检测MicroRNA-31-5p表达水平的试剂的用途的制作方法

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种检测microrna-31-5p表达水平的试剂在制备肿瘤靶向药敏感性检测试剂盒中的用途。

背景技术：

随着分子生物学技术的发展，人们对肿瘤发病机制有了进一步认识，继而开始了针对细胞受体、关键基因和调控分子为靶点的治疗，称之为“靶向治疗targetedtherapy”，因此，肿瘤靶向药也成为治疗肿瘤的重要药物。与传统化疗药物相比，肿瘤靶向药具有特异性强、疗效明显、正常组织损伤少等优点，此类药物主要有两类，单克隆抗体和小分子化合物。现已有多靶点治疗药物—索拉非尼(2005年上市，sorafenib，bay43-9006)、舒尼替尼(2006年上市，sunitinib，su11248)上市和多个多靶点小分子化合物处于临床试验阶段。

肿瘤靶向小分子化合物药显示出广谱的抗肿瘤活性，尤其是索拉非尼、舒尼替尼上市以来显著延长肝癌、肾癌等晚期肿瘤患者的总生存，改善生活质量，而且这类药物大多具有低毒性、使用方便、可长期用药等特点，临床应用前景广阔。但仍有一部分患者对这类药物发生原发或继发耐药，导致治疗失败。如晚期肾癌患者一线接受sunitinib治疗的中位疾病无进展生存(pfs)仅为8-10个月；sorafenib治疗晚期肾癌的中位pfs只有5.8个月，阐明其耐药机制，发现耐药相关预测分子，对提高肿瘤疗效具有重要意义。

另外，这类药物价格比较昂贵，精准用药将能够大大减轻患者家庭的经济负担。但目前缺乏有效的生物标记物筛选出对靶向药如索拉非尼、舒尼替尼可能有效的亚组人群。同时，也无有效的血液学标志物监控此类药物何时出现耐药，以便及时采用其他治疗措施抑制肿瘤进展。

微小rna(microrna，mirna)是一类长度约为17～25个核苷酸的非编码rna，在进化中具有高度保守性，它主要通过与mrna3’utr端或特异序列结合发挥作用，可以促进靶基因mrna降解或者抑制其翻译进而调节基因的表达。mir-31-5p是近年来研究较为关注的mirna之一，已有报道发现其在不同类型的肿瘤中可能发挥不同作用，比如，在肺癌、结肠癌中，mir-31-5p的表达促进肺癌的发生，而在胃癌、甲状腺癌、前列腺癌等肿瘤中，却呈现表达下调趋势，并发挥抑癌基因功能。但是，目前尚未见microrna-31-5p的表达与肿瘤靶向药索拉非尼或舒尼替尼的治疗相关的报道。

技术实现要素：

发明人在肿瘤多靶点小分子抑制剂药物敏感性检测方面进行了详细研究，发现了microrna-31-5p可以作为其分子标志物。其中，microrna-31-5p在微囊泡中的表达水平与肿瘤靶向药sorafenib、sunitinib的药物敏感性相关。因此，通过微囊泡中的microrna-31-5p表达水平，可以预测待检肿瘤患者的药物治疗效果。

据此，本发明提供了一种肿瘤靶向药敏感性检测试剂盒，以及检测microrna-31-5p表达水平的试剂在制备肿瘤靶向药敏感性检测试剂盒中的用途，并在此基础上，提供了一种增强肿瘤靶向药敏感性的药物。

本发明提供了一种肿瘤靶向药敏感性检测试剂盒，它包括任选的用于检测microrna-31-5p表达水平的试剂。

其中，所述肿瘤靶向药是索拉非尼和/或舒尼替尼。

其中，所述试剂是用于检测微囊泡中microrna-31-5p表达水平的试剂；

和/或，所述检测microrna-31-5p表达水平的试剂包括能特异性扩增microrna-31-5p的pcr引物。

本发明还提供了检测microrna-31-5p表达水平的试剂在制备肿瘤靶向药敏感性检测试剂盒中的用途。

其中，所述肿瘤靶向药是索拉非尼和/或舒尼替尼。

其中，所述试剂是用于检测微囊泡中microrna-31-5p表达水平的试剂；

和/或，所述检测microrna-31-5p表达水平的试剂包括能特异性扩增microrna-31-5p的pcr引物。

本发明还提供了降低microrna-31-5p表达水平的试剂在制备增强肿瘤靶向药敏感性药物中的用途。

其中，所述药物为逆转肿瘤靶向药耐药性的药物。

其中，所述肿瘤靶向药是索拉非尼和/或舒尼替尼；

所述试剂为敲除microrna-31-5p的试剂、使microrna-31-5p沉默的试剂或microrna-31-5p的抑制剂；其中，所述试剂为含有microrna-31-5p反义链的慢病毒载体。

本发明还提供了一种增强肿瘤靶向药敏感性的药物，它能够降低microrna-31-5p的表达水平；

其中，所述肿瘤靶向药是索拉非尼和/或舒尼替尼。

本发明通过检测microrna-31-5p的表达水平，可以判断不同肿瘤患者对肿瘤靶向药的敏感性，进而判断其是否适用特定的肿瘤靶向药治疗：若microrna-31-5p的表达水平高，则患者对肿瘤靶向药sorafenib、sunitinib耐药，若microrna-31-5p的表达水平低，则肿瘤靶向药sorafenib、sunitinib敏感性高，可用于预测临床肿瘤患者的药物治疗效果，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供依据，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1:从sorafenib耐药的肾癌细胞株(786-0-sorr)的培养基上清液中分离纯化微囊泡(mv)，使用电镜鉴定其形态(图1a)，并用wseternblot验证囊泡表面特异性分子cd63的表达情况(图1b)。

图2:耐药细胞分泌的mv能影响其亲本细胞的药物敏感性，导致亲本细胞对sorafenib耐药。

图3:流式细胞术示耐药786-0-sorr细胞分泌的mv能影响其亲本786-0细胞的药物敏感性，导致亲本细胞对sorafenib抵抗。

图4:示耐药786-0-sorr细胞分泌的mv能增强药物敏感的786-0细胞的克隆形成能力。786-0mv：药物敏感细胞786-0分泌的微囊泡(作为对照)，

786-0-sorr：sorafenib耐药细胞分泌的微囊泡(*p＜0.05)。

图5:示耐药786-0-sorr细胞分泌的mv能增强药物敏感的786-0细胞的侵袭能力。786-0mv：药物敏感细胞786-0分泌的微囊泡(作为对照)，786-0-sorr：sorafenib耐药细胞分泌的微囊泡(*p＜0.05)。

图6:定量rt-pcr证实microrna-31-5p在耐药细胞及其分泌的mv中高表达；a：786-0-sorr细胞中microrna-31-5p的表达较其亲本显著增加；b：microrna-31-5p在786-0-sorr细胞分泌的mv中明显高表达(*p＜0.05，**p＜0.01)。

图7:上调microrna-31-5p的表达能介导药物敏感肿瘤细胞或huvec对sorafenib耐药；a：定量pcr证实microrna-31-5p在慢病毒感染后明显高表达；b：上调microrna-31-5p能导致药物敏感肿瘤细胞或huvec对sorafenib耐药(*p＜0.05，**p＜0.01)。

图8:下调microrna-31-5p的表达能恢复786-0-sorr细胞对sorafenib的药物敏感性；a：定量pcr证实microrna-31-5pantisense的慢病毒感染耐药细胞后细胞内的microrna-31-5p显著下调；b：mtt实验显示microrna-31-5pantisense能恢复786-0-sorr细胞对sorafenib的药物敏感性(*p＜0.05，**p＜0.01)。

图9：上调或抑制microrna-31-5p的表达能在体内影响肿瘤对sorafenib的药物敏感性。a&b:microrna-31-5pagomir能使敏感的786-0肿瘤对sorafenib耐药；c&d:microrna-31-5pantagomir能使耐药的786-0-sorr肿瘤对sorafenib敏感；

图10：与药物敏感期(患者用药前)相比，肾透明细胞癌患者sorafenib或sunitinib耐药后血液mv中的microrna-31-5p表达上调，差异有统计学意义

具体实施方式

实施例1检测microrna-31-5p在敏感与耐药细胞株中的表达水平

1、肿瘤靶向药耐药细胞株的建立

选择5种细胞株：肾癌细胞株786-0、achn；肝癌细胞株：hepg2、plc/prf/5；人脐静脉内皮细胞株：huvec，分别用dmem或1640培养基培养，mtt法检测药物sorafenib及sunitinib的ic50。

然后采用浓度梯度递增持续诱导法(最初使用各细胞的ic50处理细胞，细胞死亡后换液去掉漂浮的死亡细胞后逐步按10％-20％增加药物浓度，3-6个月后耐药细胞诱导完成)诱导sorafenib或sunitinib耐药肝癌细胞株、肾癌细胞株及人脐静脉内皮细胞株的产生。

具体结果见下表1和2：

表1亲本及建立的sorafenib耐药细胞株的ic50

sorr:对sorafenib耐药。肾癌细胞株：786-0、achn；肝癌细胞株：hepg2、plc/prf/5；人脐静脉内皮细胞株：huvec

表2亲本及建立的sunitinib耐药细胞株的ic50

sunr:对sunitinib耐药。肾癌细胞株：786-0、achn；肝癌细胞株：hepg2；人脐静脉内皮细胞株：huvec

2、检测微囊泡对不同细胞耐药性的影响

微囊泡的分离提纯：收集肿瘤细胞培养液，1000rpm，室温，离心5min，取上清，去除细胞沉淀；3000g/min，4℃，离心30min，取上清，此时沉淀为一些细胞碎片或者残存的细胞器；将上清加入超速离心机的离心管中，配平(配平的两管之间相差不能超过0.2g)，4℃，11000g/min，离心70min，弃上清。沉淀即为mv，用200～500ulpbs或者所需的培养液等反复吹打溶解，4℃保存备用。对差速离心分离出的物质可用扫描电镜观察和记录其形态和大小，westernblot检测cd63的表达，从而确认分离的物质的确是mv。(图1)

分别从亲本细胞及耐药细胞培养液中分离提纯mv，用mtt法检测。

结果见图2、3，mtt结果显示，耐药肝癌细胞、肾癌细胞及人脐静脉内皮细胞分泌的微囊泡能使其亲本细胞对小分子靶向药物(sorafenib、sunitinib)耐药。流式细胞术显示耐药细胞分泌的微囊泡能使敏感细胞对sorafenib抵抗。

3、克隆形成实验及细胞侵袭实验

结果显示：与耐药肿瘤细胞分泌的mv共培养后，药物敏感肿瘤细胞的克隆形成能力及侵袭能力均增强(图4、5)，这可能与肿瘤细胞的耐药性形成相关。

4、microrna-31-5p在不同细胞微囊泡中的表达情况

用tritonx-100和rna酶处理耐药肿瘤细胞分泌的mv后，结果显示mv中的microrna被降解后，mv将无法导致药物敏感细胞对sorafenib或sunitinib耐药，故mv中的效应分子可能为microrna。

利用microrna芯片进一步分析mv中microrna的表达，sorafenib耐药细胞分泌的mv中发现14个microrna表达上调，sunitinib耐药细胞分泌的mv中发现17个microrna表达上调，在两类耐药细胞株分泌的mv中microrna-31-5p的表达量均明显上调。

通过定量pcr检测microrna-31-5p的表达，

microrna-31-5p检测引物：

forwardprimer：tattcataggcaagatgctggc；

reverseprimer：tatggttgttctcgtctccttctc。

结果见图6。定量pcr结果进一步证实microrna-31-5p在耐药细胞及其分泌的mv中高表达。

实施例2验证microrna-31-5p表达与肿瘤靶向药敏感性的关系

1、细胞水平检测microrna-31-5p表达对sorafenib药物敏感性的关系

构建microrna-31-5p正义或反义链的慢病毒载体。定量pcr验证载体构建成功。应用microrna-31-5p正义链的慢病毒载体感染药物敏感肿瘤细胞，发现上调microrna-31-5p能导致药物敏感肿瘤细胞或huvec对sorafenib耐药(图7)。

应用microrna-31-5p反义链的慢病毒载体感染耐药肿瘤细胞，发现下调microrna-31-5p的表达能恢复786-0-sorr细胞对sorafenib的药物敏感性(图8)。

2、动物水平检测microrna-31-5p表达对sorafenib药物敏感性的关系

建立裸鼠皮下肾透明细胞癌sorafenib敏感(786-0，2﹡106细胞/小鼠)模型和sorafenib耐药(786-0-sorr，5﹡106细胞/小鼠)模型，局部瘤内注射microrna-31-5pagomir(选择本领域常用的microrna-31-5p激动剂，只要能达到提高其表达的目的即可)能使敏感的786-0肿瘤对sorafenib耐药；此外，瘤内注射microrna-31-5pantagomir(选择本领域常用的microrna-31-5p抑制剂，只要能达到抑制其表达的目的即可)能使耐药的786-0-sorr肿瘤对sorafenib敏感。总之，上调或抑制microrna-31-5p的表达能在体内影响肿瘤对sorafenib的药物敏感性(图9)。

实施例3临床检测microrna-31-5p在敏感与耐药肿瘤患者中的表达水平

收集临床上sorafenib或sunitinib耐药的肾透明细胞癌患者的血液标本(sorafenib耐药患者40名，患者中位年龄45岁；sunitinib耐药患者56名，患者中位年龄49岁)，通过差速离心分离血液中mv，rt-pcr检测microrna-31-5p的表达情况。

对照组选择用药前患者的血液样本，一般患者初次用药为sorafenib、sunitinib敏感型，但用药一段时间，少则2-3个月，即可能发生耐药。检测患者耐药前、后血液mv中microrna-31-5p的表达，结果见图10。

由图10可知，在sorafenib耐药前后，microrna-31-5p表达水平从1.98±0.41变为34.5±4.23；在sunitinib耐药前后，microrna-31-5p表达水平从4.23±1.79变为23.7±5.18。

可见，与sorafenib、sunitinib敏感组(耐药前)相比，耐药后患者的microrna-31-5p表达水平显著升高，差异有统计学意义。说明二种肿瘤靶向药的治疗敏感性与microrna-31-5p表达水平相关，microrna-31-5p的低表达会显著提高肿瘤患者对靶向药的敏感性。因此，检测microrna-31-5p表达水平可预测患者对二种肿瘤靶向药是否响应，从而指导患者的临床用药选择。

综上，本发明试剂盒通过检测microrna-31-5p的表达水平，可以判断不同肿瘤患者对肿瘤靶向药的敏感性，进而判断其是否适用特定的肿瘤靶向药治疗：若microrna-31-5p的表达水平高，则患者对肿瘤靶向药sorafenib、sunitinib耐药，若microrna-31-5p的表达水平低，则肿瘤靶向药sorafenib、sunitinib敏感性高，可用于预测临床肿瘤患者的药物治疗效果，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供依据，临床应用前景良好。