本发明涉及一种依靠荧光检测方法，尤其是涉及基于链置换和暗态银簇的生物传感器及其构建方法。
背景技术
基因缺失是dna碱基序列的变化的一种，是指在dna碱基序列缺失一部分所引起的dna序列多态性，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与基因缺失有关。如酰胺trna合成酶相互作用多功能蛋白aimp2是一种新型的肿瘤抑制因子，它的外显子2缺失会造成aimp2形态变异，从而失去抑癌活性，从而导致肺癌、肝癌、皮肤癌、乳腺癌等癌症的发生。因此，在分子水平，构建高灵敏度的生物传感器，实现与疾病相关的基因检测具有重要的研究意义。目前的生物传感器对于基因缺失的检测多涉及到荧光标记或化合物的合成甚至是全基因序列的测定，操作复杂，成本高。
银簇，是指由几个到几十个银原子组成的，尺寸在1-2nm之间的银纳米团簇，具有优越的光化学性能，并且生物毒性小，近年来作为一种潜在的荧光标记物质在生物传感器、生物分子信标、分子逻辑门、细胞成像等方面得到了广泛的应用。银簇由于尺寸较小，微粒间易发生碰撞而导致团聚及荧光淬灭等。因此在水溶液中加入有机模板等保护剂能够控制其尺寸生长，常用的有机模板包括有机配体、含巯基化合物、树状大分子聚合物以及生物大分子(dna、蛋白质等)，其中dna由于结构的多样性，能大大拓宽银簇的发光范围和应用，因此受到广泛的关注。
链置换反应是一种依靠dna分子间或dna分子与其他生物分子之间作用力差异而进行的一种不同dna链之间交换及重新杂交组合的反应，具有操作易受控制、实验条件相对简单、耗时短及产物产率高等优点，近年受到广泛关注。
外切酶iii是一种核酸外切酶，作用于双链dna平末端或者3’凹陷末端，沿3’-5’方向逐步去除单核苷酸，因此可以用于生物传感器中循环放大过程中，实现对目标物的低浓度检测。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高效灵敏、简单、快速的基于链置换和暗态银簇的生物传感器及其构建方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明目的一，提供一种基于链置换和暗态银簇的生物传感器。
基于链置换和暗态银簇的生物传感器共包含三条探针链，分别是c-dna链、p-dna链及s-dna链，
其中，c-dna链由两部分组成，5’端含有富g序列，3’端与银簇模板链s-dna部分互补，同时也与探针链p-dna部分互补，并且与p-dna互补的碱基个数大于与s-dna互补碱基个数；
p-dna链含有能够与目标链(target)完全互补的序列；
s-dna链由两部分组成，5’端是c-dna互补序列，3’端是暗态银簇合成模板序列。
由于不同的互补碱基数造成的dna链间作用力差异，目标链能够将p-dna从p-dna/c-dna双链中拉出来，形成p-dna/target双链，从而使释放出来的c-dna与s-dna结合，拉近暗态银簇合成模板序列和富g序列，从而合成亮态银簇，荧光较强；而target不存在的情况下，由于p-dna/c-dna双链较强的作用力，s-dna中银簇合成模板不能与富g序列靠近，合成银簇为暗态，荧光较弱，从而实现了target的特异性识别。
本发明目的二，提供一种基于链置换和暗态银簇的生物传感器的应用方法。
c-dna链、p-dna链摩尔比为1：1，在pb缓冲溶液中培养过夜，形成互补的双链结构(p-dna/c-dna)。加入target与p-dna/c-dna按摩尔比为1：1，培养，按s-dna与target摩尔比1：1加入s-dna，并随后按照c-dna、硝酸银、硼氢化钠摩尔比1:18:18，加入硝酸银水溶液和冰水新制硼氢化钠溶液，一定温度下培养一定时间后测荧光。
在本发明的一个实施方式中，所述pb缓冲溶液的ph＝7.4，浓度为20mmol/l。
在本发明的一个实施方式中，所述硝酸银水溶液和冰水新制硼氢化钠溶液的浓度依据c-dna浓度配制，使体系中c-dna、硝酸银、硼氢化钠的摩尔比为1:18:18。
在本发明的一个实施方式中，加入target后培养时间一般为1小时，加入硝酸银水溶液和冰水新制硼氢化钠溶液后，一般要4摄氏度下培养5小时后测荧光。
在本发明的一个实施方式中，测荧光时，激发波长为475nm，发射波长为635nm。
在本发明的一个实施方式中，检测荧光，参数设置为狭缝为10nm，电压为600v。
本发明目的三，提供一种基于链置换、暗态银簇和外切酶iii的生物传感器。
基于链置换、暗态银簇和外切酶iii的生物传感器除包含c-dna链、p-dna链及s-dna链以外，还包括外切酶iii，
其中，c-dna链由两部分组成，5’端含有富g序列，3’端与银簇模板链s-dna部分互补，同时也与探针链p-dna部分互补，并且与p-dna互补的碱基个数大于与s-dna互补碱基个数；
p-dna链含有能够与目标链target完全互补的序列；
s-dna链由两部分组成，5’端是c-dna互补序列，3’端是暗态银簇合成模板序列。
由于不同的互补碱基数造成的dna链间作用力差异，目标链能够将p-dna从p-dna/c-dna双链中拉出来，形成p-dna/target双链，但是由于target与p-dna形成的p-dna/target双链中，p-dna的3’端是凹进去的，是外切酶iii的酶切位点，从而使p-dna/target双链中dep-dna从3’端开始被消化，使target释放出来，再次参与到与p-dna/c-dna双链的链置换反应中，从而实现目标dna的循环放大检测。而使释放出来的c-dna与s-dna结合，拉近暗态银簇合成模板序列和富g序列，从而合成亮态银簇，荧光较强；而target不存在的情况下，由于p-dna/c-dna双链较强的作用力，s-dna中银簇合成模板不能与富g序列靠近，合成银簇为暗态，荧光较弱，从而实现了target的特异性识别。而p-dna/c-dna双链中c-dna虽然也有凹进去的3’端，但是适量外切酶iii消化适量c-dna会加速链置换和p-dna/target双链中p-dna的消化，提高反应速率，对于实验结果没有不利影响。
本发明目的四，提供一种基于链置换、暗态银簇和外切酶iii的生物传感器的应用方法。
c-dna链、p-dna链摩尔比为1：1，在pb缓冲溶液中培养过夜，形成互补的双链结构(p-dna/c-dna)。加入target与p-dna/c-dna按摩尔比为1：1，培养，加入10u外切酶iii，一定温度下培养一定时间，按s-dna与target摩尔比1：1加入s-dna，并随后按照c-dna、硝酸银、硼氢化钠摩尔比1:90:36，加入硝酸银水溶液和冰水新制硼氢化钠溶液，一定温度下培养一定时间后测荧光。
在本发明的一个实施方式中，所述pb缓冲溶液的ph＝7.4，浓度为20mmol/l。
在本发明的一个实施方式中，所述硝酸银水溶液和冰水新制硼氢化钠溶液的浓度依据c-dna浓度配制，使体系中c-dna、硝酸银、硼氢化钠的摩尔比为1:18:18。
在本发明的一个实施方式中，加入target后培养时间一般为1小时，加入外切酶iii后一般37摄氏度培养2小时，加入硝酸银水溶液和冰水新制硼氢化钠溶液后，一般要4摄氏度下培养5小时后测荧光。
由于银簇合成过程中c-dna、硝酸银、硼氢化钠的摩尔比变化，合成银簇纳米材料的发光性质发生改变，在本发明的一个实施方式中，测荧光时，激发波长为640nm，发射波长为700nm。
在本发明的一个实施方式中，检测荧光，参数设置为狭缝为10nm，电压为600v。
当目标链target缺失一长段碱基、缺失三个碱基，甚至是单碱基变化时，由于target链不能再与p-dna形成双链，从而使c-dna与s-dna形成双链合成亮态银簇，上述传感器都能够产生很强的荧光信号变化，所以上述传感器可以用于检测基因缺失。
上述传感器完成了氨酰trna合成酶相互作用多功能蛋白2的外显子2缺失的检测，并能够实现很好的线性和特异性检测。分别能实现：0-320nm的线性检测，0.703nmol/l检测限；0-100nm的线性检测，0.489nmol/l检测限。并且由于能够识别三个碱基差异，所以未来可以用于检测较少碱基缺失的检测。
暗态银簇合成模板在单链情况下合成的银簇是暗态的，即荧光很弱，当其与富g序列靠近时，合成银簇是亮态的，即荧光很强。利用暗态银簇的这一特性，本发明设计了一条探针链c-dna，它5’端含有一段富g序列，3’端连接序列与银簇模板链s-dna部分互补，同时也与探针链p-dna部分互补，并且与p-dna互补的碱基个数大于与s-dna互补碱基个数。而p-dna能够与目标链target完全互补。因此s-dna不能将c-dna从p-dna/c-dna双链中置换出来，银簇模板链不能靠近富g序列，合成银簇荧光很弱。当target存在时，由于target与p-dna之间更强的作用力，p-dna从p-dna/c-dna双链中被置换出来，c-dna便从双链中释放，从而与随后加入的s-dna碱基互补配对形成双链，使富g序列与银簇模板靠近，合成银簇荧光较强。另外，本发明将外切酶iii引入体系，通过对target/p-dna双链中的p-dna的切割，释放target再次参与p-dna/c-dna的链置换，从而实现对target的循环检测，提高检测的灵敏性。本发明利用暗态银簇的荧光变化和链置换以及外切酶iii的放大作用，可以用于灵敏检测基因缺失等相关基因检测，并能够实现三个碱基缺失的明显区分。
附图说明
图1为基于链置换和暗态银簇的生物传感器应用原理图；
图2为基于链置换、暗态银簇和外切酶iii的生物传感器应用原理图；
图3是基于链置换和暗态银簇的传感器的可行性荧光图；
图4是target的浓度与荧光强度的关系图；
图5是保持p-dna,s-dna,c-dna不变，不同targetdna的荧光强度对比；
图6是基于链置换、外切酶iii和暗态银簇的传感器的可行性荧光图；
图7是target的浓度与荧光强度的关系图；
图8是保持p-dna,s-dna,c-dna不变，不同targetdna的荧光强度对比。
具体实施方式
基于链置换和暗态银簇的生物传感器共包含三条探针链，分别是c-dna链、p-dna链及s-dna链，其中，c-dna链由两部分组成，5’端是一段含有20个碱基富g序列，3’端是一段与p-dna链的部分互补的序列，包含11个碱基；p-dna链是一段含有18个碱基且与目标链(target)完全互补的序列；s-dna链由两部分组成，5’端是8个碱基的c-dna互补序列，3’端是14个碱基的暗态银簇合成模板序列。
参考图1，基于链置换和暗态银簇的生物传感器的应用方法位：
c-dna链、p-dna链摩尔比为1：1，在pb缓冲溶液中培养一定时间，形成互补的双链结构(p-dna/c-dna)。加入target与p-dna/c-dna按摩尔比为1：1，培养一定时间，按s-dna与target摩尔比1：1加入s-dna，并随后按照c-dna、硝酸银、硼氢化钠摩尔比1:18:18，加入硝酸银水溶液和冰水新制硼氢化钠溶液，一定温度下培养一定时间后测荧光。
由于不同的互补碱基数造成的dna链间作用力差异，目标链能够将p-dna从p-dna/c-dna双链中拉出来，形成p-dna/target双链，从而使释放出来的c-dna与s-dna结合，拉近暗态银簇合成模板序列和富g序列，从而合成亮态银簇，荧光较强；而target不存在的情况下，由于p-dna/c-dna双链较强的作用力，s-dna中银簇合成模板不能与富g序列靠近，合成银簇为暗态，荧光较弱，从而实现了target的特异性识别。
基于链置换、暗态银簇和外切酶iii的生物传感器除包含c-dna链、p-dna链及s-dna链以外，还包括外切酶iii，其中，c-dna链由两部分组成，5’端是一段含有20个碱基富g序列，3’端是一段与p-dna链的部分互补的序列，包含11个碱基；p-dna链是一段含有18个碱基且与目标链(target)完全互补的序列；s-dna链由两部分组成，5’端是8个碱基的c-dna互补序列，3’端是14个碱基的暗态银簇合成模板序列。
参考图2，基于链置换、暗态银簇和外切酶iii的生物传感器的应用方法为：
c-dna链、p-dna链摩尔比为1：1，在pb缓冲溶液中培养一定时间，形成互补的双链结构(p-dna/c-dna)。加入target与p-dna/c-dna按摩尔比为1：1，培养一定时间，加入10u外切酶iii，一定温度下培养一定时间，按s-dna与target摩尔比1：1加入s-dna，并随后按照c-dna、硝酸银、硼氢化钠摩尔比1:90:36，加入硝酸银水溶液和冰水新制硼氢化钠溶液，一定温度下培养一定时间后测荧光。
由于不同的互补碱基数造成的dna链间作用力差异，目标链能够将p-dna从p-dna/c-dna双链中拉出来，形成p-dna/target双链，但是由于target与p-dna形成的p-dna/target双链中，p-dna的3’端是凹进去的，是外切酶iii的酶切位点，从而使p-dna/target双链中dep-dna从3’端开始被消化，使target释放出来，再次参与到与p-dna/c-dna双链的链置换反应中，从而实现目标dna的循环放大检测。而使释放出来的c-dna与s-dna结合，拉近暗态银簇合成模板序列和富g序列，从而合成亮态银簇，荧光较强；而target不存在的情况下，由于p-dna/c-dna双链较强的作用力，s-dna中银簇合成模板不能与富g序列靠近，合成银簇为暗态，荧光较弱，从而实现了target的特异性识别。而p-dna/c-dna双链中c-dna虽然也有凹进去的3’端，但由于仅凹进去2个碱基，外切酶iii的活性大大减弱，基本不会被消化，所以不会对结果造成影响。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1(各种储备液的配制)
1.pb缓冲液(pb：20mm，ph＝7.4)的配制：准确称取na2hpo4·12h2o7.16g于50ml烧杯中，用三重蒸馏水将其完全溶解并转移至100ml容量瓶中，烧杯和玻璃棒用超纯水洗涤三次，洗涤液转移至容量瓶中，定容至100ml，摇匀即可得到100ml0.2m的磷酸氢二钠储备液，备用；准确称取nah2po4·2h2o3.12g于50ml烧杯中，用三重蒸馏水将其完全溶解并转移至100ml容量瓶中，烧杯和玻璃棒用超纯水洗涤三次，洗涤液转移至容量瓶中，定容至100ml，摇匀即可得到100ml0.2m的磷酸二氢钠储备液，备用；取上述已经配置好的储备液：19ml0.2m的nah2po4和80ml0.2m的na2hpo4，混合于1000ml容量瓶，并用三重蒸馏水定容至1000ml，即得20mm，ph＝7.4的pb缓冲液，备用。
2.dna溶液的配置：将p-dna,c-dna,s-dna,target在离心机中以12000r/min转速离心1min，用对应体积的pb缓冲溶液溶解，浓度为100μm，密封后放入90℃烘箱中培养10min，自然冷却至室温后放入4℃冰箱保存备用。
实施例中，p-dna,c-dna,s-dna,target的序列如表1所示。
表1
其中，c-dna链由两部分组成，5’端是一段含有20个碱基富g序列，即gggtggggtggggtgggggt，3’端是一段与p-dna链的部分互补的序列，包含11个碱基，即gcaggattacg；
p-dna链是一段含有18个碱基且与目标链(target)完全互补的序列；
s-dna链由两部分组成，5’端是8个碱基的c-dna互补序列，即tcctgcac，3’端是12个碱基的暗态银簇合成模板序列，即cccttaatcccc。
target中，gctggccacgtgcag、gattacggggcgctg这两部分别为完整序列中缺失部分两侧的序列。
3.硝酸银(agno3)和硼氢化钠(nabh4)溶液的配制：避光条件下准确称取15.3mgagno3于50ml离心管，用三重蒸馏水溶解定容至50ml，即可得到1.8mm的agno3溶液，4℃保存备用；避光条件下准确称取3.4mgnabh4于50ml离心管，用三重蒸馏水(冰水混合物)溶解定容至50ml，即可得到1.8mm的nabh4溶液，避光现配现用。
4.buffer1缓冲液(50mmtris-hno3，10mmmg(no3)2，1mmdtt，ph＝7.0)的配制：准确称取15.4mgdtt，605.7mgtris，256.4mgmg(no3)2于50ml烧杯中，用三重蒸馏水将其完全溶解，并用hno3调节ph至7.0，转移至100ml容量瓶中，烧杯和玻璃棒用超纯水洗涤三次，洗涤液转移至容量瓶中，定容至100ml，即可得到buffer1缓冲液，备用。
5.外切酶iii稀释液(1000units/ml)配制：购买外切酶iii为100,000units/ml，2500units，25μl，使用灭菌枪头快速移取2475μlbuffer1缓冲液稀释至2500μl，配制成1000units/ml溶液，-20℃保存备用。
实施例2(基于链置换和暗态银簇的传感器构建-荧光检测)
1.向2.0毫升离心管中分别加入c-dna，c-dna+p-dna，c-dna+p-dna+target，每个样中每种dna(100μm)的量均为10μl，加入pb缓冲溶液，使体系体积为200μl。在37℃下培养1h；
2.加入适量pb缓冲溶液，使体系体积为970μl，加入10μls-dna(100μm)，10μlagno3(1.8mm)，磁力震荡1min，室温暗态下培养30min；
3.加入10μl新制nabh4(1.8mm)，磁力震荡1min，4℃暗态下培养5h；
4.检测荧光，参数设置为狭缝为10nm，电压为600v。(激发波长为475nm，发射波长为635nm)，即可得到图3。
实施例3(基于链置换和暗态银簇的传感器检测aimp2外显子2基因缺失)
1.向2.0毫升离心管中加入10μlc-dna+p-dna(均为100μm)，分别加入10μl不同浓度target、不同种类目标((均为100μm))，加入pb缓冲溶液，使体系体积为200μl。在37℃下培养1h；
2.加入适量pb缓冲溶液，使体系体积为970μl，加入10μls-dna(100μm)，10μlagno3(1.8mm)，磁力震荡1min，室温暗态下培养30min；
3.加入10μl新制nabh4(1.8mm)，磁力震荡1min，4℃暗态下培养5h；
4.检测荧光，参数设置为狭缝为10nm，电压为600v。(激发波长为475nm，发射波长为635nm)，即可分别得到图4和图5，实现了对目标链0-320nm的线性检测，检测限为0.703nmol/l，并且能实现特异性检测。
表2
以上wt1和wt2分别代表未缺失外显子2时aimp2外显子2附近的基因序列，mt1、mt2和mt3分别代表相对target序列缺失3、3和6个碱基的序列，利用以上序列来探究其他序列对于aimp2外显子2缺失基因检测的干扰。
实施例4(基于链置换、外切酶iii和暗态银簇的传感器构建-荧光检测)
1.向2.0毫升离心管中分别加入c-dna，c-dna+p-dna，c-dna+p-dna+target，每个样中每种dna(100μm)的量均为10μl，加入buffer1缓冲溶液，使体系体积为198μl，加入2μl外切酶溶液(1000units/ml)。在37℃下培养2h；
2.加入适量pb缓冲溶液，使体系体积为920μl，加入10μls-dna(100μm)，50μlagno3(1.8mm)，磁力震荡1min，室温暗态下培养30min；
3.加入20μl新制nabh4(1.8mm)，磁力震荡1min，4℃暗态下培养5h；
4.检测荧光，参数设置为狭缝为10nm，电压为600v。(激发波长为640nm，发射波长为700nm)，即可得到图6。
实施例5(基于链置换、外切酶iii和暗态银簇的传感器检测aimp2外显子2基因缺失)
1.向2.0毫升离心管中加入10μlc-dna+p-dna(均为100μm)，分别加入10μl不同浓度target、不同种类目标((均为100μm))，加入buffer1缓冲溶液，使体系体积为198μl，加入2μl外切酶溶液(1000units/ml)。在37℃下培养2h；
2.加入适量pb缓冲溶液，使体系体积为920μl，加入10μls-dna(100μm)，50μlagno3(1.8mm)，磁力震荡1min，室温暗态下培养30min；
3.加入20μl新制nabh4(1.8mm)，磁力震荡1min，4℃暗态下培养5h；
4.检测荧光，参数设置为狭缝为10nm，电压为600v。(激发波长为475nm，发射波长为635nm)，即可分别得到图7和图8，实现了对目标链0-100nm的线性检测，检测限为0.489nmol/l，并且能实现特异性检测。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
<110>同济大学
<120>基于链置换和暗态银簇的生物传感器及其应用方法
<160>9
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>31
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gggtggggtggggtgggggtgcaggattacg31
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
cccgtaatcctgcacgtg18
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tcctgcaccccttaatcccc20
<210>4
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gctggccacgtgcaggattacggggcgctg30
<210>5
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
gctggccacgtgcaggaagagtctaacctg30
<210>6
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
tcagtgcttgggaaggattacggggcgctg30
<210>7
<211>27
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
gctggccacgtgcagtacggggcgctg27
<210>8
<211>27
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
gctggccacgtggattacggggcgctg27
<210>9
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
gctggccacgtgtacggggcgctg24