，并由3’-共末端嵌套的sgmrna组表达。这些orf的组织是保守的，但orf1b，shfv和所有最近鉴定的shfv样病毒的下游含有三个或四个额外的orf(～1.6kb)，其可以源自orf2-4的古老重复。与orf1a的大小变异一起，这种假定的重复解释了动脉炎病毒之间的基因组大小差异。关于马动脉炎病毒(eav)，野生型eav基因组的大小约为12.7kb。基因组的5’四分之三编码两个大的复制酶蛋白1a和1ab；两种蛋白质的氨基酸序列在n末端相同，但由于核糖体移码，1ab的c末端区域的氨基酸序列是独特的。eav基因组的3’四分之一编码病毒的结构蛋白基因，所有这些基因都是从亚基因组rna中表达的。亚基因组rna形成嵌套的3’共末端rna，其通过不连续的转录机制产生。亚基因组rna由与基因组rna不连续的序列组成。所有eav亚基因组rna共有共同的5’前导序列(长度为156至221个核苷酸)，与基因组5’序列相同。亚基因组rna的前导和主体部分通过称为转录调节序列(trs)的保守序列连接。trs位于前导序列的3’末端(前导序列trs)以及位于每个结构蛋白基因(主体trs)上游的亚基因组启动子区域。当转录负链复制中间rna时，产生亚基因组rna。当转录发生时，复制复合物在到达每个主体trs时暂停，然后新生的负链rna变得与互补的正链前导trs相关联，其中负链rna转录继续。这种不连续的转录机制导致具有5’和3’eav保守序列两者的亚基因组rna。然后，负链亚基因组rna成为用于产生亚基因组正义mrna的模板。已经报道了代表eav的整个基因组的感染性cdna克隆，并且它们在近二十年已经用于研究eavrna复制和转录。另外，已经产生含有插入orf2和orf7的氯霉素乙酰转移酶(cat)基因的感染性克隆，并且显示cat蛋白在用这些rna电穿孔的细胞中表达。通过定点诱变和结构蛋白基因区缺失修饰感染性克隆已被用于确定支持rna复制的每个结构基因的需要(molenkamp2000)。molenkamp2000报告的研究得出结论，结构基因不需要支持rna复制。对亚基因组rna产生中trs活性的序列同源性要求进行分析，并用于更好地定义不连续转录机制发生的方式(vanmarle1999，pasternak2000，pasternak2001，pasternak2003，vandenborn2005)和缺陷干扰rna已被用于了解rna复制和包装到病毒颗粒所需的最小基因组序列(molenkamp2000a)。甲病毒甲病毒属于第iv组披膜病毒科的遗传、结构和血清学相关的病毒，其包括至少30个成员，每个成员具有包围在含有病毒尖峰蛋白的包膜所包围的核衣壳中的正极性的单链rna基因组。目前，甲病毒属包括sindbis病毒(sin)，semlikiforest病毒(sfv)，rossriver病毒(rrv)，委内瑞拉马脑炎病毒(veev)和东部马脑炎病毒(eeev)等，所有这些都密切相关，能够感染各种脊椎动物，如哺乳动物，啮齿动物，鱼类，鸟类和大型哺乳动物，如人类和马匹，以及无脊椎动物，如昆虫。物种和个体之间的传播主要通过蚊子进行，使得甲病毒成为收集虫媒病毒或节肢动物病毒的贡献者。特别是sindbis和semlikiforest病毒已被广泛研究，因此，这些病毒的生命周期、复制方式等已被充分表征。特别是已显示甲病毒在动物细胞中非常有效地复制，这使得它们作为在这些细胞中产生蛋白质和核酸的载体是有价值的。甲病毒颗粒被包封，具有70nm直径，倾向于是球形的(尽管略微多形)，并且具有约40nm的等长核衣壳。图9描绘了典型的甲病毒基因组结构和基因组表达。甲病毒属基因组是长度约为11-12kb的正极性单链rna，包含5’帽，3’poly-a尾和两个开放阅读框，第一个框架编码具有酶功能的非结构蛋白，并且第二个框架编码病毒结构蛋白(例如衣壳蛋白c，e1糖蛋白，e2糖蛋白，e3蛋白和6k蛋白)。甲病毒基因组的5’三分之二编码病毒rna转录和复制所必需的许多非结构蛋白。这些蛋白质直接从rna翻译，并与细胞蛋白质一起形成rna依赖性rna聚合酶，这对于病毒基因组复制和亚基因组rna的转录是必需的。四种非结构蛋白(nsp1-4)作为单一多蛋白产生，其构成病毒的复制机制。多蛋白的加工以高度调节的方式发生，p2/3连接处的切割影响基因组复制期间rna模板的使用。该位点位于狭窄裂口的基部，并且不易接近。切割后，nsp3会创建环绕nsp2的环形结构。这两种蛋白质具有广泛的界面。在p2/p3界面区域产生非细胞病变病毒或温度敏感表型的nsp2突变。与nsp2非致细胞病变突变位置相对的p3突变阻止p2/3的有效切割。这反过来会影响rna感染性，从而改变病毒rna的产生水平。基因组的3’三分之一包含亚基因组rna，其用作翻译形成病毒颗粒所需的所有结构蛋白的模板：核心核衣壳蛋白c，以及作为异二聚体结合的包膜蛋白p62和e1。病毒膜锚定的表面糖蛋白负责受体识别并通过膜融合进入靶细胞。亚基因组rna由存在于编码nsp4蛋白的rna序列的3’末端的p26s亚基因组启动子转录。p62在e2和e3中的蛋白水解成熟导致病毒表面的变化。与e1，e2和有时e3一起，糖蛋白“尖峰”形成e1/e2二聚体或e1/e2/e3三聚体，其中e2从中心延伸到顶点，e1填充顶点间的空间，e3如果存在则位于尖峰的远端。当病毒暴露于内体的酸性时，e1从e2解离形成e1同源三聚体，这是融合步骤将细胞和病毒膜一起驱动所必需的。甲病毒糖蛋白e1是ii类病毒融合蛋白，其在结构上不同于在流感病毒和hiv中发现的i类融合蛋白。e2糖蛋白通过其细胞质结构域与核衣壳相互作用，而其胞外域负责结合细胞受体。大多数甲病毒失去外周蛋白e3，而在semliki病毒中，它仍然与病毒表面有关。已报道甲病毒复制发生在宿主细胞内的膜表面上。在感染周期的第一步中，基因组rna的5’末端被翻译成具有rna聚合酶活性的多蛋白(nsp1-4)，其产生与基因组rna互补的负链。在第二步中，负链用作分别产生两种rna的模板：(1)对应于次级病毒基因组通过翻译产生其它nsp蛋白并充当病毒基因组的阳性基因组rna；(2)编码形成感染性颗粒的病毒结构蛋白的亚基因组rna。阳性基因组rna/亚基因组rna比率通过多蛋白的蛋白水解自动切割调节至nspl，nsp2，nsp3和nsp4。实际上，病毒基因表达分两个阶段进行。在第一阶段，主要合成阳性基因组链和负链。在第二阶段，亚基因组rna的合成实际上是排他性的，因此导致产生大量结构蛋白。先天免疫由于先天免疫激活可以由于许多不同的刺激而发生，因此依赖于自身扩增rna复制子来表达抗原或治疗性goi的疫苗方法可能受到与eif2α的pkr磷酸化相关的全局宿主蛋白质关闭的负面影响。工程化rna复制子在细胞环境中起作用，其中宿主蛋白质翻译被抑制将为这些系统提供优于标准rna复制子系统的显著优势。因此，受先天免疫应答负面影响的rna复制子系统，例如衍生自甲病毒和动脉病毒的系统，在设计成含有dlp基序时可以更有效地表达其编码的goi。dlp基序在细胞环境中赋予有效的mrna翻译，其中细胞mrna翻译被抑制。当dlp与复制子载体非结构蛋白基因的翻译连接时，复制酶和转录酶蛋白能够在pkr活化的细胞环境中启动功能性复制。当dlp与亚基因组mrna的翻译相关联时，即使当细胞mrna由于先天免疫激活而受到限制时，goi表达也是可能的。因此，含有dlp结构以帮助驱动非结构蛋白基因和亚基因组mrna翻译的工程化复制子提供了另一种克服先天免疫激活的有效方法。本公开的一些实施方式涉及dlp结构，其已被工程化以支持源自两种不同病毒，委内瑞拉马脑炎病毒(veev)和马动脉炎病毒(eav)的复制子载体的病毒非结构基因的翻译，因此向系统传达先天免疫反应逃避。如下文更详细描述的，将dlp结构掺入复制子载体使得它们都对干扰素(ifn)处理具有抗性，并且出乎意料地还导致goi表达潜力的总体增加。通过将dlp工程化到rna复制子系统中而赋予的ifn抗性和优异蛋白质表达潜力的组合使得它们适合用于急性或长期存在先天免疫激活的个体或群体。本公开的核酸分子本公开的一些方面涉及核酸分子，例如合成或重组核酸分子，其包括一个或多个dlp基序，一个或多个dlp基序的编码序列，或其组合。在一些实施方式中，本公开的核酸分子可包括与dlp基序可操作地连接的目的基因(goi)的编码序列和/或dlp基序的编码序列。在一个方面，本文公开了核酸分子，其包含(i)编码病毒衣壳增强子或其变体的一种或多种结构元件的第一核酸序列；(ii)与第一核酸序列可操作地连接的第二核酸序列，其中第二核酸序列包含目的基因(goi)的编码序列。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件中的至少一种包含一个或多个rna茎环。在一些实施方式中，一个或多个rna茎环中的至少一个由第一核酸序列中存在的dlp基序包含。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件中的至少一种不包含任何rna茎环。如上所述，病毒衣壳增强子包含与其可操作地连接的序列的增强表达(例如转录和/或翻译)的5’非编码和/或5’编码序列(优选5’编码序列)内的序列。在本公开的一些实施方式中，病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件包括病毒衣壳增强子的一个或两个rna茎环。在一些实施方式中，本公开的病毒衣壳增强子包括含有26s亚基因组启动子的序列。在一些实施方式中，本公开的病毒衣壳增强子含有在病毒26srna的约核苷酸20至250，约核苷酸20至200，约核苷酸20至150，约核苷酸20至100，或约核苷酸50至250，约核苷酸100至250，约核苷酸50至200，约核苷酸75至250，约核苷酸75至200，约核苷酸75至150，约核苷酸77至139，或约核苷酸100至250，约核苷酸150至250，约核苷酸约100至150，约为核苷酸100至200的5’编码序列，其能够形成发夹结构。在一些实施方式中，编码病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件的第一核酸序列对于增强与其可操作地连接的异源序列的表达是重要的。在一些实施方式中，第一核酸序列包括病毒衣壳增强子的一个或多个rna茎环的编码序列。在一些实施方式中，编码病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件的第一核酸序列对于增强与其可操作地连接的异源序列的翻译是重要的。在一些实施方式中，编码病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件的第一核酸序列对于增强与其可操作地连接的异源序列的转录是重要的。在一些实施方式中，核酸分子的第一核酸序列包括来自病毒衣壳蛋白的5’编码序列的至少约50，约75，约100，约150，约200，约300或更多个核苷酸。在一些实施方式中，核酸分子的第一核酸序列包括来自病毒衣壳蛋白的5’编码序列的约50，约75，约100，约150，约200，约300或更多个，或这些值中的任何两个之间的范围的核苷酸。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子衍生自甲病毒属的衣壳基因，所述甲病毒属选自由东部马脑炎病毒(eeev)，委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，everglades病毒(evev)，mucambo病毒(mucv)，semlikiforest病毒(sfv)，pixuna病毒(pixv)，middleburg病毒(midv)，chikungunya病毒(chikv)，o’nyong-nyong病毒(onnv)，rossriver病毒(rrv)，barmahforest病毒(bf)，getah病毒(get)，sagiyama病毒(sagv)，bebaru病毒(bebv)，mayaro病毒(mayv)，una病毒(unav)，sindbis病毒(sinv)，aura病毒(aurav)，whataroa病毒(whav)，babanki病毒(babv)，kyzylagach病毒(kyzv)，西部马脑炎病毒(weev)，highlandj病毒(hjv)，fortmorgan病毒(fmv)，ndumu(nduv)和buggycreek病毒组成的组。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子衍生自sindbis病毒种或semlikiforest病毒种的衣壳基因。在一些特定的实施方式中，病毒衣壳增强子衍生自sindbis病毒种的衣壳基因。另外，本领域普通技术人员将理解，可以在病毒衣壳蛋白的5’编码序列中进行修饰而基本上不降低其增强活性。关于这方面的更多信息可以在例如frolov等人，j.virology70：1182，1994；frolov等人，j.virology68：8111，1994中找到。在一些实施方式中，这种突变可以有利地基本上保留由5’衣壳编码序列形成的rna发夹结构。在一些实施方式中，本文公开的病毒衣壳增强子不含有发夹结构上游的衣壳蛋白的5’编码序列中的一个或多个或全部。在一些实施方式中，本文公开的病毒衣壳增强子不包含位于发夹结构上游的病毒衣壳蛋白的所有5’编码序列。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子序列可编码全部或部分衣壳蛋白。因此，在本文公开的一些实施方式中，衣壳增强子区域不编码整个病毒衣壳蛋白。在一些实施方式中，病毒衣壳增强子序列编码来自病毒衣壳蛋白的氨基末端片段。在其中功能性衣壳蛋白由衣壳增强子序列编码的那些实施方式中，可能需要消除衣壳自身蛋白酶活性。降低或消除衣壳蛋白的自身蛋白酶活性的衣壳突变是本领域已知的(参见例如wo1996/37616)。另外或可替代地，可以改变衣壳蛋白中的一个或多个氨基酸残基以降低衣壳蛋白酶活性。如上所述，先前对序列比较和结构rna分析的研究揭示了在甲病毒属的许多成员中dlp基序的进化保守性(参见例如ventoso，2012，同上)。因此，在一些进一步的实施方式中，本公开的病毒衣壳增强子序列可以是任何其它变体序列，例如合成序列或异源序列，其可以在功能上或结构上形成rna发夹，等同于一个或多个rna茎环，其预测用于病毒衣壳增强子并且可以起到增强与其下游可操作地连接的rna序列的翻译(例如目的基因的编码序列)。可用作转录和/或翻译增强子的rna茎环的非限制性实例包括图11a-b中所示的那些。在一些实施方式中，本公开的核酸分子包括源目sindbis病毒(sinv；nc001547.1)，aura病毒(aurav；af126284)，chikungunya病毒(chikv；nc004162)，o’nyong-nyong病毒(onnv；nc001512)，东部马脑炎病毒(eeev(sa)；af159559和eeev(na)；u01558)，mayaro病毒(mayv；dq001069)，semlikiforest病毒(sfv；nc003215)，rossriver病毒(rrv；dq226993和sagiyama病毒(sagv；ab032553)，getah病毒(getv；nc006558)，middelburg病毒(midv；ef536323)，una病毒(unav；af33948)或bebaru病毒(bebv；af339480)的甲病毒衣壳增强子或其变体，如toribio等人，2016同上所述，其内容通过引用整体并入本文。与本文公开的病毒衣壳增强子的编码序列具有高度序列同一性(例如至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性)的核酸分子可以通过使用本文所述的序列(例如seqidno：1)或本领域已知的任何其它甲病毒衣壳蛋白鉴定和/或分离，例如，通过使用sindbis病毒(sinv；nc001547.1)，aura病毒(aurav；af126284)，chikungunya病毒(chikv；nc004162)，o’nyong-nyong病毒(onnv；nc001512)，东部马脑炎病毒(eeev(sa)；af159559和eeev(na)；u01558)，mayaro病毒(mayv；dq001069)，semlikiforest病毒(sfv；nc003215)，rossriver病毒(rrv；dq226993和sagiyama病毒(sagv；ab032553)，getah病毒(getv；nc006558)，middelburg病毒(midv；ef536323)，una病毒(unav；af33948)和bebaru病毒(bebv；af339480)，通过基因组序列分析、杂交，和/或用来自相应甲病毒基因组中鉴定的序列的简并引物或基因特异性引物进行pcr。例如，病毒衣壳增强子可以包含来自属于披膜病毒科的病毒种的dlp基序，或由其组成，例如甲病毒属或红色病毒属。在一些实施方式中，本公开的核酸分子包括病毒衣壳增强子，其所具有的核酸序列与甲病毒衣壳蛋白的5’cds部分表现出至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在一些实施方式中，甲病毒衣壳蛋白的5’cds部分包含甲病毒衣壳蛋白的编码序列的至少前25，50，75，80，100，150或200个核苷酸。在一些实施方式中，本公开的核酸分子包括病毒衣壳增强子，其所具有的核算序列与seqidno：1和46-52中任一个的核酸序列表现出至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在一些实施方式中，核酸分子包含病毒衣壳增强子，其所具有的核酸序列与seqidno：1和46-52中任一个的核酸序列表现出80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％或这些值中的任何两个之间的范围的序列同一性。在一些实施方式中，本公开的核酸分子包括病毒衣壳增强子，其所具有的核酸序列与本文公开的seqidno：1的序列表现出至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方式中，本公开的核酸分子包括病毒衣壳增强子，其所具有的核酸序列与toribio等人(2016，同上)的出版物中的图11a-b和/或图1a中描述的任一个序列表现出至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性，其内容通过引用整体并入本文。因此，在一些实施方式中，本公开的核酸分子包括病毒衣壳增强子，其所具有的核酸序列与本文公开的seqidno：46-52中任一个的序列表现出至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在一些实施方式中，本公开的核酸分子包括病毒衣壳增强子，其所具有的核酸序列与本文公开的seqidno：46所示的序列表现出至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在一些实施方式中，本公开的核酸分子包括病毒衣壳增强子，其所具有的核酸序列与本文公开的seqidno：47所示的序列表现出至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在一些实施方式中，本公开的核酸分子包括病毒衣壳增强子，其所具有的核酸序列与本文公开的seqidno：48所示的序列表现出至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在一些实施方式中，本公开的核酸分子包括病毒衣壳增强子，其所具有的核酸序列与本文公开的seqidno：49所示的序列表现出至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在一些实施方式中，本公开的核酸分子包括病毒衣壳增强子，其所具有的核酸序列与本文公开的seqidno：50所示的序列表现出至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在一些实施方式中，本公开的核酸分子包括病毒衣壳增强子，其所具有的核酸序列与本文公开的seqidno：51所示的序列表现出至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在一些实施方式中，本公开的核酸分子包括病毒衣壳增强子，其所具有的核酸序列与本文公开的seqidno：52所示的序列表现出至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在根据本公开的一些实施方式的核酸分子中，一个或多个rna茎环可操作地位于第二核酸序列的goi的编码序列的上游。在一些实施方式中，一个或多个rna茎环可操作地位于goi的编码序列上游的约1至约50个核苷酸，约10至约75个核苷酸，约30至约100个核苷酸，约40至约150个核苷酸，约50至约200个核苷酸，约60至约250个核苷酸，约100至约300个核苷酸，或约150至约500个核苷酸。在一些实施方式中，一个或多个rna茎环可操作地位于goi的编码序列上游的约1，约2，约5，约10，约15，约20，约25，约30，约40，约50，约60，约60，约70，约80，约90，约100，约200，约300，约400，约500个，或这些值中的任何两个之间的范围的核苷酸。在一些实施方式中，一个或多个rna茎环可操作地紧邻goi的编码序列的上游。在一些实施方式中，核酸分子还包含可操作地位于第一核酸序列上游的5’-非翻译区(5’-utr)序列。在一些实施方式中，5’-utr序列可操作地位于第一核酸序列上游的约1至约50，约10至约75，约30至约100，约40至约150，约50至约200，约50至约200，约60至约250，约100至约300，或约150至约500个核苷酸。在一些实施方式中，5’-utr序列可操作地位于第一核酸序列上游的约1，约2，约5，约10，约15，约20，约25，约30，约40，约50，约60，约70，约80，约90或100个核苷酸。在一些实施方式中，5’-utr序列可操作地紧邻第一核酸序列的上游。在一些实施方式中，5’utr序列可操作地位于启动子的下游。在一些实施方式中，5’-utr序列可操作地位于启动子序列下游的约1至约50，约10至约75，约30至约100，约40至约150，约50至约200，约50至约200，约60至约250，约100至约300，或约150至约500个核苷酸。在一些实施方式中，5’utr序列可操作地位于启动子序列下游的约1，约2，约5，约10，约15，约20，约25，约30，约40，约50，约60，约70，约70，约80，约90或100个核苷酸。在一些实施方式中，5’utr序列可操作地位于启动子序列的紧邻下游。在一些实施方式中，5’utr序列可操作地位于启动子的下游和第一核酸序列的上游。在一些实施方式中，核酸分子包含可操作地位于第二核酸序列下游的3’非翻译区(3’utr)序列。在一些实施方式中，3’utr序列可操作地定位于第二序列核酸序列下游的约1至约50个核苷酸，约10至约75个核苷酸，约30至约100个核苷酸，约40至约150个核苷酸，约50至约200个核苷酸，约60至约250个核苷酸，约100至约300个核苷酸，或约150至约500个核苷酸。在一些实施方式中，3’utr序列可操作地位于第二核酸序列下游的约1，约2，约5，约10，约15，约20，约25，约30，约40，约50，约60，约70，约70，约80，约90，约100，约200，约300，约400，约500个，或这些值中的任何两个之间的范围的核苷酸。在一些实施方式中，3’utr序列可操作地紧邻第二核酸序列的下游。在本文公开的一些实施方式中，goi的编码序列被转录成信使rna(mrna)或mrna的一部分。如本文所用，术语“mrna”或“信使rna”是指在转录期间合成的单链rna分子，其与双链dna的一条链互补，并用于传递dna中包含的遗传信息到核糖体进行蛋白质合成。mrna可以是剪接的、部分剪接的或未剪接的，并且可以是真核或原核mrna。如上所述，根据本公开的一些实施方式的mrna分子可以通过从头合成产生。在本文公开的一些实施方式中，goi的编码序列编码多肽。在一些实施方式中，多肽是治疗性多肽，预防性多肽，诊断性多肽，营养保健多肽，工业酶，报告多肽或其任何组合。在一些实施方式中，多肽是抗体，抗原，免疫调节剂，细胞因子，酶或其任何组合。在一些实施方式中，本公开的核酸分子还包括自身蛋白酶肽(例如自催化自切割肽)的编码序列，其中自身蛋白酶的编码序列任选地在第二核酸序列的上游可操作地连接。通常，本领域已知的任何蛋白水解切割位点可以掺入本公开的核酸分子中，并且可以是例如蛋白酶在产生后切割的蛋白水解切割序列。其它合适的蛋白水解切割位点还包括蛋白水解切割序列，其可在加入外部蛋白酶后切割。如本文所用，术语“自身蛋白酶”是指“自切割”肽，其具有自身蛋白水解活性并且能够从较大的多肽部分切割自身。首先在口蹄疫病毒组(fmdv)中鉴定出一种小核糖核酸病毒组成员，随后鉴定了几种自身蛋白酶，例如来自马鼻炎病毒(e2a)，猪捷申病毒-1(p2a)和托西埃塞病毒(t2a)的“2a样”肽，以及它们在蛋白水解切割中的活性已经在各种体外和体内真核系统中显示。因此，自身蛋白酶的概念对于本领域技术人员是可用的，已经鉴定了许多天然存在的自身蛋白酶系统。研究得很好的自身蛋白酶系统例如是病毒蛋白酶，发育蛋白(例如hetr，hedgehog蛋白)，ruma自身蛋白酶结构域，umud等)。适用于本公开的组合物和方法的自身蛋白酶肽的非限制性实例包括来自猪捷申病毒-12a(p2a)，口蹄疫病毒(fmdv)2a(f2a)，马鼻炎病毒(erav)2a(e2a)，托西埃塞病毒2a(t2a)，细胞质多角体病毒2a(bmcpv2a)，软化病病毒2a(bmifv2a)的肽序列或其组合。在一些实施方式中，自身蛋白酶肽的编码序列在第一核酸序列的下游和第二核酸序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，自身蛋白酶肽包含选自由下以下组成的组的肽序列或由其组成：猪捷申病毒-12a(p2a)，口蹄疫病毒(fmdv)2a(f2a)，马鼻炎病毒(erav)2a(e2a)，托西埃塞病毒2a(t2a)，细胞质多角体病毒2a(bmcpv2a)，软化病病毒2a(bmifv2a)及其组合。在一些实施方式中，自身蛋白酶肽包括猪捷申病毒-12a(p2a)的肽序列。本领域技术人员将理解，可以使用病毒衣壳增强子序列、编码自身蛋白酶肽的序列和编码目的基因的序列的不同构型，只要衣壳增强子序列增强异源核酸序列的表达即可，例如与不存在衣壳增强子序列时所见的水平相比，goi的编码序列。通常配置这些序列，使得目的基因编码的多肽可以在被自身蛋白酶切割后从蛋白酶和任何衣壳蛋白序列中释放。本文所述的自身蛋白酶肽(例如p2a，f2a，e2a，t2a，bmcpv2a和bmifv2a)与本文所述的一种或多种病毒衣壳增强子序列的示例性组合的非限制性列表提供于表1和2中。表1提供了每种病毒衣壳增强子的简写名称(例如“ce01”)和每种自身蛋白酶肽的简写名称(例如“ap01”)。表2中每个编号的’x’肽具有表1中提供的相应的自身蛋白酶肽。同样，表2中每个编号的’y’增强子具有表1中提供的相应的病毒衣壳增强子。因此，表2中输入的每个“x∶y”提供了可用于本公开的分子、组合物和方法的病毒衣壳增强子和自身蛋白酶肽的组合的实例。例如，表2中称为“ap01∶ce16”的组合提供了源自sindbis病毒(sinv)的病毒衣壳增强子和来自猪捷申病毒-12a(p2a)的自身蛋白酶肽的组合。表1：本公开的示例性病毒衣壳增强子和自身蛋白酶肽表2：在一个方面，本文公开了新的核酸分子，其包括编码经修饰的病毒rna复制子的核酸序列，其中经修饰的病毒rna复制子包括编码病毒衣壳增强子(例如dlp基序)的一种或多种结构元件的第一核酸序列或其变体，其中病毒衣壳增强子对病毒rna复制子是异源的；和编码至少一种非结构病毒蛋白或其部分的第二核酸序列，其中第一核酸序列在第二核酸序列的上游可操作地连接。在一个方面，本文公开了新的核酸分子，其包括编码经修饰的病毒rna复制子的核酸序列，其中经修饰的病毒rna复制子包括编码病毒衣壳增强子(例如dlp基序)的一种或多种结构元件的第一核酸序列或其变体，其中病毒衣壳增强子对病毒rna复制子是异源的；和编码至少一种非结构病毒蛋白或其部分的第二核酸序列，其中第一核酸序列在第二核酸序列的上游可操作地连接。本文可互换使用的术语“复制子rna”和“rna复制子”是指包含在允许细胞内指导其自身扩增或自我复制所需的所有遗传信息的rna。为了指导其自身的复制，rna分子1)编码聚合酶、复制酶或其它蛋白质，其可以与病毒或宿主细胞衍生的蛋白质、核酸或核糖核蛋白相互作用以催化rna扩增过程；2)含有复制和转录亚基因组复制子编码的rna所需的顺式作用rna序列。这些序列可以在复制过程中与其自身编码的蛋白质或非自身编码的细胞衍生的蛋白质、核酸或核糖核蛋白或任何这些组分之间的复合物结合。在本公开的一些实施方式中，经修饰的病毒复制子rna分子通常含有以下有序元件：顺式复制所需的5’病毒或缺陷型干扰rna序列，编码生物活性非结构蛋白的序列，用于亚基因组rna的启动子，顺式复制所需的3’病毒序列和多腺苷酸束。此外，术语复制子rna通常是指正极性或“信息”意义的分子，并且复制子rna的长度可以与任何已知的天然存在的rna病毒的长度不同。在本公开的一些实施方式中，复制子rna不含有至少一种结构病毒蛋白的编码序列。在这些情况下，编码结构基因的序列可以被一个或多个异源序列取代，例如，目的基因(goi)的编码序列。在将复制子rna包装成重组甲病毒颗粒的情况下，它必须含有一个或多个序列，即所谓的包装信号，其用于启动与导致颗粒形成的甲病毒结构蛋白的相互作用。如本文所用，“亚基因组rna”是指rna分子的长度或大小小于衍生它的基因组rna。病毒亚基因组rna应该从内部启动子转录，其序列位于基因组rna或其互补序列内。亚基因组rna的转录可以由与宿主细胞编码的蛋白质、核糖核蛋白或其组合相关的病毒编码的聚合酶介导。在本公开的一些实施方式中，亚基因组rna由如本文公开的经修饰的复制子rna产生，并编码或表达一种或多种目的基因(goi)。可以将亚基因组rna置于来自脑心肌炎病毒(emcv)，牛病毒性腹泻病毒(bvdv)，脊髓灰质炎病毒，口蹄疫病毒(fmd)，肠道病毒71或丙型肝炎病毒的内部核糖体进入位点(ires)的控制之下，而不是天然亚基因组启动子。在一些实施方式中，经修饰的病毒rna复制子的第二核酸序列包括至少一种，至少两种，至少三种或至少四种非结构性病毒蛋白的编码序列。在一些实施方式中，经修饰的病毒rna复制子的第二核酸序列包括至少一种非结构病毒蛋白的一部分的编码序列。例如，经修饰的病毒rna复制子的第二核酸序列可包括至少一种非结构病毒蛋白的编码序列的约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，100％，或任何两个值之间的范围。在一些实施方式中，经修饰的病毒rna复制子的第二核酸序列可包括至少一种非结构病毒蛋白的实质部分的编码序列。如本文所用，编码非结构病毒蛋白的核酸序列的“实质部分”包含足够的编码非结构病毒蛋白的核酸序列，以通过本领域技术人员手工评估该序列或通过使用诸如blast的算法的计算机自动序列比较和识别来提供该蛋白的推定识别(参见例如“basiclocalalignmentsearchtool”；altschulsf等人，j.mol.biol.215：403-410，1993年)。在一些实施方式中，经修饰的病毒rna复制子的第二核酸序列可包括至少一种非结构蛋白的完整编码序列。在一些实施方式中，第二核酸序列包含天然病毒非结构蛋白的基本上所有编码序列。构建和表征这些新核酸分子的分子技术和方法在本申请的实施例中更全面地描述。作为非限制性实例，在实施例部分中，委内瑞拉马脑炎病毒(veev)和马动脉炎病毒(eav)已用于说明本文公开的组合物和方法。在一些实施方式中，本文公开的核酸分子是重组核酸分子。如本文所用，术语“重组”是指任何分子(例如dna，rna等)，也就是说，或者通过人工操作多核苷酸而产生的间接结果。作为非限制性实例，cdna是重组dna分子，如已通过体外聚合酶反应产生的任何核酸分子，或已连接有接头的任何核酸分子，或已整合到载体中的核酸分子，例如克隆载体或表达载体。作为非限制性实例，重组核酸分子：1)已经在体外合成或修饰，例如，使用化学或酶技术(例如，通过使用化学核酸合成，或通过使用酶进行核酸分子的复制，聚合，核酸外切消化，核酸内切酶消化，连接，逆转录，转录，碱基修饰(包括例如甲基化)或重组(包括同源和位点特异性重组)；2)包括连接的核苷酸序列，其在自然界中没有结合；3)已经使用分子克隆技术进行工程化，使得其相对于天然存在的核酸序列缺少一个或多个核苷酸；和/或4)已经使用分子克隆技术进行操作，使得其相对于天然存在的核酸序列具有一个或多个序列改变或重排。可以使用本领域技术人员已知的许多方法产生核酸分子，包括天然存在的核酸序列的变体。核酸分子的序列可以相对于天然存在的序列进行修饰，使用多种技术从该序列衍生核酸分子，所述技术包括但不限于经典诱变技术和重组dna技术，例如但不限于位点定向诱变，核酸分子的化学处理以诱导突变，核酸片段的限制酶切割，核酸片段的连接，核酸序列的选定区域的pcr扩增和/或诱变，重组克隆和化学合成，包括寡核苷酸混合物的化学合成和混合物基团的连接以“构建”核酸分子的混合物，及其组合。通过筛选蛋白质或核酸分子编码的复制子的功能和/或通过与野生型基因或其片段杂交，或通过pcr使用与靶标或野生型核酸分子或序列具有同源性的引物，可以从修饰的核酸分子的混合物中选择核酸分子同源物。在本文公开的各种实施方式中，本文公开的核酸分子可包括一个或多个下列特征。在一些实施方式中，经修饰的病毒rna复制子包括衍生自属于披膜病毒科的甲病毒属或动脉病毒科的动脉炎病毒属的病毒种的经修饰的rna复制子。合适的动脉炎病毒种包括马动脉炎病毒(eav)，猪呼吸和生殖综合征病毒(prrsv)，乳酸脱氢酶升高病毒(ldv)，猿猴出血热病毒(shfv)和摇晃负鼠病病毒(wpdv)。毒性和无毒的动脉炎病毒株都是合适的。优选的动脉炎病毒株的非限制性实例包括但不限于eav-毒性bucyrus菌株(vbs)，ldv-plagemann，ldv-c，prrsv-1型和prrsv-2型。示例性优选的eav菌株包括但是不限于eavvb53，eavatccvr-796，eavhk25，eavhk116，eavarvacmlv，eavbucyrus菌株(俄亥俄州)，改良eavbucyrus，无病毒菌株ca95，redmile(肯塔基州)，84ky-a1(肯塔基州)，wroclaw-2(波兰)，bibuna(瑞士)和vienna(澳大利亚)。prrsv毒株的非限制性优选实例包括prrsvlv4.2.1，prrsv16244b，prrsvhb-1(sh)/2002，prrsvhb-2(sh)/2002，prrsvhn1，prrsvsd01-08，prrsvsd0802，prrsvsd0803，prrsv和vr2332。shfv菌株和变体的非限制性优选实例包括shfv变体shfv-krtgla和krtglb(shfv-krtgla/b)，shfvkrtg2a/b(genbank登录号jx473847至jx473850)，shfv-lvr，shfv原型变体lvr42-0/m6941(nc_003092)；来自kibale红色疣猴的shfv-krc1和shfvkrc2(分别为hq845737和hq845738)。优选的动脉炎病毒的其它非限制性实例包括prrsv-lelystad，欧洲(1型)型菌株(m96262)；prrsvvr2332，北美(2型)型菌株(u87392)；eav-bucyrus(nc_002532)；eav-s3685(gq903794)；ldv-p，plagemann菌株(u15146)；和ldv-c，神经毒性c型菌株(l13298)。在一些实施方式中，第一核酸序列位于编码经修饰的动脉炎病毒rna复制子的部分或整个pp1ab非结构蛋白的核酸序列的上游。在一些实施方式中，第一核酸序列可操作地定位在经修饰的病毒rna复制子的5’末端下游约1至1000个核苷酸的区域内。在一些实施方式中，第一核酸序列可操作地定位在经修饰的病毒rna复制子的5’末端下游约1至25，约1至40，约10至25，10至50，约10至100，约20至50，约20至75，在约25至100，约25至100个核苷酸的区域内。在一些实施方式中，第一核酸序列可操作地定位在经修饰的病毒rna复制子的5’末端下游约1，2，5，10，15，20，25，30，40，50，75，100，125，150，200，250，300或更多个，或这些值中的任何两个之间的范围的核苷酸的区域内。在一些实施方式中，第一核酸序列可操作地定位在经修饰的病毒rna复制子的5’末端下游约1至100，约1至500，约25至800，约50至900，约50至300，约25至200，约25至100，约50至400，约100至500，约100至300，约100至200，约200至500，约200至600，约200至400，约150至700，约150至400，或约500至1000个核苷酸的区域内。不受任何特定理论的束缚，据信在一些实施方式中，病毒dlp基序的翻译增强活性可取决于病毒dlp基序与起始augi密码子之间的距离(toribio等人，2016同上)。因此，在一些实施方式中，第一核酸序列可操作地定位在经修饰的病毒rna复制子的起始密码子augi下游约10至100个核苷酸的区域。在一些实施方式中，第一核酸序列可操作地定位在经修饰的病毒rna复制子的起始密码子augi下游约10至75，约10至50，约10至25，约15至75，约15至50，约15至25，约25至75，约25至50，约25至100个核苷酸的区域内。在一些实施方式中，第一核酸序列可操作地定位在经修饰的病毒rna复制子的起始密码子augi的下游约25，28，31，34，37，37，40，43，46，49，50个或者在这些值中的任何两个之间的范围的核苷酸的区域内。在一些实施方式中，编码经修饰的病毒rna复制子的序列还包含一个或多个表达盒，其中每个表达盒包含与目的基因(goi)的编码序列可操作地连接的启动子。如本文所用，术语“表达盒”是指遗传物质的构建体，其含有编码序列和足够的调节信息，以在体内和/或离体指导受体细胞中编码序列的正确转录和/或翻译。可以将表达盒插入载体中以靶向期望的宿主细胞和/或靶向受试者。此外，术语表达盒可与术语“表达构建体”互换使用。如本文所用的术语“表达盒”是指编码与表达控制元件(例如启动子)可操作地连接的蛋白质或功能性rna的核酸构建体，并且任选地，影响基因的转录或翻译的其它核酸序列的任何或组合。如本文所用，术语“可操作地连接”表示两个或更多个序列之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸与调节序列(例如启动子)之间的可操作连接是允许表达目的多核苷酸的功能性连接。在这个意义上，术语“可操作地连接”是指调节区和待转录编码序列的定位，使得调节区对于调节目的编码序列的转录或翻译是有效的。在本文公开的一些实施方式中，术语“可操作地连接”表示这样的构型，其中调节序列相对于编码多肽或功能性rna的序列置于适当的位置，使得控制序列指导或调节编码多肽的mrna、多肽和/或功能性rna的表达或细胞定位，如果它可以介导核酸序列的转录，则启动子与核酸序列可操作地连接。可操作连接的元件可以是连续的或非连续的。用于将两个或更多个dna序列可操作地连接在一起的基本技术对于本领域普通技术人员来说是熟悉的，并且这些方法已在许多书中描述用于标准分子生物学操作(参见例如maniatis等人，“molecularcloning：alaboratorymanual”2nded.coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，ny；和gibson等人，naturemethods6：343-45，2009)。在本文公开的一些实施方式中，本文公开的核酸分子可包括一个以上的表达盒。原则上，本文公开的核酸分子通常可包括任何数量的表达盒。在一些特定实施方式中，经修饰的病毒rna复制子包含至少两个，三个，四个，五个或六个表达盒。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个可操作地定位在经修饰的动脉炎病毒rna复制子的转录调节序列(trs)的下游，其中trs可以是trs1，trs2，trs3，trs4，trs5，trs6，trs7或其组合。在一些特定实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个可操作地定位在经修饰的动脉炎病毒rna复制子的trs7的下游。本文提供的核酸分子可用作例如表达或转录载体，其在与异源核酸序列(例如目的基因的编码序列)可操作地连接时(goi)可以影响goi的表达。在一些实施方式中，goi的编码序列被优化用于在高于参考编码序列的表达水平的水平下表达。在一些实施方式中，参考编码序列不是密码子优化的。在一些实施方式中，goi编码序列包含密码子优化。关于核酸序列的密码子优化，遗传密码的简并性提供了用不同碱基替换基因的蛋白质编码序列的至少一个碱基而不引起由基因产生的多肽的氨基酸序列被改变的可能性。因此，根据遗传密码的简并性，本公开的核酸分子还可具有一个或多个核苷酸取代。描述密码子使用的参考文献易于公开获得。在本公开的一些其它实施方式中，可以出于多种原因产生多核苷酸序列变体，例如以优化特定宿主的密码子表达(例如将动脉病毒mrna中的密码子改变为其它生物如人，仓鼠，老鼠或猴子优选的密码子)。在本文公开的一些实施方式中，goi的序列编码多肽。多肽的类型可根据具体应用而变化。例如，多肽可以是治疗性多肽，预防性多肽，诊断性多肽，营养保健多肽，工业酶，报告多肽或其任何组合。在一些实施方式中，多肽是抗体，抗原，免疫调节剂，细胞因子，酶或其组合。在一些实施方式中，如本文中公开的核酸分子可以进一步包含编码第二病毒衣壳增强子(例如dlp基序)的一种或多种结构元件的第三核酸序列，其中第三核酸序列在goi的编码序列的上游可操作地连接。第二dlp基序可以与位于非结构蛋白的编码序列上游的第一dlp基序相同或不同。因此，在一些实施方式中，第二dlp基序与位于非结构蛋白的编码序列上游的第一dlp基序相同。在一些实施方式中，第二dlp基序不同于位于非结构蛋白的编码序列上游的第一dlp基序。在一些实施方式中，编码经修饰的病毒rna复制子的序列还包含蛋白水解切割位点的编码序列，其可操作地连接在第三核酸序列的下游和goi的编码序列的上游。通常，本领域已知的任何蛋白水解切割位点可以掺入本公开的核酸分子中，并且可以是例如蛋白酶在产生后切割的蛋白水解切割序列。其它合适的蛋白水解切割位点还包括蛋白水解切割序列，其可在加入外部蛋白酶后切割。在一些实施方式中，编码经修饰的病毒rna复制子的序列还包含自身蛋白酶肽的编码序列，其可操作地连接在第三核酸序列的下游和goi的编码序列的上游。在一些实施方式中，自身蛋白酶肽包括选自由以下组成的组中的肽序列：猪捷申病毒-12a(p2a)，口蹄疫病毒(fmdv)2a(f2a)，马鼻炎病毒(erav)2a(e2a)，托西埃塞病毒2a(t2a)，细胞质多角体病毒2a(bmcpv2a)，软化病病毒2a(bmifv2a)及其组合。在一些实施方式中，自身蛋白酶肽包括来自猪捷申病毒-12a(p2a)的肽序列。本领域技术人员将理解，只要与不存在衣壳增强子序列时所见的水平相比，衣壳增强子增加异源核酸序列的表达，则可以使用病毒衣壳增强子序列，非结构蛋白的编码序列，编码自身蛋白酶肽的序列和编码目的基因的序列的不同构型。通常配置这些序列，使得目标基因编码的多肽可以在被自身蛋白酶切割后从蛋白酶和任何衣壳蛋白序列中释放。在一些实施方式中，如本文中公开的核酸分子的序列包括甲病毒种的经修饰的rna复制子。在一些实施方式中，经修饰的甲病毒属rna复制子是属于veev/eeev组或sf组或sin组的甲病毒。sf组甲病毒的非限制性实例包括semlikiforest病毒，o’nyong-nyong病毒，rossriver病毒，middelburg病毒，chikungunya病毒，barmahforest病毒，getah病毒，mayaro病毒，sagiyama病毒，bebaru病毒和una病毒。sin组甲病毒的非限制性实例包括sindbis病毒，girdwoods.a.病毒，南非虫媒病毒86号，ockelbo病毒，aura病毒，babanki病毒，whataroa病毒和kyzylagach病毒。veev/eeev组甲病毒的非限制性实例包括东部马脑炎病毒(eeev)，委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，everglades病毒(evev)，mucambo病毒(mucv)，pixuna病毒(pixv)，middleburg病毒(midv)，chikungunya(chikv)，o’nyong-nyong病毒(onnv)，rossriver病毒(rrv)，barmahforest病毒(bf)，getah病毒(get)，sagiyama病毒(sagv)，bebaru病毒(bebv)，mayaro病毒(mayv)和una病毒(unav)。甲病毒种的非限制性实例包括东部马脑炎病毒(eeev)，委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，everglades病毒(evev)，mucambo病毒(mucv)，semlikiforest病毒(sfv)，pixuna病毒(pixv)，middleburg病毒(midv)，chikungunya病毒(chikv)，o’nyong-nyong病毒(onnv)，rossriver病毒(rrv)，barmahforest病毒(bf)，getah病毒(get)，sagiyama病毒(sagv)，bebaru病毒(bebv)，mayaro病毒(mayv)，una病毒(unav)，sindbis病毒(sinv)，aura病毒(aurav)，whataroa病毒(whav)，babanki病毒(babv)，kyzylagach病毒(kyzv)，西部马脑炎病毒(weev)，highlandj病毒(hjv)，fortmorgan病毒(fmv)，ndumu(nduv)和buggycreek病毒。毒性和无毒甲病毒株都是合适的。在一些实施方式中，经修饰的甲病毒rna复制子是sindbis病毒(sin)，semlikiforest病毒(sfv)，rossriver病毒(rrv)，委内瑞拉马脑炎病毒(veev)或东部马脑炎病毒(eeev)。在一些实施方式中，经修饰的甲病毒rna复制子是委内瑞拉马脑炎病毒(veev)。在本文公开的核酸分子包括甲病毒种的经修饰的rna复制子的一些情况下，第一核酸序列位于编码经修饰的甲病毒rna复制子的一种或多种非结构蛋白质nsp1-4或其部分的核酸序列的上游。因此，在一些实施方式中，第一核酸序列位于编码经修饰的甲病毒属rna复制子的非结构蛋白nsp1，nsp1-2，nsp1-3，nsp1-4，nsp2-4，nsp3-4，nsp2-3，nsp2，nsp3，nsp4或其部分的核酸序列的上游。在一些实施方式中，编码经修饰的甲病毒属rna复制子的序列还包括一个或多个表达盒，其中每个表达盒包括与目的基因(goi)的编码序列可操作地连接的启动子。在一些实施方式中，修饰的甲病毒rna复制子包含至少两个，三个，四个，五个或六个表达盒。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个可操作地连接在编码经修饰的甲病毒rna复制子的一种或多种非结构蛋白nsp1-4或其部分的核酸序列的下游。因此，在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个可操作地连接在编码经修饰的甲病毒rna复制子的非结构蛋白nsp1，nsp1-2，nsp1-3，nsp1-4，nsp2-4，nsp3-4，nsp2-3，nsp2，nsp3，nsp4或其部分的核酸序列的下游。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个还包含编码第二病毒衣壳增强子(例如dlp基序)的一种或多种结构元件的第三核酸序列，其中第三核酸序列在goi的编码序列的上游可操作地连接。第二dlp基序可以与位于编码序列上游的第一dlp基序相同或可以不同于至少非结构蛋白nspl-4或其部分。因此，在一些实施方式中，第二dlp基序与位于非结构蛋白的编码序列上游的第一dlp基序相同。在一些实施方式中，第二dlp基序与位于非结构蛋白的编码序列上游的第一dlp基序不同。娙伀实施方式中，本公开的核酸序列还包含自身蛋白酶肽的编码序列，其可操作地连接在第三核酸序列的下游和goi的编码序列的上游。自身蛋白酶肽通常可以是本领域已知的任何自身蛋白酶肽。蛋白酶肽的非限制性实例包括来自猪捷申病毒-12a(p2a)，口蹄疫病毒(fmdv)2a(f2a)，马鼻炎病毒(erav)2a(e2a)，托西埃塞病毒2a(t2a)，细胞质多角体病毒2a(bmcpv2a)，软化病病毒2a(bmifv2a)的肽序列及其任何组合。在另一方面，本文公开的一些实施方式涉及核酸分子，其包含编码经修饰的非甲病毒rna复制子的核酸序列，其中经修饰的非甲病毒rna复制子包含编码病毒衣壳增强子(例如dlp基序)的第一核酸序列。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒rna复制子还包含编码至少一种非结构病毒蛋白或其部分的第二核酸序列，其中第一核酸序列在第二核酸序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒属rna复制子还包含自身蛋白酶肽的编码序列，其可操作地连接在第一核酸序列的下游和第二核酸序列的上游。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒rna复制子包括正链rna病毒的经修饰的rna复制子。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒rna复制子包括负链rna病毒的经修饰的rna复制子。经修饰的非甲病毒rna复制子的非限制性实例包括属于披膜病毒科，黄病毒科，正粘病毒科，弹状病毒科或副粘病毒科的病毒种的经修饰rna复制子。因此，在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒rna复制子包括负链rna病毒的经修饰的rna复制子。合适的负链rna病毒种包括但不限于正粘病毒科，弹状病毒科和副粘病毒科的病毒种。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒rna复制子包括属于披膜病毒科或黄病毒科的正链病毒种的经修饰的rna复制子。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒rna复制子包括属于动脉炎病毒科的动脉炎病毒属的正链病毒种的经修饰的rna复制子。合适的动脉炎病毒种包括但不限于马动脉炎病毒(eav)，猪呼吸和生殖综合征病毒(prrsv)，乳酸脱氢酶升高病毒(ldv)，猿猴出血热病毒(shfv)和摇晃负鼠病病毒(wpdv)。在一些实施方式中，编码非甲病毒修饰的rna复制子的序列还包括一个或多个表达盒，其中每个表达盒包含与目的基因(goi)的编码序列可操作地连接的启动子。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒rna复制子包含至少两个，三个，四个，五个或六个表达盒。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个可操作地连接在编码至少一种非结构病毒蛋白或其部分的第二核酸序列的下游。在一些实施方式中，一个或多个表达盒中的至少一个还包含编码病毒衣壳增强子的一种或多种结构元件的第三核酸序列，其中第三核酸序列在goi的编码序列的上游可操作地连接。在一些实施方式中，经修饰的非甲病毒属rna复制子还包括自身蛋白酶肽的编码序列，其可操作地连接在第三核酸序列的下游和goi的编码序列的上游。本公开的一些实施方式涉及核酸分子，其包括编码经修饰的病毒rna复制子的核酸序列，其在5’→3’方向上包含编码来自sindbis病毒的衣壳增强子的第一核酸序列、编码自身蛋白酶肽的第二核酸序列和编码所有病毒非结构蛋白的第三核酸序列。本公开的一些实施方式涉及核酸分子，其包括编码经修饰的病毒rna复制子的核酸序列，其中经修饰的病毒rna复制子包含病毒衣壳增强子，并且其中经修饰的病毒rna复制子的序列与seqidno：15-18和27-29中至少一个的序列表现出至少80％序列同一性。在本公开范围内考虑的是本文提供的多核苷酸的变体。此类变体可以是天然存在的，包括来自相同或不同物种的同源多核苷酸，或可以是非天然变体，例如使用化学合成方法合成或使用重组dna技术产生的多核苷酸。关于核酸序列，遗传密码的简并性提供了用不同的碱基替换基因的蛋白质编码序列的至少一个碱基而不会导致由该基因产生的多肽的氨基酸序列被改变的可能性。因此，本公开的核酸分子还可以具有通过根据遗传密码的简并性进行取代而已从本文公开的任何多核苷酸序列改变的任何碱基序列。描述密码子使用的参考文献易于公开获得。在进一步的实施方式中，可以出于多种原因产生多核苷酸序列变体，例如以优化特定宿主的密码子表达(例如将病毒mrna中的密码子改变为其它生物如哺乳动物或鱼类优选的密码子)。在一些实施方式中，本公开的核酸分子在5’→3’方向上包含编码来自sindbis病毒的衣壳增强子的核酸序列，编码自身蛋白酶肽的核酸序列和编码经修饰的病毒rna复制子的所有病毒非结构蛋白的核酸序列。在一些实施方式中，核酸分子在5’→3’方向上包含5-utr序列，来自sindbis病毒的第一衣壳增强子，自身蛋白酶肽，编码经修饰的病毒rna复制子的所有病毒非结构蛋白的序列，一个或多个表达盒和3’utr序列，其中一个或多个表达盒中的至少一个包含来自sindbis病毒的第二衣壳增强子，其可操作地连接在目的基因(goi)的编码序列的上游。因此，在一些实施方式中，本公开的核酸分子包括编码经修饰的病毒rna复制子的核酸序列，其中该序列与seqidno：15-18和27-29中至少一个的序列表现出至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在一些实施方式中，本公开的核酸分子是表达载体。在一些实施方式中，表达载体还包含一种或多种另外的调节序列，其可以是转录调节元件或翻译调节元件。如在本公开中可互换使用的术语“调节元件”和“调节区域”是指影响转录或翻译起始和速率，以及转录或翻译产物的稳定性和/或移动性的核酸序列。这些调节元件不必是天然存在的序列。调节序列包括但不限于启动子序列，增强子序列，反应元件，蛋白质识别位点，诱导型元件，蛋白质结合序列，5’和3’非翻译区(utr)，转录起始位点，终止序列，多腺苷酸化序列，内含子及其组合。在一些实施方式中，本公开的表达载体还包括以下一种或多种：复制起点，用于促进表达盒整合到宿主基因组中的一种或多种序列，终止子序列。在一些实施方式中，表达载体包含至少一个用于在细胞中复制的复制起点(“ori”)序列。载体可以进一步任选地包含在一种或多种真核启动子控制下的一种或多种选择标记，在一种或多种原核启动子控制下的一种或多种选择标记，和/或介导外源核酸重组序列进入靶细胞的基因组的一种或多种序列。ori是dna分子中复制开始的序列。ori作为复制前复合体的组装基础。根据ori，这种复制可以单向或双向进行。本文提供的表达载体可包括用于在克隆宿主(例如大肠杆菌或酵母)中复制表达载体的ori，和/或可包括用于在靶细胞中复制表达载体的ori，其可以是例如哺乳动物细胞。ori的结构生物学在原核生物、真核生物和病毒中广泛保守。大多数ori具有简单的三核苷酸、四核苷酸或更高核苷酸重复模式。大多数是富含at并含有反向重复序列。本领域技术人员熟悉更常见的ori，例如p15a和puc的ori。在一些实施方式中，表达载体还可携带选择标记。举例来说，包含表达盒的载体可以包括作为选择标记的赋予对有毒物质(例如抗生素，除草剂或一些其它毒素)抗性的基因，从而可以通过暴露细胞于毒药并选择那些幸存的细胞来选择转化体。在一些实施方式中，选择标记可以在启动子的控制下。在一些实施方式中，调节选择标记的表达的启动子可以是条件性的或诱导型的。在一些实施方式中，调节选择标记的表达的启动子可以优选是组成型的，并且可以是例如本文描述的任何启动子或另一种启动子。在一些实施方式中，表达载体是质粒，噬菌体载体，粘粒，黏粒，病毒复制子，穿梭载体或其组合。在一些实施方式中，表达载体是rna复制子。在一些实施方式中，表达载体是原核表达载体。在一些实施方式中，表达载体是真核表达载体。在一些实施方式中，本公开的核酸分子通过从头合成产生。在本公开的一些实施方式中，从头合成可用于产生合成mrna分子。重组细胞在一个方面，本文公开的一些实施方式涉及转化细胞的方法，其包括向宿主细胞(例如动物细胞)中引入本文提供的核酸分子，以及选择或筛选转化细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应理解，这些术语不仅指特定的受试细胞，还指这种细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这些后代事实上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用术语的范围内。在一些实施方式中，通过电穿孔程序或生物射弹程序将核酸分子引入宿主细胞中。在相关方面，一些实施方式涉及重组宿主细胞，例如包含本文所述核酸分子的重组动物细胞。核酸分子可以稳定地整合在宿主基因组中，或者可以游离复制，或作为用于稳定或瞬时表达的微环表达载体存在于重组宿主细胞中。因此，在本文公开的一些实施方式中，核酸分子作为附加型单元在重组宿主细胞中维持和复制。在一些实施方式中，核酸分子稳定整合到重组细胞的基因组中。可以使用经典的随机基因组重组技术或更精确的基因组编辑技术完成稳定的整合，例如使用指导rna定向的crispr/cas9，或dna引导的核酸内切酶基因组编辑ngago(natronobacteriumgregoryiargonaute)，或talen基因组编辑(转录激活剂-像效应核酸酶)。在一些实施方式中，核酸分子作为用于稳定或瞬时表达的微环表达载体存在于重组宿主细胞中。在一些实施方式中，宿主细胞可以用例如本申请的载体构建体进行基因工程化(例如转导或转化或转染)，所述载体构建体可以是例如用于同源重组的载体，其包括与宿主细胞的一部分基因组同源的核酸序列，或者可以是用于表达任何目的基因或其组合的表达载体。载体可以是例如质粒，病毒颗粒，噬菌体等形式。在一些实施方式中，用于表达目的多肽的载体也可以设计用于整合到宿主中，例如通过同源重组。含有如本文所述的多核苷酸序列的载体，例如包含经修饰的甲病毒属基因组或复制子rna的核酸分子，以及任选的选择标记或报告基因，可用于转化合适的宿主细胞。本文公开的方法和组合物可用于任何物种的基因工程，包括但不限于原核和真核物种。使用根据本公开的组合物和方法修饰的合适宿主细胞可包括但不限于藻类细胞，细菌细胞，异源，真菌细胞，壶菌细胞，微生物，微藻和动物细胞。在一些实施方式中，动物细胞是无脊椎动物细胞。在一些实施方式中，脊椎动物细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是未转化的细胞或已经用至少一种核酸分子转染的细胞。本文公开的方法和组合物可用于例如对于水产养殖，农业，畜牧业和/或用于治疗和医学应用重要或有意义的受试者和/或宿主细胞，包括在疫苗，药品，工业产品和化学品等的制造中使用的多肽的产生。在一些实施方式中，本文公开的组合物和方法可以与来自作为甲病毒天然宿主的物种的宿主细胞一起使用，例如啮齿动物，小鼠，鱼，鸟和较大的哺乳动物，例如人，马，猪，猴和猿以及无脊椎动物。在本申请的一些实施方式中，特别优选的物种是脊椎动物物种和无脊椎动物物种。原则上，通常可以使用任何动物物种，例如人，狗，鸟，鱼，马，猪，灵长类动物，小鼠，棉鼠，雪貂，牛，猪，羊，兔，猫，山羊，驴，仓鼠或水牛。合适的鸟类的非限制性实例包括鸡，鸭，鹅，火鸡，鸵鸟，鸸鹋，天鹅，孔雀，野鸡，鹧鸪和珍珠鸡。在一些特定的实施方式中，鱼是鲑科家族中的任何物种。原代哺乳动物细胞和连续/永生化细胞类型也是合适的。合适的动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于肺马动脉内皮细胞，马真皮细胞，幼仓鼠肾(bhk)细胞，兔肾细胞，小鼠肌细胞，小鼠结缔组织细胞，人子宫颈细胞，人类表皮样喉细胞，中国仓鼠卵巢细胞(cho)，人hek-293细胞，小鼠3t3细胞，vero细胞，madin-darby犬肾上皮细胞(mdck)，原代鸡成纤维细胞，hut78细胞，a549肺细胞，hela细胞，per.细胞，wi-38细胞，mrc-5细胞，frhl-2和cemt细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是幼仓鼠肾细胞。在一些实施方式中，幼仓鼠肾细胞是bhk-21细胞。用于转化多种上述宿主细胞和物种的技术是本领域已知的并且在技术和科学文献中有描述。因此，包括至少一种本文公开的重组细胞的细胞培养物也在本申请的范围内。适用于产生和维持细胞培养的方法和系统是本领域已知的。异源核酸序列根据本公开的一些实施方式，多种核酸序列可以由本公开的核酸分子携带。在一些实施方式中，如本文所述的核酸分子不含任何另外的异源核酸序列。在一些实施方式中，本公开的核酸分子含有一种或多种另外的异源或外源核酸序列。在一些实施方式中，一种或多种另外的异源或外源核酸序列包括目的基因(goi)的编码序列。在本文公开的一些实施方式中，goi的编码序列编码多肽或功能性rna。在一些实施方式中，goi的编码序列编码选自核糖体rna，trna，核酶，crispr系统的反式激活(tr)rna，crispr系统的crispr(cr)rna，crispr系统的嵌合体指导rna，微rna，干扰rna(rnai)分子，短发夹(sh)rna或反义rna分子的功能性rna。在一些实施方式中，goi的编码序列编码选自由治疗性多肽，预防性多肽，诊断性多肽，营养保健多肽，工业酶，报告多肽组成的组中的多肽或其任何组合。在一些实施方式中，goi编码多肽的编码序列选自由抗体，抗原，免疫调节剂和细胞因子组成的组。在一些实施方式中，异源核酸序列包含至少约100个碱基，2kb，3.5kb，5kb，7kb或8kb的异源核酸序列。异源rna或异源核酸序列可选自衍生自病毒，原核生物或真核生物的多种序列。异源序列的类别的实例包括但不限于免疫原(包括天然的，修饰的或合成的抗原蛋白，肽，表位或免疫原性片段)，细胞因子，毒素，治疗性蛋白，酶，反义序列和免疫应答调节剂。多种goi可以包括在本公开的核酸分子中以表达goi的多肽，包括但不限于细胞因子，毒素，前药，刺激免疫应答的抗原，核酶，和帮助或抑制免疫应答的蛋白质，以及反义序列(或“反义应用”的有义序列)。如上所述，在本公开的各种实施方式中，本文提供的经修饰的rna复制子可含有两个或更多个目的多肽的编码区(并且在一些实施方式中表达)。1)细胞因子在本文公开的一些实施方式中，goi编码细胞因子。通常，细胞因子起到增殖，激活和/或分化免疫效应细胞的作用。细胞因子的实例包括但不限于巨噬细胞，b淋巴细胞，t淋巴细胞，内皮细胞，成纤维细胞，淋巴因子如γ干扰素，肿瘤坏死因子，白细胞介素，il-1，il-2，il-3，il-4，il-5，il-6，il-7，il-8，il-9，il-10，il-1，il-12，il-13，il-14，il-15，gm-csf，csf-1和g-csf。在一些相关的实施方式中，goi编码免疫调节辅因子。如在本公开的上下文中所使用的，“免疫调节辅因子”是指当该因子由参与免疫应答的一种或多种细胞制备时或当外源添加至细胞时导致免疫反应的质量或效力与辅助因子不存在时的免疫反应不同。响应的质量或效力可以通过本领域技术人员已知的各种测定来测量，包括例如测量细胞增殖的体外测定(例如，3h胸苷摄取)和体外细胞毒性测定(例如其测量51cr释放量(参见warner等人，aidsres.和humanretroviruses7：645-655，1991)。免疫调节辅因子的实例包括但不限于α干扰素，γ干扰素，g-csf，gm-csf，tnf，白细胞介素-2(il-2)，il-4，il-6，il-12，il-15，icam-1，icam-2，lfa-1，lfa-3，mhci类分子，mhcii类分子，2-微球蛋白，伴侣蛋白，cd3，b7/bb1，mhc连接的转运蛋白及其类似物。选择哪种免疫调节辅因子以包括在本公开的核酸分子内可以基于辅因子的已知治疗效果，或通过实验确定。例如，在慢性乙型肝炎感染中，已发现α干扰素在补偿患者的免疫缺陷方面是有效的，从而有助于从疾病中恢复。在某些情况下，可以通过实验确定合适的免疫调节辅助因子。简言之，首先从患有肝病的患者中采集血样。用自身或hla匹配的细胞(例如ebv转化的细胞)体外再刺激外周血淋巴细胞(pbl)，并用本公开的经修饰的动脉炎病毒基因组或复制子rna转导，其指导肝炎抗原的免疫原性部分和免疫调节辅助因子的表达。刺激的pbl用作ctl测定中的效应子，其中bla匹配的转导细胞作为靶标。与使用hla匹配的刺激物和仅用编码抗原的载体转导的靶细胞进行的相同测定中观察到的ctl应答的增加表明有用的免疫调节辅因子。在一些实施方式中，免疫调节辅因子γ干扰素是特别优选的。免疫调节辅因子的另一个非限制性实例是b7/bb1共刺激因子。激活t细胞的全功能活性需要两个信号。通过抗原特异性t细胞受体与结合主要组织相容性复合物(mhc)分子的肽的相互作用提供一个信号，并且第二信号(称为共刺激)通过抗原呈递细胞递送至t细胞。第二信号是t细胞产生白细胞介素-2(il-2)所需的，并且似乎涉及抗原呈递细胞上的b7/bb1分子与t淋巴细胞上的cd28和ctla-4受体的相互作用。在一些实施方式中，可以将b7/bb1引入肿瘤细胞中以引起cd8+t细胞的共刺激，使得cd8+t细胞产生足够的il-2以扩增并变得完全活化。这些cd8+t细胞可以杀死不表达b7的肿瘤细胞，因为进一步的ctl功能不再需要共刺激。表达共刺激性b7/bb1因子和例如免疫原性hbv核心蛋白的载体可以利用本文所述的方法构建。用这些载体转导的细胞将成为更有效的抗原呈递细胞。hbv核心特异性ctl应答将通过共刺激配体b7/bb1从完全激活的cd8+t细胞增强。2)毒素在本文公开的一些实施方式中，goi编码毒素。在一些实施方式中，毒素起直接抑制细胞生长的作用。毒素的实例包括但不限于蓖麻毒素，相思豆毒素，白喉毒素，霍乱毒素，白树毒素，美洲商陆，抗病毒蛋白，麦芽凝集素，志贺氏菌毒素，假单胞菌外毒素a，单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsvtk)和大肠杆菌鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。3)前药在本文公开的一些实施方式中，goi编码“前药”。如在本公开的上下文中所使用的，“前药”是指基因产物，其将具有很少或没有细胞毒性的化合物活化成有毒产物。此类基因产物的代表性实例包括hsvtk和vzvtk(及其类似物和衍生物)，其选择性地使某些嘌呤阿拉伯糖苷和取代的嘧啶化合物单磷酸化，将它们转化为细胞毒性或细胞抑制性代谢物。更具体地，将药物更昔洛韦，阿昔洛韦或它们的任何类似物(例如fiau，fiac和dhpg)暴露于hsvtk使药物磷酸化成其相应的活性核苷酸三磷酸形式。可以在本公开的上下文中使用的前药的非限制性实例包括：大肠杆菌鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶，其将硫代黄嘌呤转化为有毒的硫代黄嘌呤单磷酸酯；碱性磷酸酶，其可将无活性的磷酸化化合物如磷酸丝裂霉素和磷酸多柔比星转化为有毒的去磷酸化合物；真菌(例如尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum))和细菌胞嘧啶脱氨酶，其可将5-氟胞嘧啶转化为有毒化合物5-氟尿嘧啶；羧肽酶g2，其会从对-n-双(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸中裂解谷氨酸，从而产生有毒的苯甲酸芥子气；和青霉素-v酰胺酶，其将阿霉素和美法仑的苯氧基辛酯衍生物转化为有毒化合物。4)反义序列在本文公开的一些实施方式中，goi的编码序列是反义序列。设计反义序列以结合rna转录物，从而阻止特定蛋白质的细胞合成或阻止细胞使用该rna序列。此类序列的非限制性实例包括反义胸苷激酶，反义二氢叶酸还原酶，反义her2，反义abl，反义myc，反义ras，以及阻断核苷酸生物合成途径中的任何酶的反义序列。另外，根据本文公开的一些实施方式，可以使用干扰素和2微球蛋白的反义序列以降低免疫应答。在一些实施方式中，反义rna可以用作抗肿瘤剂以诱导有效的i类限制性应答。除了结合rna从而阻止特定mrna的翻译之外，高水平的特异性反义序列被认为由于形成大量双链rna而诱导干扰素(包括γ-干扰素)的表达增加。反过来，γ干扰素的表达增加促进了mhci类抗原的表达。用于这方面的优选反义序列包括肌动蛋白rna，肌球蛋白rna和组蛋白rna。与肌动蛋白rna形成错配的反义rna是特别优选的。5)核酶在本文公开的一些实施方式中，提供了包含一个或多个rna茎环结构的核酸分子，其在宿主细胞感染后产生核酶。核酶用于切割特定的rna，并且设计为仅影响一种特定的rna序列。通常，核酶的底物结合序列长10至20个核苷酸。该序列的长度足以允许与靶rna杂交并使核酶与切割的rna解离。产生核酶的代表性实例包括美国专利号5,116,742；5,225,337和5,246,921中所述的那些。6)蛋白质和其它细胞成分在本文公开的一些实施方式中，多种蛋白质或其它细胞成分可以由本公开的核酸分子携带。此类蛋白质的非限制性实例包括天然或改变的细胞组分，以及在例如病毒，细菌，寄生虫，真菌或动物如哺乳动物中发现的外来蛋白质或细胞成分。制备多肽的方法本公开的宿主细胞，例如原核或真核宿主细胞，可用于产生(例如表达)目的分子，例如多肽，其在如本文所公开的目的基因(goi)的开放阅读框架中编码。因此，本申请进一步提供了使用本公开的宿主细胞和/或核酸分子产生目的分子(例如多肽)的方法。宿主细胞可以是例如分离的细胞，细胞培养物中的细胞，活体中的细胞或其组合。本文公开的一些实施方式提供了用于产生目的多肽的方法。该方法可包括将根据本公开的任一方面和实施方式的核酸分子引入宿主细胞，从而产生由宿主细胞中的goi编码的多肽。在一些实施方式中，其中引入的核酸分子是rna分子，例如mrna分子或rna复制子。rna分子可以通过本领域已知的任何方法产生，例如通过全部或部分的从头合成。例如rna分子包括但不限于mrna分子和rna复制子可以使用化学方法、酶技术或其任何组合产生，例如通过从头组装的化学合成(例如用寡核苷酸)或体外转录反应(使用适当的酶，缓冲液，核苷酸等)。在引入的核酸分子是mrna的一些情况下，mrna可以在体内直接递送至细胞以在细胞中产生目的多肽(例如药物，抗原等)。细胞可以是分离的细胞；细胞培养中的细胞；组织，器官和/或受试者中的细胞；或其任何组合。在一些实施方式中，在细胞中没有制备新的mrna拷贝。如本文所公开的，将来自病毒衣壳增强子(例如dlp基序)的一个或多个rna茎环掺入化学合成的rna中可以赋予预期的增强作用。一旦将含有dlp的mrna导入细胞中，就进行基因表达。在其中引入的核酸分子是载体(例如rna复制子)的一些实施方式中，可以产生新的mrna拷贝，其包括与一个或多个dlp基序可操作地连接的目的基因的编码序列。一旦将含有dlp的载体或复制子引入细胞中，将一个或多个dlp基序掺入载体(例如rna复制子)中就可以赋予预期的基因表达增强作用。本文公开的一些实施方式提供了在宿主细胞中产生目的多肽的方法。这种方法包括培养重组宿主细胞，包括根据本公开的任何一个方面和实施方式的核酸分子。在一些实施方式中，该方法包括在合适的培养基中培养本公开的宿主细胞(其中已导入编码目的分子的重组表达载体)，从而产生目的分子。在一些实施方式中，该方法还包括从培养基或宿主细胞中分离目的分子。还公开了用于在受试者中产生目的多肽的方法，包括向受试者施用根据任一方面和实施方式的核酸分子。用于本文公开的方法和组合物的合适宿主细胞和/或受试者包括但不限于原核和真核物种。使用根据本公开的组合物和方法修饰的合适宿主细胞可包括但不限于藻类细胞，细菌细胞，异源，真菌细胞，壶菌细胞，微生物，微藻和动物细胞。在一些实施方式中，动物细胞是无脊椎动物细胞。在一些实施方式中，脊椎动物细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是未转化的细胞或已经用至少一种核酸分子转染的细胞。因此，根据任何一个方面和实施方式的重组细胞的生物样品，生物质和后代也在本申请的范围内。因此，如下文更详细讨论的，通过根据本申请的该方面的方法产生的多肽也在本申请的范围内。在一些实施方式中，重组细胞是动物细胞。小规模和大规模的治疗性蛋白质生产是制药工业中的重要发展领域，因为动物细胞中产生的蛋白质通常被认为通常具有适当的加工，翻译后修饰，因此具有足够的活性来治疗生理状况。原则上，通常可以使用任何动物物种，例如人，狗，鸟，鱼，马，猪，灵长类动物，小鼠，棉鼠，雪貂，牛，猪，羊，兔，猫，山羊，驴，仓鼠或水牛。合适的鸟类的非限制性实例包括鸡，鸭，鹅，火鸡，鸵鸟，鸸鹋，天鹅，孔雀，野鸡，鹧鸪和珍珠鸡。在一些特定的实施方式中，鱼是鲑科中的任何物种。原代哺乳动物细胞和连续/永生化细胞类型也是合适的。合适的动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于肺马动脉内皮细胞，马真皮细胞，幼仓鼠肾(bhk)细胞，兔肾细胞，小鼠肌细胞，小鼠结缔组织细胞，人子宫颈细胞，人类表皮样喉细胞，中国仓鼠卵巢细胞(cho)，人hek-293细胞，小鼠3t3细胞，vero细胞，madin-darby犬肾上皮细胞(mdck)，原代鸡成纤维细胞，hut78细胞，a549肺细胞，hela细胞，per.细胞，wi-38细胞，mrc-5细胞，frhl-2和cemt细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是幼仓鼠肾细胞。在一些实施方式中，幼仓鼠肾细胞是bhk-21细胞。重组多肽本文公开的一些实施方式涉及通过根据本文描述的一个或多个实施方式的方法产生的重组多肽。本申请的重组多肽通常可以是任何重组多肽，并且可以是，例如，治疗性多肽，预防性多肽，诊断性多肽，营养保健多肽，工业酶和报告多肽中的一种或多种。在一些实施方式中，重组多肽可以是抗体，抗原，免疫调节剂和细胞因子中的一种或多种。在一些实施方式中，目标多肽可具有治疗或预防活性。组合物和制剂本文公开的一些实施方式涉及包含本文所述的任何重组多肽的组合物。该组合物可以是例如包含药学上可接受的载体的营养药物组合物，预防性组合物，药物组合物，或其混合物。在一些实施方式中，本申请的组合物可用作疫苗。本文公开的一些实施方式涉及包含本文所述的任何核酸分子(例如表达载体)的组合物。该组合物可以是例如包含药学上可接受的载体的营养药物组合物，预防性组合物，药物组合物，或其混合物。在一些实施方式中，本申请的组合物可用作疫苗。本文公开的一些实施方式涉及包含本文所述的任何重组细胞的组合物。该组合物可以是例如包含药学上可接受的载体的营养药物组合物，预防性组合物，药物组合物，或其混合物。在一些实施方式中，本申请的组合物可用作疫苗。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指可用于制备药物组合物或制剂的载体，其通常是安全的，无毒的，既不是生物学上也不是其它方面不合需要的，并且包括载体，可用于兽医用途以及人用药物。在一些实施方式中，药学上可接受的载体与水一样简单，但它也可包括例如生理盐浓度的溶液。在一些实施方式中，药学上可接受的载体可以是或可包括稳定剂，稀释剂和缓冲剂。合适的稳定剂是例如spga，碳水化合物(例如干乳，血清白蛋白或酪蛋白)或其降解产物。合适的缓冲剂是例如碱金属磷酸盐。稀释剂包括水，含水缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)。对于施用于动物或人，根据本申请的组合物可以通过任何肠内或肠胃外途径给予，其尤其包括鼻内，喷雾，皮内，皮下，口服，气溶胶，肌肉内或其任何组合。在一些实施方式中，本公开的核酸分子(例如mrna和/或表达载体)，蛋白质分子和/或组合物是合适的制剂，例如药物制剂。本文提供了包含在药学上可接受的载体中的一种或多种本文公开的分子和/或组合物的药物制剂。本公开的一些实施方式涉及包含一种或多种本文公开的表达载体的药物制剂。本公开的一些实施方式涉及含有一种或多种本文公开的核酸分子的药物制剂。本公开的一些实施方式涉及含有一种或多种本文公开的多肽的药物制剂。本公开的一些实施方式涉及含有一种或多种本文公开的重组细胞的药物制剂。本文公开的分子(例如蛋白质和核酸分子)和组合物可以是各种制剂，例如药物制剂。例如，本公开的核酸分子(例如复制子，mrna和表达载体)，蛋白质分子和/或组合物可以与一种或多种共价化合物一起配制成例如药物制剂(例如通过直接连接)，非共价化合物(例如通过来自lnp或阳离子纳米乳剂的基于电荷的缔合)，物理组合物(例如穹窿蛋白，非带电脂质包封)，药学上可接受的缓冲剂(例如盐水，乳酸林格氏)，及其任何组合。适用于产生前述药物制剂的许多方法、试剂和系统是本领域已知的。在一些实施方式中，本文公开的分子和/或组合物配制在盐水或脂质制剂中。脂质制剂可以选自但不限于脂质体，脂质复合物，诸如plga的共聚物和脂质纳米颗粒。颗粒和纳米颗粒在一些实施方式中，本文公开的核酸分子、多肽分子和/或组合物中的一种或多种可以掺入颗粒或纳米颗粒中。包含一种或多种本文公开的分子和组合物的颗粒可以是聚合物颗粒，脂质颗粒，固体脂质颗粒，自组装颗粒，共轭磷脂的复合纳米颗粒，表面活性剂，蛋白质，聚氨基酸，无机颗粒或其组合(例如脂质稳定的聚合物颗粒)。在一些实施方式中，本文公开的分子和/或组合物基本上包封或部分包封在颗粒中。在一些实施方式中，本文公开的分子和/或组合物沉积和/或吸收在颗粒的表面上。在一些实施方式中，将本文公开的分子和/或组合物掺入颗粒中。在一些实施方式中，本文公开的分子和/或组合物是颗粒的一部分或组分。在一些实施方式中，本发明的分子和/或组合物可以通过共价键或非共价相互作用附着于颗粒表面。在一些实施方式中，本公开的分子和/或组合物自组装成颗粒。如本文所用，术语“包封”意指包封、包围或包裹。当涉及本公开的分子和/或组合物的制剂时，包封可以是基本上的、完全的或部分的。术语“基本上包封”是指本发明的至少大于50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，99.9％，99.99％或99.999％的分子和/或组合物可以包封，包围或包裹在颗粒内。“部分包封”是指本公开的小于10％，15％，20％，30％，40％，50％的分子和/或组合物可以包封，包围或包裹在颗粒内。例如，本公开的至少1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，99.9％，99.99％或99.999％的分子和/或组合物包封在颗粒中。包封可以通过任何已知方法确定。在一些实施方式中，颗粒是聚合物颗粒或含有聚合物基质。颗粒通常可含有本领域已知的任何聚合物。颗粒通常含有一种或多种生物相容性聚合物。聚合物可以是可生物降解的聚合物。聚合物可以是疏水聚合物，亲水聚合物或两亲聚合物。在一些实施方式中，颗粒含有一种或多种聚合物，其具有与其连接的另外的靶向部分。在一些实施方式中，颗粒是无机颗粒，例如但不限于金纳米颗粒和氧化铁纳米颗粒。可以针对预期应用调节颗粒的尺寸。颗粒可以是纳米颗粒或微颗粒。颗粒的直径可为约10nm至约10微米，约10nm至约1微米，约10nm至约500nm，约20nm至约500nm，或约25nm至约250nm。在一些实施方式中，颗粒是直径为约25nm至约250nm的纳米颗粒。在一些实施方式中，颗粒是直径为约50nm至约150nm的纳米颗粒。在一些实施方式中，颗粒是直径为约70nm至约130nm的纳米颗粒。在一些实施方式中，颗粒是直径为约100nm的纳米颗粒。本领域技术人员应理解，多个颗粒具有一定范围的尺寸，并且直径应理解为颗粒尺寸分布的中值直径。在一些实施方式中，本文公开的分子和/或组合物可以掺入对温度、ph和离子条件有响应的颗粒中。例如，颗粒可包含共价交联的均聚可离子化单体的可电离网络，其中可电离网络共价连接到两亲共聚物的单个末端区域以形成多个“悬挂链”，并且其中“悬挂链”两亲性共聚物在水溶液中形成固定的网内聚集体，如美国专利号7,204,997中所公开的。脂质体，脂质复合物和脂质纳米粒子(lnp)可以使用一种或多种脂质体，脂质复合物和/或脂质纳米颗粒来配制本公开的分子和/或组合物。在一个实施方式中，本公开的分子和/或组合物的药物制剂包括脂质体。脂质体是人工制备的囊泡，其可以主要由脂质双层组成，并且可以用作施用营养物和药物制剂的递送载体。脂质体可以具有不同的尺寸，例如但不限于多层囊泡(mlv)，其可以是数百纳米直径并且可以包含由窄水性隔室分隔的一系列同心双层，直径可小于50nm的小的单细胞囊泡(suv)和直径可在50和500nm之间的大单层囊泡(luv)。脂质体设计可以包括但不限于调理素或配体，以改善脂质体与不健康组织的附着或激活事件，例如但不限于内吞作用。脂质体可含有低ph或高ph，以改善药物制剂的递送。脂质体的形成可取决于物理化学特征，例如但不限于包埋的药物制剂和脂质体成分，其中分散有脂质囊泡的介质的性质，包埋物质的有效浓度及其潜在毒性，在应用和/或递送囊泡期间涉及的任何其它过程，囊泡的优化大小，多分散性和保质期，以及安全有效的脂质体产品的批次间重复性和大规模生产可能性。在一些实施方式中，本公开的分子和/或组合物可以配制在脂质囊泡中，所述脂质囊泡可以在官能化脂质双层之间具有交联。在一些实施方式中，本公开的分子和/或组合物可以配制在脂质-聚阳离子复合物中。脂质-聚阳离子复合物的形成可以通过本领域已知的方法完成。作为非限制性实例，聚阳离子可包括阳离子肽或多肽，例如但不限于聚赖氨酸，聚鸟氨酸和/或聚精氨酸和阳离子肽。在一些实施方式中，本文公开的核酸分子和/或组合物可以配制在脂质-聚阳离子复合物中，其可以进一步包括中性脂质，例如但不限于胆固醇或二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)。脂质体制剂可受影响于但不限于阳离子脂质组分的选择，阳离子脂质饱和度，peg化的性质，所有组分的比例和生物物理参数如大小。在一些实施方式中，可以增加或减少脂质纳米颗粒(lnp)制剂中peg的比例和/或可以将peg脂质的碳链长度从c14修饰至c18以改变lnp制剂的药代动力学和/或生物分布。作为非限制性实例，与阳离子脂质、dspc和胆固醇相比，lnp制剂可含有1-5％的peg-c-domg的脂质摩尔比。在另一个实施方式中，peg-c-domg可以用peg脂质代替，例如但不限于peg-dsg(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)或peg-dpg(1，2-二棕榈酰-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)。阳离子脂质可选自本领域已知的任何脂质，例如但不限于dlin-mc3-dma，dlin-dma，c12-200和dlin-kc2-dma。在一些实施方式中，本文所述的lnp制剂可包含聚阳离子组合物。在一些实施方式中，包含聚阳离子组合物的lnp制剂可用于体内和/或体外递送本文所述的经修饰的rna。在一些实施方式中，本文所述的lnp制剂可另外包含通透性增强子分子。纳米颗粒制剂可以是包含碳水化合物载体和经修饰的核酸分子(例如mrna)的碳水化合物纳米颗粒。作为非限制性实例，碳水化合物载体可包括但不限于酸酐修饰的植物糖原或糖原类物质，植物糖原辛烯基琥珀酸酯，植物糖原β-糊精和酸酐修饰的植物糖原β-糊精。可通过用可生物降解的阳离子脂质替换阳离子脂质来改善脂质纳米颗粒制剂，所述阳离子脂质被称为快速消除的脂质纳米颗粒(relnp)。已显示可离子化的阳离子脂质例如但不限于dlindma，dlin-kc2-dma和dlin-mc3-dma随着时间的推移在血浆和组织中累积，并且可能是潜在的毒性来源。快速消除的脂质的快速代谢可以将脂质纳米颗粒的耐受性和治疗指数在大鼠中从1mg/kg剂量提高到10mg/kg剂量的数量级。包含酶促降解的酯键可改善阳离子组分的降解和代谢特征，同时仍保持relnp制剂的活性。酯键可以在内部位于脂质链内，或者它可以在末端位于脂质链的末端。内部酯键可以取代脂质链中的任何碳。关于适用于lnp制剂的阳离子脂质的其它信息可以在例如美国公开号us2017/0151339中找到，其通过引用整体并入本文。本公开的分子和/或组合物还可以使用聚合物，脂质和/或其它可生物降解的试剂(例如但不限于磷酸钙)的组合配制成纳米颗粒。组分可以以核壳，混合和/或逐层结构组合，以允许微粒化纳米粒子，从而可以增强本公开的分子和/或组合物的递送。本公开的药物制剂可另外包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，如本文所用，其包括任何和所有溶剂，分散介质，稀释剂或其它液体载体，分散或悬浮助剂，表面活性剂，等渗剂，增稠剂和乳化剂，防腐剂，固体粘合剂和润滑剂等，适合于所需的特定剂型。关于这方面的更多信息可以在remington的thescienceandpracticeofpharmacy，21stedition，a.r.gennaro(lippincott，williams&wilkins，baltimore，md，2006)中找到，其公开了用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于其制备的已知技术。除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不希望的生物效应或以有害方式与药物组合物的任何其它组分相互作用，否则其用途被认为是在本公开的范围。实施例在以下实施例中进一步详细公开了另外的替代方案，这些实施例不以任何方式限制权利要求的范围。实施例1一般实验程序dna模板准备从在补充有50ng/ml氨基甲酰胺(teknova目录号nc9730116)的lb肉汤培养基(teknova目录号l800006)中生长的300ml饱和大肠杆菌transformaxepi300(epicenter目录号ec300105)培养物中纯化质粒dna模板(qiagen目录号12163)。通过not-i消化(newenglandbiolabsneb目录号r3189s)将质粒dna在37℃线性化1小时。然后将线性化的模板dna再次纯化(zymo目录号d4003)，并通过0.8％琼脂糖凝胶(lifetechnologies目录号g5018-08)对商业2-logdnaladder(newenglandbiolabs，nebcat号n3200s)进行分析。在进行体外转录之前，在每个样品中确认存在单一条带，对应于线性dna模板的预期片段大小。体外转录使用1μg如上所述制备的dna模板，在20μl反应中在37℃下孵育1小时(neb目录号e2065s)以进行体外转录(ivt)反应。然后将供应商提供的1单位dna酶i直接加入到ivt反应中，并在37℃下再孵育15分钟。然后将反应置于冰上，并使用制造商建议的方法(qiagen目录号74104)纯化。然后使用nanodrop2000cuv-vis分光光度计定量纯化的rna。在进行电穿孔之前，通过0.8％琼脂糖凝胶(lifetechnologies目录号65018-08)电泳观察rna，并与millenniumrnamarker(ambion目录号am7150)比较。转染和分析在典型的细胞转染实验中，使用用于4d-nucleofectortm系统(lonza)的sfcelllinenucleofectortm试剂盒通过电穿孔将复制子rna引入bhk-21细胞中。使用0.25％胰蛋白酶收获bhk-21细胞，并用冷pbs洗涤一次。将细胞以每20μl电穿孔反应1×106个细胞的细胞密度重悬于sf缓冲液中。将3微克rna在16孔比色皿条中一式三份电穿孔到细胞中，并在室温下温育10分钟。将电穿孔的细胞回收到含有10％胎牛血清的dulbecco改良eagle培养基的平板中，然后在标准细胞培养条件下培养16-18小时。通过流式细胞术进行复制子转染效率和蛋白质产生的细胞内分析。在这些测定中，使用固定/渗透浓缩物和透化缓冲液(ebioscience)固定并透化转染的bhk-21细胞。然后将细胞与用于与r-藻红蛋白(innovabiosciences)缀合的双链rna产生的抗体(j2抗-dsrnaigg2a单克隆抗体，english&scientificcompany)一起温育。通过与缀合有pe-cy5(innovabiosciences)的抗原特异性抗体(例如用于红萤火虫，绿色海肾，ha或rsv-f0(abcam)的抗体)的额外孵育来评估抗原产生。然后将细胞洗涤一次并使用facsariatm融合细胞分选仪(bdbiosciences)或facsariatmii细胞分选仪(bdbiosciences)进行分析。在样品收集之前进行用单色染色的转染bhk-21细胞用于补偿对照。使用facsdiva(bdbiosciences)收集数据并使用flowjo软件进一步分析。使用前向和侧向散点图进行初始选通以排除死细胞和碎片。进行进一步的门控以鉴定对dsrna(r-pe-阳性)和蛋白质表达均为阳性的细胞群(对于gfp表达，pe-cy5-阳性或fitc-阳性)。收集频率和平均荧光强度并用于构建体比较和优化。实施例2含dlp的eav复制子设计的构建该实施例描述了许多基于动脉炎病毒rna复制子的表达载体的产生，其中dlp基序可操作地位于多蛋白/非结构蛋白基因和/或报告基因的上游。随后在实施例4中描述的流式细胞术分析和批量荧光素酶分析中表征和分析这些基于动脉病毒rna复制子的表达载体。a.设计以下描述了四种基于eav的dlp复制子构建体的相应设计特征。(1)rfx-dlp-rff在该构建体中，dlp基序紧接在rff的上游和驱动rff转录的trs7的下游。(2)rex-dlp-pp1ab-rff在该构建体中，dlp基序紧接在pp1ab基因的上游，其具有如下所述的一些仔细的设计修饰，以维持复制子的5’utr中的茎环结构，所述复制子已知对于复制和亚基因组mrna转录是必需的。(i)非结构病毒基因1a的前79个核苷酸被复制，其起始密码子从atg突变为tag，表示为“atg-移位区”(下文seqidno：2的序列中的粗体)。(ii)位于1a基因上游、与其起始密码子atg碱基配对并形成茎的相应核苷酸也相应地从cat改变为cta(下文seqidno：2的序列中加下划线)。(iii)将dlp(以下序列中的斜体)紧接在“atg-移位区”的下游和多蛋白1ab基因的上游(下文seqidno：2的序列中所示的起始密码子atg)。seqidno：2(部分序列)该构建体与第二构建体基本相同，其中dlp遵循相同的三种设计修饰，除了在dlp的3’末端立即添加2a蛋白酶序列(seqidno：3)，使得当翻译时，多蛋白可以通过蛋白酶的选择性切割从dlp衍生的肽中释放。通过复制子构建体2(如上所述)和构建体3的性能的比较分析将提供关于功能性复制子是否需要2a蛋白酶的信息(参见下面的实施例4)。seqidno：3(4)rex-dlp-2a-pp1ab-dlp-rff该构建体与上述第三种构建体基本相同，除了将另一个dlp紧接在报道基因rff基因的上游(与将dlp基序置于构建体1中的方式相同)。通过复制子构建体3(如上所述)和构建体4的性能的比较分析将提供关于位于报告基因上游的额外dlp是否对报告基因的表达具有附加值的信息。b.构建根据gibson等人(enzymaticassemblyofdnamoleculesuptoseveralhundredkilobases.nat.methods6，343-345，2009)描述的3件式gibson程序构建rex-dlp-rff，其中用sphi和ecori消化的rex-rff(c4；seqidno：34)作为载体且含dlp的g区段作为插入物。用于构建rex-dlp-rff的g区段的核酸序列示于序列表中的seqidno：4。设计以下引物以扩增构建上述3种新的基于eav的dlp复制子构建体所需的相应片段。表3构建rex-dlp-nn1ab-rff为了构建rex-dlp-pp1ab-rff载体，通过使用3件式gibson程序产生三个核酸片段，如下所述。用引物rp114和rp115以及模板骨架rex-rff产生片段1。用引物rp116和rp117以及模板骨架rex-rff产生片段2。片段3是rex-dlp-pp1ab-rff的g区段，其具有序列表中seqidno：10所示的核酸序列。构建rex-dlp-2a-pp1ab-rff为了构建rex-dlp-2a-pp1ab-rff载体，通过使用3件式gibson程序产生三个核酸片段，如下所述。用引物rp118和rp115以及模板骨架rex-rff产生片段4。用引物rp116和rp117以及模板骨架rex-rff产生片段5。片段6是rex-dlp-2a-pp1ab-rff的g区段，其具有序列表中seqidno：11所示的核酸序列。构建rfx-dlp-2a-pplab-dlp-rff为了构建rex-dlp-2a-pp1ab-dlp-rff载体，通过使用3件式gibson程序产生三个核酸片段，如下所述。用引物rp118和rp115以及模板骨架rex-dlp-rff产生片段7。用引物rp116和rp117以及模板骨架rex-dlp-rff产生片段8。片段9是rex-dlp-2a-pp1ab-dlp-rff的g区段，其具有序列表中seqidno：12所示的核酸序列。根据gibson等人(2009，同上)描述的3件式gibson程序进行构建体组装。特别地，使用片段1、2和3构建rex-dlp-pp1ab-rff构建体；使用片段4、5和6构建rex-dlp-2a-pp1ab-rff构建体；使用片段7、8和9构建rex-dlp-2a-pp1ab-dlp-rff构建体。随后将组装的产物转化到epicenter的epi300细胞中。对于每次转化，使用引物rp126(seqidno：13)和rp127(seqidno：14)筛选总共144个菌落，产生4个rex-dlp-pp1ab-rff的pcr阳性克隆，3个pcr-rex-dlp-2a-pp1ab-rff的阳性克隆和2个rex-dlp-2a-pp1ab-dlp-rff的pcr阳性克隆。随后的miseq结果显示克隆4，克隆3和15，以及克隆18和20对于rex-dlp-pp1ab-rff，rex-dlp-2a-pp1ab-rff和rex-dlp-2a-pp1ab-dlp-rff分别是完全序列正确的。表4rex-dlp-rff，rex-dlp-pp1ab-rff，rex-dlp-2a-pp1ab-rff和rex-dlp-2a-pp1ab-dlp-rff的图示也显示在图2a-2d中。所得复制子的序列在序列表中公开，其具有t7启动子和65a的polya尾，如下：rex-dlp-rff(seqidno：15)，rex-dlp-pp1ab-rff(seqidno：16)，rex-dlp-2a-pp1ab-rff(seqidno：17)和rex-dlp-2a-pp1ab-dlp-rff(seqidno：18)。实施例3含dlp的甲病毒复制子设计的构建该实施例描述了许多基于甲病毒rna复制子的表达载体的产生，其中dlp基序位于多蛋白/非结构蛋白基因和/或报告基因的上游。随后在实施例5中描述的流式细胞术分析和批量荧光素酶分析中表征和分析这些基于甲病毒rna复制子的表达载体。a.设计以下描述了三种基于甲病毒的dlp复制子构建体的相应设计特征。(1)α-r-dlp-rff在该构建体中，在该构建体中，dlp紧接在报告基因rff的起始密码子的上游。(2)α-r-dlp-2a-nsp-rff在该构建体中，编码dlp基序和2a肽序列的序列(其与上文实施例2中描述的rex-dlp-2a-pp1ab-rff复制子中使用的序列相同)置于具有下面描述的一些仔细设计修饰的复制子的5’末端内，以可能维持复制和亚基因组mrna转录的序列结构要求。(i)将nsp1基因的前195个核苷酸复制，其起始密码子从atg突变为tag(下文seqidno：19的序列中的粗体)。(ii)将该195个核苷酸的复制序列紧接在野生型甲病毒的5’utr之后(下文seqidno：19的序列中加下划线)，并且然后是dlp-2a序列(下文序列中的斜体)。(iii)除去dlp-2a序列后的nsp1基因的起始密码子(下文seqidno：19的序列中的删除线)。seqidno：19(部分序列)(3)α-r-dlp-2a-nsp-dlp-rff该构建体在相同的三个设计修饰之后与构建体2基本相同，除了将另一个dlp基序紧接在报告基因rff基因的上游(与dlp基序置于构建体1中相同的方式)。通过复制子构建体2和3的性能的比较分析将提供关于位于报告基因上游的额外dlp是否对报告基因的表达具有附加值的信息(参见下面的实施例5)。b.构建构建α-r-dlp-rff通过gibsonassembly程序构建α-r-dlp-rff，使用用ecori/sapi消化的α-r-egfp(c6；seqidno：35)作为载体且dlp-rff作为使用引物rp112(seqidno：20)和rp113(seqidno：21)从模板rex-dlp-rff(c2，seqidno：15)pcr扩增的插入物，以用dlp-rff替换ogfp。通过miseq测序确认克隆2和3是完全正确的。表5构建α-r-dlp-2a-nsp-rff和α-r-dlp-2a-nsp-dlp-rff通过gibson程序构建α-r-dlp-2a-nsp-rff(构建体2)和α-r-dlp-2a-nsp-dlp-rff(构建体3)，使用相应的g区段作为插入物且使用引物rp124(seqidno：22)和rp125(seqidno：23)从各模板、α-r-rff(c6；seqidno：35)和α-r-dlp-rff(c2；seqidno：26)pcr扩增的载体。α-r-dlp-2a-nsp-rff的克隆1和3以及α-r-dlp-2a-nsp-dlp-rff的克隆8和32通过miseq序列证实是完全正确的。表6用于构建α-r-dlp-2a-nsp-rff的g区段序列在序列表中作为seqidno：24提供。用于构建α-r-dlp-2a-nsp-dlp-rff的g区段序列也在序列表中提供为seqidno：25。α-r-rff，α-r-dlp-rff，α-r-dlp-2a-nsp-rff和α-r-dlp-2a-nsp-dlp-rff的图示显示在图3a-3d中。所得复制子的序列也在序列表中提供，其具有t7启动子和40a的polya尾，如下：α-r-rff(seqidno：26)，α-r-dlp-rff(seqidno：27)，α-r-dlp-2a-nsp-rff(seqidno：28)和α-r-dlp-2a-nsp-dlp-rff(seqidno：29)。构建α-r-dlp-2a-rff和α-r-dlp-2a-nsp-dlp-2a-rff不受任何特定理论的束缚，据信将dlp基序紧接在报告基因rff的上游而不在它们之间包含2a蛋白酶可能对goi的蛋白质表达产生负面影响。这种负面影响可能是由于rff现在变成“融合”蛋白的事实，这是由于在rff的5’末端存在翻译成肽的dlp序列。因此，设计和构建了2个新构建体，其包括dlp基序和rff基因之间的2a蛋白酶序列，用于两种甲病毒复制子构建体，α-r-dlp-rff和α-r-dlp-2a-nsp-dlp-rff，分别产生α-r-dlp-2a-rff和α-r-dlp-2a-nsp-dlp-2a-rff。包含2a蛋白酶肽序列将使得能够从rff切割由dlp序列编码的肽(参见下文实施例5)。为此目的，合成了两个g区段片段(seqidno：30和31)，并克隆到它们各自的载体中，其通过gibsonassembly用ecorv/sbfi消化。通过使用rp123(seqidno：32)和rp96(p89；seqidno：96)的sanger测序，序列证实α-r-dlp-2a-rff的克隆1和α-r-dlp-2a-nsp-dlp-2a-rff的克隆8和9是完全正确的。表7图4a-4b中提供了α-r-dlp-2a-rff和α-r-dlp-2a-nsp-dlp-2a-rff的图示。实施例4基于eav的含dlp复制子的表达分析如上文实施例2和3中所示，构建了许多基于eav的dlp复制子以确定设计位于复制子非结构蛋白基因或goi基因上游的dlp基序对亚基因组mrna的影响(表8)。表8：含dlp的eav复制子和含dlp的veev复制子的列表。eavdlp复制子rex-dlp-rffrex-dlp-2a-rffrex-dlp-pp1ab-rffrex-dlp-2a-pp1ab-rffrex-dlp-2a-pp1ab-dlp-rffrex-dlp-2a-pp1ab-dlp-2a-rffveevdlp复制子α-r-dlp-rffα-r-dlp-2a-rffα-r-dlp-2a-nsp-rffα-r-dlp-2a-nsp-dlp-rffα-r-dlp-2a-nsp-dlp-2a-rffdlp复制子构建体的初始表征在体外进行。如上文实施例1中所述产生rna并用于电穿孔bhk细胞。电穿孔后，通过fac分析、蛋白质印迹或大量荧光素酶测定分析细胞的蛋白质表达。用于测量来自基于eav的dlp复制子的示例性目的基因(goi)rff荧光素酶报告基因的表达水平的实验结果的图形总结显示于图5中。呈现了fac分析和批量荧光素酶数据两者。在这些实验中，如下分析了四种不同的eavdlp复制子：1)rex-dlp-rff：基于eav的复制子，其具有位于亚基因组mrnarff转录物上游的dlp基序)；2)rex-dlp-pp1ab-rff：基于eav的复制子，其中具有位于非结构pp1ab基因的上游的dlp)；3)rex-dlp-2a-pp1ab-rff：基于eav的复制子，其具有位于非结构蛋白上游的dlp基序和位于dlp和pp1ab区之间的2a蛋白酶肽)；和4)rex-dlp-2a-pp1ab-dlp-rff：基于eav的复制子，其具有位于非结构蛋白上游的第一dlp基序和位于dlp和pp1ab区之间的2a蛋白酶肽以及位于rff亚基因组mrna转录物上游的第二dlp基序)。图5a-5b中所示的结果证明了在eav非结构蛋白基因(例如rex-dlp-pp1ab-rff，rex-dlp-2a-pp1ab-rff或rex-dlp-2a-pp1ab-dlp-rff)或rff报告基因亚基因组rna(例如rex-dlp-rff和rex-dlp-2a-pp1ab-dlp-rff)上游工程化dlp基序不会对基因组rna复制产生负面影响，因为所有四种构建体都显示出几乎相同的电穿孔效率(图5a)。有趣的是，批量荧光素酶活性分析证明rex-dlp-pp1ab-rff复制子表达的荧光素酶显著少于其它三种复制子设计(图5b)。如上所述，在任何goi上游掺入dlp基序将导致在dlp序列中发现的框内密码子中编码的sindbis衣壳氨基酸的n末端融合。用编码dlp和eavnsp1蛋白的氨基酸产生的融合蛋白被认为影响eav复制复合物，从而有效地产生亚基因组rna，并导致降低的rffgoi表达水平。该研究最显著的结果之一是具有控制非结构蛋白基因翻译的dlp的eav复制子(rex-dlp-pp1ab-rff，rex-dlp-2a-pp1ab-rff和rex-dlp-2a-pp1ab-dlp-rff)与在该位置不具有dlp的复制子rna(rex-dlp-rff)一样有效翻译。根据其它研究人员的工作，不能预测这一结果。先前已经报道，掺入5’sindbis病毒亚基因组rna序列(包括dlp区域)仅在被病毒感染的细胞中有效翻译。换句话说，据报道，含有与报道基因相关的dlp基序的mrna在未被sindbis病毒感染的细胞中翻译得很差。在这些细胞中不存在先天免疫激活使得dlp修饰的mrna相对于缺乏dlp修饰的mrna(所有细胞mrna)的翻译具有明显的翻译缺点。在引入含dlp的复制子载体时，先天免疫系统在这些细胞中未被激活，因此这些含dlp的mrna(能够自我扩增)应该非常低效地翻译。出乎意料的是，这在本文提出的实验中没有得到证实。随后，在已经用ifn处理以诱导细胞先天免疫系统的细胞中检查rex-dlp-2a-pp1ab-rffeav复制子。bhk细胞的ifn处理将诱导pkr活化和eif2α的磷酸化，这反过来导致全局细胞mrna翻译的关闭。先前已有报道，动脉炎病毒对ifn治疗敏感(luo等人，antiviralres.aug；91(2)：99-101，2011)，因此对bhk细胞进行ifn处理能够对ifn暴露做出反应并诱导先天免疫系统，会导致动脉病毒复制停止。dlp修饰的eav复制子在先天免疫系统激活存在下的表达能力的代表性实例显示于图6中。与未修饰含有dlp基序的eav复制子(即rex-rff)相比，rex-dlp-2a-pp1ab-rff复制子显示出对先天免疫系统活化的显著抗性。与对照rex-rff复制子相比，ifn处理的细胞中rex-dlp-2a-pp1ab-rff复制子的复制(图6a)和表达(图6b)均显著更高。这些数据表明dlp修饰的eav复制子能够克服先天免疫系统关闭，并且该复制子载体代表自扩增rna技术的显著进步。实施例5含dlp的veev复制子的表达分析如上文实施例2和3中所示，构建了许多基于veev的dlp复制子，以确定位于复制子非结构蛋白基因或goi基因上游的dlp基序对亚基因组mrna的影响。通过使用类似于基于eav的复制子载体的构建策略，将veev甲病毒复制子载体工程化为含有一个或多个dlp基序。重要的是，与甲病毒属的其它成员(主要是旧世界病毒成员)不同，veev的基因组不包含与其亚基因组mrna翻译相关的dlp基序。如上文实施例1中所述，在bhk-21细胞中进行veevdlp复制子的初步分析。bhk-21细胞不响应于rna复制分泌ifn，但这些细胞能够响应外源ifn以诱导先天免疫激活。在该实验中，测试了四种不同的甲病毒复制子构建体。图7中所示的实验数据显示了在电穿孔(0小时)或电穿孔后3小时用i000u/ml外源ifn处理的bhk细胞中含有dlp的甲病毒复制子复制和rff荧光素酶基因的表达。测试的复制子rna是：1)α-r-rff：基于veev的对照复制子，其中不存在dlp；2)α-r-dlp-rff：基于veev的复制子，其具有位于亚基因组mrnarff转录物上游的dlp基序；3)α-r-dlp-2a-nsp-rff：基于veev的复制子，其具有位于非结构蛋白上游的dlp基序，在dlp和nsp区之间的2a蛋白酶；和4)α-r-dlp-2a-nsp-dlp-rff：基于veev的复制子，其具有位于非结构蛋白上游的第一dlp基序，在dlp和nsp区之间的2a蛋白酶，以及具有位于rff亚基因组mrna转录物上游的第二dlp基序。标准化为通过fac分析检测的阳性细胞数的荧光素酶表达结果示于图7中。观察到控制veev非结构蛋白基因翻译的dlp基序的存在导致在电穿孔后存在和不存在ifn处理下更高的报告基因表达(图7a-7c)。尽管rff表达的增加可能已被认为在统计学上不显著，但所有条件下的趋势是蛋白质表达增加。如上文实施例4中关于含dlp的eav复制子所述，人们可能已经预期dlp基序将对不处于先天免疫应答激活状态的细胞中的mrna翻译具有负面影响。与该预期形成鲜明对比的是，在这些实验中未用ifn处理的bhk细胞(图7a)代表了掺入dlp基序的最大益处的样品。随后，将两种rna复制子α-r-rff和α-dlp-2a-nsp-rff在ba1b/c小鼠体内进行测试。在该实验中，以10只动物的组测试小鼠。在这些实验中，将等剂量的rna肌内注射到小鼠中，并且在一周的过程中进行全身ivis(体内成像系统)分析。在注射后第1天，第3天和第7天进行全身成像。在注射部位测量的总通量显示在图3中。虽然从dlp修饰的veev复制子体外注意到蛋白质表达的适度增加(图8)，但是在从dlp修饰的veev复制子rna测量的所有时间点检测到统计学上显著更高的蛋白质表达(图8)。该观察结果代表了显著的优势，因为未修饰的veev复制子载体能够实现非常高的蛋白质表达，其可以达到总细胞蛋白质的高达20％(pushko等人1997)。dlp修饰的veev复制子甚至超过了这种表达潜力，并表现出优异的蛋白质表达；因此，dlp修饰的甲病毒复制子载体代表了对现有甲病毒复制子rna技术的显著进步。从上述实施例中提供的实验数据可以得出至少三个意想不到的结果。首先，当细胞不处于先天免疫系统激活状态时，已显示dlp基序对mrna的翻译产生负面影响。发现本文公开的含dlp的复制子rna在先天活化的基础状态下未在细胞中受到负面影响。其次，发现含有dlp的veev复制子的表达水平甚至高于体内未修饰的复制子。该观察结果表明甚至来自甲病毒复制子的表达水平可以从先前高的历史表达水平增加。第三，所有正链rna病毒在其基因组的5’和3’末端都具有相当大的序列保守性。事实上，veev复制子和eav复制子都足够灵活，以接受在其rna的5’末端掺入茎环结构(dlp)，这是出乎意料的。实施例6使用dlp复制子表达系统的体内免疫原性反应如上所述，将甲病毒复制子载体工程化为含有一个或多个dlp基序。在ba1b/c小鼠体内进一步分析含有dlp序列的rna复制子α-r-gdlp-ha。在该实验中，将15μg，1.5μg或0.15μg编码来自甲型流感/越南/1203/2004(h5n1)的血凝素的rna以分开6周的间隔注射到小鼠中。最后一次加强后14天，收集脾脏和血清以分析对ha的免疫应答。这些实验的结果的总结示于图12a-12c中。在图12a中，与每种可比较剂量的未修饰复制子相比，在含有dlp基序的构建体中观察到记忆前体效应细胞(mpec)的显著增加。使用dextramers(h-2kd(iystvassl；seqidno：44))以及其它群体特异性标记物(cd8+cd44+cd62lloklrg-1loil-7rahicxcr3hi)检测ha特异性mpec。值得注意的是，这种益处在低剂量下也是可观察到的。在图12b和12c中，效应t细胞应答通过用cd4+t细胞或cd8+t细胞肽刺激后分泌ifn-γ的抗原特异性ha细胞的数量来测量。用含有dlp基序的复制子免疫的动物具有显著更高频率的细胞因子表达cd4+和cd8+t细胞是15ug和1.5ug剂量。总之，这些数据表明，与未修饰形式相比，响应于用含有dlp基序的复制子表达的抗原免疫，效应细胞和记忆t细胞应答均显著增加。在ba1b/c小鼠体内进一步分析上述含dlp的复制子与lnp制剂的相容性。在该实验中，将2μg或0.2μg编码来自甲型流感/越南/1203/2004(h5n1)的血凝素的rna以分开4周的间隔注射到小鼠中。最后一次加强后14天，收集脾脏和血清以分析对ha的免疫应答。这些实验的总结示于图14a-14c中。在图14a-14c中，当与lnp(阳离子脂质纳米颗粒)制剂组合时，使用含有dlp基序的构建体观察到t细胞和b细胞应答的增加。在图14a中，与在盐水中施用复制子的组相比，使用lnp制剂的所有剂量组中ha特异性总igg滴度显著更高。此外，在图14b和14c中，观察到与使用盐水中给予复制子的组相比，使用lnp制剂的所有剂量组中ha特异性cd8+和cd4+t细胞也显著更高。总之，该数据表明含有dlp基序的复制子构建体与代表性制剂相容。实施例7使用含dlp的复制子预防抑制免疫应答在体内进一步评估如上所述构建的含dlp的复制子在ba1b/c小鼠中预防抑制免疫应答的能力。在这些实验中，将以分开4周的间隔注射1.5μg具有或不具有dlp基序且携带源自甲型流感/越南/1203/2004(h5n1)的血凝素的编码序列的mrna。在注射前大约24小时，通过流体动力学尾静脉注射用20μgpoly(i∶c)或盐水预处理6-8周龄balb/c小鼠以模拟病毒感染。最后一次加强后14天，收集来自这些小鼠的血清以分析对血凝素(ha)的免疫应答。这些实验的总结示于图13中。在图13中，观察到用poly(i∶c)预处理并接受一定剂量的未修饰复制子的小鼠中ha特异性抗体的血清浓度显著降低。poly(i∶c)组中的水平没有明显高于背景。相反，用poly(i∶c)预处理并给予含有dlp基序的构建体的动物未显示血清抗原特异性总igg浓度的显著降低。总之，这些数据显示，与未修饰的版本相比，dlp基序在模拟病毒感染后响应于疫苗接种而保护免于抑制血清抗体水平。实施例8含dlp表达盒的构建该实施例描述了根据本公开的一些实施方式，用于体外转录含有目的基因上游的sindbis病毒dlp元件的mrna(例如报道基因)的质粒载体的产生。在这些实验中使用的5’和3’非翻译区(utr)(分别为seqidno：36和seqidno：41)衍生自人β珠蛋白基因。将5’utr序列紧接在t7启动子(seqidno：37)的下游和sindbis病毒dlp序列(seqidno：38)的上游。在一些实验中，目的基因(goi)的编码序列通过p2a信号与dlp连接，p2a信号是源自猪捷申病毒-1的自催化自切割肽(例如自身蛋白酶肽)。在一些实验中，不稳定形式的egfp报告基因(dsgfp)的编码序列在这种情况下用作goi，与源自小鼠鸟氨酸脱羧酶基因(modc)的蛋白水解pest降解信号可操作地连接。在一些其它实验中，将红萤荧光素酶报告基因的编码序列用作目的基因(也参见下文实施例9)。然而，预期可以在该配置中部署任何目的基因的编码序列。另外，如图15所示，将衍生自人β珠蛋白的3’utr序列、由120个腺嘌呤残基组成的polya尾和t7终止子插入dsgfp的终止密码子的下游和邻近。上述每种组分的核酸序列如下：表9在上述实验中，使用来自sindbis病毒的dlp序列。进行另外的实验以将来自其它旧世界甲病毒成员例如sv，sfv，bebv，rrv，sag，getv，midv，chikv和onnv的dlp序列掺入本公开的核酸分子中。dlp与目的基因的连接可以配置有或没有自切割肽如p2a。不受任何特定理论的束缚，据信对2a序列或其它自切割肽的需求取决于插入基因盒中的单个基因以及通过包含dlp而添加的额外氨基酸是否会影响翻译的蛋白质功能。进一步预期这里使用的5’和3’utr序列也可以针对任何其它功能utr集而改变，而不管其来源如何。实施例9含dlp表达盒中基因表达的离体评估如上所述，衍生自工程化为含有一个或多个dlp基序的含dlp表达盒的mrna在体外评估增强bhk-21细胞中目的基因表达的能力。作为对照，在相同条件下平行测定缺少dlp序列但其它与上述含dlp的mrna相同的mrna样品。在这些实验中，bhk-21细胞用300、600或1000u/ml通用i型干扰素或载体对照预处理2小时。预处理后，将细胞一式三份用2.5μg含有或缺乏dlp基序的mrna进行电穿孔。将细胞放回含有在预处理期间使用的相同浓度的干扰素的培养基中。通过流式细胞术在电穿孔后2、4和24小时测定gfp阳性细胞的频率和平均荧光强度(mfi)。观察到与干扰素存在下的非dlpmrna相比，含dlp的mrna产生显著更高的gfp阳性细胞频率(图16a)。此外，当gfp的mfi标准化为gfp阳性细胞的频率并且相对于时间作图时，观察到未修饰的mrna对干扰素治疗敏感，如通过统计学在24小时的时间过程中总蛋白质产量显著降低30％所显示(图16b)。相反，含有dlp的修饰mrna表现出对干扰素处理的抗性，如在相同的24小时时间过程中总蛋白质产量相对于对照未修饰mrna的统计学显著增加30％所显示(图16c)。通过用干扰素处理并用含有dlp的mrna电穿孔的细胞产生与未经修饰的mrna电穿孔的未处理细胞一样多的蛋白质，发现由dlp基序的存在赋予的对干扰素治疗的抗性进一步加强(图16c)。实施例10含有dlp的表达盒中基因表达的体内评估如上所述，衍生自工程化为含有一个或多个dlp基序的含dlp表达盒的mrna在体内进一步评估增强ba1b/c小鼠中目的基因表达的能力。在该实验中，将30μg、15μg或1.5μg含有编码红萤荧光素酶的含dlp的mrna以分开6周的间隔注射到小鼠中。随后在注射后1、3、7、10、14、21和28天通过ivis(体内成像系统)分析监测红萤荧光素酶表达。与接受缺乏dlp基序的mrna的对照动物相比，在接受含dlp的mrna的小鼠中观察到荧光素酶表达的显著增加。实施例11使用含dlp的mrna预防抑制免疫应答在体内进一步评估如上所述的含dlp的mrna在ba1b/c小鼠中增强目的基因表达的能力。在该实验中，以分开4周的间隔向小鼠注射30μg，15μg或1.5μg的含有或缺乏dlp基序并携带来自甲型流感/越南/1203/2004(h5n1)的血凝素的编码序列的mrna。在注射前大约24小时，通过流体动力学尾静脉注射用20μgpoly(i∶c)或盐水预处理小鼠以模拟病毒感染。最后一次加强后14天，收集来自这些小鼠的血清以分析对血凝素(ha)的免疫应答。预期在用poly(i∶c)预处理并接受一定剂量的缺乏dlp序列的mrna的小鼠中观察到ha特异性抗体的血清浓度显著降低。相反，预期用poly(i∶c)预处理并给予含有dlp基序的mrna的动物预计不显示血清抗原特异性总igg浓度的显著降低。虽然已经公开了本公开的特定替代方案，但是应该理解，各种修改和组合是可能的并且在所附权利要求的真实精神和范围内。因此，无意对本文中提出的确切摘要和公开进行限制。本文公开的所有参考文献包括但不限于期刊文章，教科书，出版物，专利和专利申请，通过引用整体并入本文，其程度如同每个参考文献被具体和单独地指出通过引用并入。不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。对参考文献的讨论陈述了其作者所声称的内容，并且发明人保留挑战所引用文献的准确性和相关性的权利。将清楚地理解，尽管在此提及了许多信息来源，包括科学期刊文章，专利文献和教科书；任何特定信息来源的讨论和评论都不应被视为承认此类评论被广泛接受为该领域的一般意见。本文给出的一般组合物和方法的讨论仅用于说明目的。并非旨在穷举或限制本公开。特定实施方式的各个方面或特征通常不限于该特定实施方式，而是在适用的情况下是可互换的并且可以在所选实施方式中使用，即使没有具体示出或描述。明确地预期本公开的任何方面或特征可以与本文公开的任何其它方面、特征或方面和特征的组合进行组合。在阅读本公开后，其它替代组合物、方法和实施方式对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且包括在本申请的精神和范围内。序列表<110>合成基因组公司<120>用于增强基因表达的组合物和方法<130>sgi.012wo<150>62/430,250<151>2016-12-05<150>62/486,361<151>2017-04-17<150>62/587,954<151>2017-11-17<160>52<170>patentinversion3.5<210>1<211>145<212>dna<213>sindbis病毒<400>1atagtcagcatagtacatttcatctgactaatactacaacaccaccaccatgaatagagg60attctttaacatgctcggccgccgccccttcccggcccccactgccatgtggaggccgcg120gagaaggaggcaggcggccccgatg145<210>2<211>480<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>2gctcgaagtgtgtatggtgccatatacggctcaccaccatatacactgcaagaattacta60ttcttgtgggcccctctcggtaaatcctagagggctttcctctcgttattgcgagattcg120tcgttagataacggcaagttccctttcttactatcctattttcatcttgtggcttgacgg180gtcactgcctacgtcgtcgatctctatcaactacccttgcgacttaggcaaccttctccg240ctactggatttggagggagttttgttagggactggtccctggacttacccgacgcttgtg300agcatagtcagcatagtacatttcatctgactaatactacaacaccaccaccatgaatag360aggattctttaacatgctcggccgccgccccttcccggcccccactgccatgtggaggcc420gcggagaaggaggcaggcggccccgatgatggcaaccttctccgctactggatttggagg480<210>3<211>66<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<223>2a蛋白水解切割位点<400>3ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccct60ggacct66<210>4<211>1749<212>dna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>尚未归类的特征<223>用于构建rex-dlp-rff的g区段<400>4cagaggcgcaggacttgatccatggcccacctacagcatgccacctgggccaagaaattg60acctttggtccaatgagggcctcgaatattacaaggaagtcaacctgctgtacacacacg120tccccatcaaggatggtgtaatacacagttaccct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