本发明属于兽药残留分析
技术领域：
：。具体涉及利用突变蛋白检测β-内酰胺类抗生素残留的方法。本发明能同时检测同时检测35种动物性食源产品中β-内酰胺类抗生素残留量。
背景技术：
：：β-内酰胺类抗生素是指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素。近50年来，β-内酰胺类抗生素被用做畜禽的预防、治疗以及促生长。在现代农业生产中，动物性食品中该类抗生素的添加以及对生长发育的预防性治疗被认为是必不可少的。然而由于该类抗生素的使用不当或滥用造成在动物体内的残留，这危害到动物食品安全及人类健康。世界各国对抗生素的残留有高度的关注，在动物饲养、生产及销售过程中，制定各种相关法律法规来规定抗生素的使用及残留检测。目前β-内酰胺类抗生素已有多种检测方法存在，主要为微生物法、理化分析法、免疫分析法及受体分析法(ahmedetal.,2017)。微生物学分析法基于抗生素对微生物生理机能和代谢的抑制作用，大多选用枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和藤黄八叠球菌等敏感菌株等作为检测指示菌，该方法操作简单、价格低廉，适用于基层大量样品的筛选(ferrinietal.,2008)，但存在检测时间长、稳定性差等缺点，因此很难实现标准化定量检测。理化分析法对抗生素进行定量或定性分析，准确性高，灵敏度高，但需要昂贵的仪器和专业的技术，而且前处理程序复杂，不适合基层样品大规模的筛选(gaudinetal.,2001)。免疫分析法是以抗原抗体的特异性、可逆性结合为核心反应的分析方法，该方法具有快速简便、灵敏度高、特异性强、处理量大等特点，但其中抗体制备技术较为复杂，且由于抗体的特异性高，只能同时检测一种或少数几种抗生素。抗生素受体分析法是基于抗生素和受体之间的特异性识别反应的分析方法，可以同时特异性识别含有具有活性的β-内酰胺环的青霉素类和头孢菌素类抗生素，从而实现抗生素的多残留检测(程古月etal.,2014)。目前受体分析法在抗生素的残留检测中应用较多，如β-内酰胺类(chenetal.,2015,pazzolaetal.,2015)、四环素(moelleretal.,2007)、氯霉素、磺胺类(gaudinetal.,2012,liangetal.,2013)等抗生素。该技术应用于β-内酰胺类抗生素的残留检测中的受体蛋白主要种类较多，其中来自肺炎链球菌的pbp2x重组蛋白(zengetal.,2013)可用于检测牛奶样品中的15种β-内酰胺类抗生素，来自肺炎链球菌的pbp3重组蛋白(张静2015)可用于检测牛奶样品中的27种β-内酰胺类抗生素，最低检测限(limitofdetection,lod)为0.26-109.46μg/kg。本申请人所在的华中农业大学国家兽药残留基准实验室前期研究了β-内酰胺类抗生素受体的筛选及elisa试剂盒研制，构建了原核表达载体pet-28a(+)-blar-ctd，表达并纯化得到高纯度的blar-ctd蛋白，以该蛋白为受体建立了牛奶、牛肉、鸡肉组织中β-内酰胺类抗生素残留的检测方法，头孢喹肟的lod为0.43μg·l-1，低于欧盟和我国的mrl(pengetal.,2013)。然而该研究中蛋白对氯唑西林、头孢氨苄、头孢羟氨苄的亲和力较差，且蛋白的稳定性较差。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过定点突变对blar-ctd进行结构的改造，提高该蛋白的亲和力及稳定性，建立一种能适用于多种可食性动物产品中β-内酰胺类抗生素的多残留的检测方法。本发明的蛋白可应用于，当组织样品中的β-内酰胺类抗生素种类为已知时，可以对其进行半定量分析。为了实现本发明的任务，发明人在原核表达载体pet-28a(+)-blar-ctd的基础上对blar-ctd蛋白进行结构改造(本发明中的突变蛋白，来自于地衣芽孢杆菌的基因体外整合到pet-28a质粒后，再转化到大肠杆菌中，也就是说该突变蛋白已经整合到大肠杆菌，利用本发明保藏的大肠杆菌kcc就是利用了其中的突变蛋白)，获得突变蛋白的原核表达载体pet-28a(+)-blar-ctd-i188k-s19c-g24c，申请人将含有该表达载体pet-28a(+)-blar-ctd-i188k-s19c-g24c的大肠杆菌命名为大肠杆菌kcc，escherichiacolikcc，于2018年3月16日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno:m2018132。本发明提供了一种基于blar-ctd突变蛋白的同时检测40种β-内酰胺类抗生素残留的方法，它包括构建blar-ctd突变蛋白，突突变蛋白的诱导表达及纯化，建立β-内酰胺类抗生素残留检测方法，利用突变蛋白检测β-内酰胺类抗生素，所述方法的具体步骤包括：(1)以原核表达载体pet-28a(+)-blar-ctd为模板，利用突变引物(突变引物的序列如序列表seqidno:3-8所示)进行pcr扩增，得到突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-i188k-s19c-g24c，转化大肠杆菌bl21感受态细胞后，得到保藏编号为cctccno:m2018132突变的大肠杆菌kcc；(2)当步骤(1)得到突变的大肠杆菌的od600为0.6时，加入终浓度为1mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)，18℃恒温振荡培养12h，对该蛋白进行诱导表达，收集菌液后超声破碎，取上清进行纯化，得到高纯度突变蛋白i188k-s19c-g24c；(3)将步骤(2)所得的高纯度突变蛋白i188k-s19c-g24c包被于酶标板上，优化反应条件后进行检测，考察检测方法的精密度、灵敏度和特异性；(4)将步骤(3)建立的检测方法应用于各种可食性动物样品的检测，测定最低检测限，样品回收率及变异系数，考察方法的准确度和重复性。本发明的主要优点如下：1、本发明通过对blar-ctd蛋白进行定点突变，得到能够同时识别40种β-内酰胺类抗生素，而现有的文献和专利报道尚不能识别如此多的对多种β-内酰胺类抗生素残留的检测。2、本发明建立的检测方法可以检测40种β-内酰胺类抗生素的残留，除头孢氨苄外其他药物的最低检测限均在欧盟规定的mrl以下，而且，当待检测β-内酰胺类抗生素种类为已知时，可以对其进行半定量分析。而现有微生物学方法做同类检测，其检测限为高，即现有方法识别的抗生素种类有限，并且无法定量。3、本发明适用的组织包括牛奶、猪、鸡、牛的肌肉组织，适用范围广。4、本发明涉及的样品处理方法简便，易操作，准确度和精密度好。附图说明序列表seqidno:1是突变蛋白i188k-s19c-g24c的核苷酸序列。该序列表中，55位碱基由a替换为t，70位碱基由g替换为t，563、564位碱基由tt替换为aa。序列表seqidno:2是突变蛋白i188k-s19c-g24c的蛋白质序列。该序列表中，19位氨基酸由s替换为c，24位氨基酸由g替换为c，188位氨基酸由i替换为k。序列表seqidno:3是扩增突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-s19c的正向引物f1的序列。序列表seqidno:4是扩增突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-s19c的反向引物r1的序列。序列表seqidno:5是扩增突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-s19c-g24c的正向引物f2的序列。序列表seqidno:6是扩增突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-s19c-g24c的反向引物r2的序列。序列表seqidno:7是扩增突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-i188k-s19c-g24c的正向引物f3的序列。序列表seqidno:8是扩增突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-i188k-s19c-g24c的反向引物r3的序列。图1：为本发明的技术路线图。图2：为本发明中突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-i188k-s19c-g24c的质粒构建示意图。图3：为本发明中突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-i188k-s19c-g24c的质粒图谱。图4：为实施例1步骤(1)得到的地衣芽孢杆菌atcc14580的blar-ctd蛋白3d结构图。图5：为实施例1步骤(1)得到的头孢喹肟与地衣芽孢杆菌atcc14580的blar-ctd蛋白结合图。图6：为实施例1步骤(2)中突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-s19c的测序结果图。图7：为实施例1步骤(2)中突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-s19c-g24c的测序结果图。图8：为实施例1步骤(2)中突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-i188k-s19c-g24c的测序结果图。图9：为实施例3中步骤(7)得到的标准曲线图。具体实施方式下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。大肠杆菌dh5α感受态细胞(批号cd201)和大肠杆菌bl21感受态细胞(批号cd601)均购自北京全式金生物生物技术有限公司。辣根过氧化物酶(hrp)购自美国sigma-aldrich公司。bca蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(产品编号p0010s)。lb/kan固体培养基配制：按常规(121℃,15min)高温高压灭菌后的lb琼脂培养基，冷却至约60℃，按照体积比为2000：1的比例加入卡那霉素(100mg/ml)，充分混匀后，倒入无菌平皿中，待冷却凝固后置于4℃保存。结合缓冲液：称取7.6g磷酸钠，29.22g氯化钠，0.68g咪唑，溶于900ml双蒸水中，补充双蒸水定容至1l，调ph至7.4，采用0.2μm水相滤膜过滤，4℃保存。洗脱缓冲液：称取7.6g磷酸钠，29.22g氯化钠，34.04g咪唑，溶于900ml双蒸水中，补充双蒸水定容至1l，调ph至7.4，采用0.2μm水相滤膜过滤，4℃保存。磷酸盐缓冲液(pbs)：准确称取8.0g氯化钠，0.2g磷酸二氢钠，0.2g氯化钾，2.9g磷酸氢二钠，加去离子水约800ml，调ph至7.4，补充双蒸水定容至1l。实施例1突变质粒的构建(1)突变位点的选择本发明对地衣芽孢杆菌atcc14580的blar-ctd的氨基酸序列和二级结构分析后，发现其不含有游离半胱氨酸且不存在二硫键，在结构域的接口处形成活性口袋。blar-ctd蛋白能特异性地识别β-内酰胺类抗生素，并且可以快速与药物形成结合物。从蛋白柔性区入手，通过引入二硫键来稳定蛋白结构，使其更好地发挥生物活性。通过序列比对发现地衣芽孢杆菌atcc14580和749/i的同源性较高，因此选择749/i为模板，根据rcsbpdb数据库中已有的地衣芽孢杆菌749/i菌株的晶体结构(pdbid：1nrf)，通过sybylx-2.0计算机模拟软件进行同源模建，构建出地衣芽孢杆菌atcc14580的blar-ctd蛋白的3d结构，运用sybylx-2.0分子模拟软件的surflex-dock模块将β-内酰胺类抗生素与受体蛋白blar-ctd进行分子对接，分析两者之间的结合模式，并从中找出主要作用力及关键氨基酸，在蛋白blar-ctd的特定位置引入二硫键，设计突变蛋白，分析改造后的蛋白亲和力和稳定性的改变。1)同源模建使用syble软件根据下列步骤构建出地衣芽孢杆菌atcc14580的blar-ctd蛋白的3d结构：①新建一个orchestrar项目：bioploymer>modelproteins>fugue，设置inputsequencefrom按钮为fastafile，点同一行的“…”按钮，在selection选14580.fasta，然后点击ok，设置profliestosearch按钮为allproflies，其他参数为预设，点击ok，开始运行fugue。打开orchestrar，bioploymer>modelproteins>orchestrar，弹出proteinmanager对话框，点击newproject，确认slectenewprojecttype对话框中fuguerunresults被选中，点击import。②检查同源分子的序列与结构：构建保守区：在proteinmanager中点击modelconservedregions，出现两个对话框，在sequenceviewer中，用滚动栏可以看提问序列与同源分子对比的情况。重新比对：在modelconservedregions对话框中查看序列同源性，点击addhomolog，添加地衣芽孢杆菌749/i菌株的晶体结构(pdbid：1nrf)，同时移除其他同源性低的序列，点击(re)alignquerytohomolog会发现百分一致性更新，sequenceviewer中也发生一些变化。③合并配体：homstrad中某些同源性分子含有ligand，cofactor，metal，water等，在modelconservedregions对话框中点击managerligand/cofactor…按钮，弹出managerligand/cofactor对话框。识别出包含于同源分子中的小分子，将defineligand/cofactor部分中的listtype设置为all，考虑到之后模板中的小分子，选择合适的配体。④建立、分析结构保守区：在modelconservedregions对话框中点击buildscrs，在orchestrar-analyzeconservedregion对话框跳出其中的modelstatus，在viewselectedhomolog列表中列出了构建模型用的同源分子，出现scrslist。检视sequenceviewer对话框：view>textstyle>colorbysecondarystructure，红色为helix，蓝色为sheet。检查不正常的肽链长度和cα-cα距离，在analyzeconservedregion对话框中点击checkdistances，黄色为在gap两侧并标识，红色为肽键比理想键长长20％以上，蓝色为在正常范围内。检视不理想的phi和psi两面角，在analyzeconservedregion对话框中点击checktorsions，红色为在拉氏图outside区，黄色为在拉氏图generous区，蓝色为为在拉氏图core或许可区。检视立体碰撞，在analyzeconservedregion对话框中点击checkforclashes，红色为原理发生了碰撞，黄色为残基至少一个碰撞，蓝色为残基没有碰撞。⑤loop区搜索：点击analyzeconservedregion对话框中searchloops，弹出searchloops对话框。在viewgaps部分检视gap选项，末端的loop区搜索同源分子以及prodat。loopsearch列表第一列的q或h表示该搜索是否已经提交，还是被挂着未动。点击searchloops，进行loop搜索。⑥打开add/analyzeloops窗口，检查并添加loop：检查每个空隙的结构，选中showallmarkedloops预览模型，点击jionallmarkedloops连接loop，搜索余下的缺失残基，在对话框底部点击remodelloops，再点击searchloops，点击jionallmarkedloops，设定模型名称。⑦模建、分析侧链：准备添加侧链，在add/analyzeloops对话框底部点击modelsidechains，borrowsidechainconformationsformhomolog被选中，确认borrowoptions选项为borrowchi1+2+3/restrictchi1+2。添加侧链，点击addsidechains，出现orchestara-analyzesidechains对话框。分析侧链原子间的立体碰撞，选中visualizesidechainclashes，红色为vdw重叠，黄色为碰撞，蓝色为其他。⑧分析模型：在analyzesidechains对话框底部点击analyzemodel，出现analyzemodel对话框。对模型进行一个简单的检查，点击checkbackbonedistances，检查不理想的肽键键长与cα-cα距离，点击checkbackbonetorsions，红色为偏离理想区域。用protable在拉氏图里显示phi/psi两面角，点击analyzemodel(protable)，mss：protein>ramachandranplot。点击analyzemodel对话框底部的savemodel。经过同源模建得到地衣芽孢杆菌atcc14580的blar-ctd蛋白结构如图4所示，主要由两个结构域组成，α/β型的结构域由两个α螺旋(α1和c-末端的α10)覆盖在一个七股反向平行的β平面(β1-β7)，而在另一面由α3螺旋和α8螺旋覆盖，第二个结构域主要是由四个螺旋(α5、α6、α7和α9)包围疏水α4螺旋组成的。该蛋白催化口袋的中心区域由s(55)tyk(58)，s(103)at(105)和k(192)tg(194)组成，β-内酰胺类抗生素的结合位点为ser55。2)surflex-dock运用建立好的蛋白3d结构，按照下述操作进行蛋白与β-内酰胺类抗生素的分子对接，根据分子对接结果得到蛋白的活性口袋及与药物作用的活性位点，在后期突变位点的选择过程中要避开这些位点。①建立活性构象：从蛋白质结构数据库(proteindatabank，pdb)选取蛋白质大分子以及已有结构小分子，将化合物和配体的三维结构分别导入数据库中。②设定对接模式、修正蛋白及提取配体：打开surflex-dock界面，点击applications>dockingsuite>dockligands，确认“dockingmode”为“surflex-dock(sfxc)”，在dockingmode区域里点击define，打开surflex-dock(sfxc)对话框。在surflex-dock(sfxc)对话框中将receptor文件格式设为pdb，点击“…”按钮，从打开的文件管理器窗口选择一个需要的蛋白文件并点击ok确认，点击prepare，打开prepareproteinstructure对话框，对配体蛋白进行处理。点击extractligandsubstructures，在other列表中选择配体的结构并点击ok。点击removesubstructures，在water列表，点击selectall按钮，删除所有的水分子，点击ok。点击analyzeselectedstructure激活蛋白准备按钮，点击addhydrogens，选择“all”“random”，点击ok，加氢后analyzeselectedstructure按钮会变灰。点击receptorpreparation下方的ok按钮完成蛋白的准备以及配体的提取。③设定对接口袋：在surflex-dock-definesfxcfile对话框，设定protomolgenerationmode为residues，设置关键氨基酸位点，点击generate，点击ok产生surflex-docksfxc文件。④准备配体文件：点击cancle按钮暂时退出surflex-dock界面。读入配体文件，点击edit>addhydrogens为配体加氢，然后点击file>exportfile保存配体文件。⑤指定待对接的配体并提交作业：重新打开surflex-dock界面，点击applications>dockingsuite>dockligands，确认“dockingmode”为“surflex-dock(sfxc)”，在dockingmode区域里点击“…”按钮，选择设置好的配体文件。在ligandsource区域，设置配体文件格式为mol2，点击“…”，选择一个待对接的配体文件。在options区域内，点击surflex-dock，打开surflex-dock-details窗口；在referencemolecule区域内，下拉框选择mol2file并点击右侧的“…”，选择一个配体参考文件，点击ok退回docking界面。取消对performcscorecalculations的勾选。设置作业名称，点击ok，提交作业。⑥查看对接结果：打开surflex-dock界面，点击applications>dockingsuite>analyzeresults。在resultsbrowser界面，点击jobname右侧的“…”，打开作业目录。在配体列表框内查看对接打分和配体的最高得分对接构象。点击sybyl主界面的file>importfile，读入配体文件，观察对接前后配体构象、位置的差异。点击配体列表框内上方的table，然后点击配体文件，可以查看配体对接后输出的全部构象及打分详情。将模建后得到的蛋白与β-内酰胺类抗生素进行分子对接。头孢喹肟与blar-ctd蛋白的对接结果如图5所示，蛋白靶标与头孢喹肟配体之间形成9条氢键，除了与已有文献报导的关键氨基酸ser55、ser103、thr105、thr193之间形成氢键，其中与ser55、ser103、thr105之间均形成1条氢键，与thr193之间形成3条氢键，此外，头孢喹肟配体也与tyr87之间形成2条氢键、与thr195之间形成1条氢键。氢键作为分子间作用最强的非键作用，氢键的数量越多，表明该配体分子与蛋白的结合能力越强。列举对接过程中参与氢键形成的氨基酸残基如表1所示，除了活性位点以及紧挨着活性位点的氨基酸ser55、ser101、ser102、ser103、thr105、thr193、thr195外，还有空间位置距离活性中心较近的tyr87、glu89、arg229、ser233氨基酸也参与氢键的形成，因此在后续突变位点的选择过程中要避开这些位点，以免降低蛋白与药物的结合能力。表1blar-ctd蛋白与β-内酰胺类抗生素特异性结合的氨基酸位点及打分结果3)单点突变位点的确定除二硫键外，盐桥也可以增加蛋白的稳定性，i188位于β5片段，将其突变为lys，可与β6片段中的e212形成盐桥。此外可以通过比对结构相似的青霉素结合蛋白，利用其他青霉素结合蛋白中的活性位点氨基酸，将blar-ctd蛋白的相应位点突变为该氨基酸，以期提高蛋白的亲和力，来自肺炎链球菌r6的pbp3蛋白对头孢羟氨苄的亲和力相对于blar-ctd较高(张静2013)，分析pbp3与头孢羟氨苄的分子对接结果，在ktgttd序列中d244与头孢羟氨苄形成氢键，通过序列比对在blar-ctd中该序列为ktgtsv，因此设计突变体v197d以期提高blar-ctd蛋白对头孢羟氨苄的亲和力。利用sift和ployphen2软件来预测突变位点，选择突变位点后，通过软件预测将该位点突变为其他氨基酸后是否对蛋白的功能造成影响，sift的打分越高，ployphen2软件的打分越低，说明突变越合理，根据打分结果来设计蛋白突变体。结合这些因素，可以选择出合适的单点突变位点如表2所示。表2氨基酸突变位点的预测结果4)引入二硫键根据同源模建得到的地衣芽孢杆菌atcc14580的blar-ctd的3d结构，利用disulfidebydesign2.0软件得到可能形成二硫键的氨基酸位点，如表3所示。排除活性位点、关键氨基酸及引入易造成空间位阻的氨基酸位点，根据形成二硫键的两个半胱氨酸在blar-ctd二级结构的位置，将其分为四类，主要集中于ω样的loop区、β片段与紧邻的α螺旋、α螺旋之间与β片段之间。根据软件模拟得到的数据，根据成键能量较小、温度因子较高的原则，结合蛋白与药物的分子对接结果，排除活性中心附近的氨基酸位点，筛选出合适的突变位点s76c-l96c、s135c-s145c、r50c-q147c、s19c-g24c、e183c-i188c。表3地衣芽孢杆菌atcc14580的blar-ctd中可能形成的二硫键的氨基酸位点为了同时提高蛋白的亲和力和稳定性，通过彭娟建立的受体分析法(pengetal.,2013)对突变蛋白进行活性鉴定，比较蛋白的活性(如表4所示)，表明突变蛋白s76c-l96c、s135c-s145c在检测中没有活性，则分别以二硫键突变蛋白s19c-g24c、s135c-s145c、e183c-i188c为模板，进行单点突变。比较突变蛋白抑制率(如表5所示)，筛选出突变蛋白i188k-s19c-g24c对各种β-内酰胺类抗生素的亲和力最好，作为本发明的目的蛋白。表4突变蛋白的活性鉴定表5药物对突变蛋白的抑制率(2)突变质粒的获得1)挑取少量pet-28a(+)-blar-ctd表达菌(来自专利β-内酰胺类抗生素残留检测的受体分析法与试剂盒，申请号：cn201310196144.4，公开号：cn103897046a，公开日：2014-07-02)的冻干粉，接种至2ml的lb肉汤培养基中，37℃，220rpm恒温摇床中震摇培养过夜。挑少量菌液划线接种于lb/kan琼脂平板，37℃过夜。挑取单菌落于10ml的lb/kan肉汤培养基中，37℃，220rpm恒温摇床中震摇培养过夜后提取质粒pet-28a(+)-blar-ctd，-20℃冻存。2)以pet-28a(+)-blar-ctd质粒为模板，用引物f1、r1进行pcr扩增，将扩增后的产物(测序结果如图6所示)转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞并涂布于lb/kan琼脂平板。引物f1，r1序列如下：f1:gatgactgcaccttttttgatggct，(seqidno:3)r1:ggtgcagtcatcttcgtattctaca；(seqidno:4)3)挑取步骤2)平板上单菌落于10ml的lb/kan肉汤培养基中，37℃，220rpm恒温摇床中震摇培养过夜后提取突变质粒s19c，以突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-s19c为模板，用引物f2、r2进行pcr扩增，扩增后的产物(测序结果如图7所示)转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞并涂布于lb/kan琼脂平板。引物f2，r2序列如下：f2:tttgattgcttctcaggaggttttg，(seqidno:5)r2:agaagcaatcaaaaaaggtgcagtc；(seqidno:6)4)挑取步骤3)平板上单菌落于10ml的lb/kan肉汤培养基中，37℃，220rpm恒温摇床中震摇培养过夜后提取突变质粒s19c/g24c，以突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-s19c-g24c为模板，用引物f3、r3进行pcr扩增，扩增后的产物(测序结果如图8所示)转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞并涂布于lb/kan琼脂平板。引物f3、r3的序列如下：f3:gtcccggttttaccggatagttttctgccatttgattcttct，(seqidno:7)r3:agaagaatcaaatggcagaaaactatccggtaaaaccgggac；(seqidno:8)5)挑取步骤4)平板上单菌落于10ml的lb/kan肉汤培养基中，37℃，220rpm恒温摇床中震摇培养过夜后提取突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-i188k-s19c-g24c。2.2突变蛋白i188k-s19c-g24c的获得将突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-i188k-s19c-g24c转化到大肠杆菌bl21感受态细胞并涂布于lb/kan琼脂平板，得到包含blar-ctd突变蛋白的大肠杆菌kcc。实施例2突变蛋白的诱导表达与纯化(1)突变蛋白的诱导表达将突变质粒pet-28a(+)-blar-ctd-i188k-s19c-g24c转化到大肠杆菌bl21感受态细胞并涂布于lb/kan琼脂平板，得到包含突变蛋白i188k-s19c-g24c的大肠杆菌kcc。采用大肠杆菌bl21表达体系对突变蛋白进行体外表达(pengetal.,2013)，得到突变蛋白i188k-s19c-g24c总蛋白、超声后的蛋白上清及沉淀。(2)sds-page检测将步骤2.1得到的突变蛋白i188k-s19c-g24c总蛋白、超声后的蛋白上清及沉淀进行sds-page检测(pengetal.,2013)。结果表明本发明的突变蛋白i188k-s19c-g24c总蛋白、超声后的蛋白上清及沉淀均含有26kd左右的条带，但上清中蛋白含量远大于沉淀中蛋白含量，突变蛋白几乎都在上清中，说明在此条件下突变蛋白以可溶性蛋白存在。(3)突变蛋白的纯化1)用10ml的结合缓冲液来平衡镍柱。2)加入步骤(1)收集的蛋白上清，使样品与纯化柱内的nisepharose6fastflow悬浊液在4℃下充分反应90min，每10min左右振荡一次柱子，使his标签与ni充分结合。当所有的样品通过柱子后，加入约10个柱体积的的结合缓冲液洗涤。3)预先将洗脱缓冲液和结合缓冲液按不同比例混合，洗脱缓冲液比例分别为5％、10％、20％、40％、60％、80％、100％，相对应的咪唑浓度约为35、60、100、200、300、400、500mmol/l。4)将不同比例的缓冲液混匀，从低浓度到高浓度的顺序加入到柱子中以洗脱蛋白，每个浓度约加入6个柱体积，并收集咪唑浓度为60、100、200mmol/l时的洗脱液。6.将收集的洗脱液用pbs进行透析，得到突变蛋白。(4)突变蛋白的验证1)将步骤(3)得到的透析后蛋白进行sds-page验证，结果表明纯化后得到了纯度较高的突变蛋白。2)将步骤(3)得到的突变蛋白进行sds-page后，用westernblot方法进行验证(所用抗体，一抗为his-tag单克隆抗体，二抗为hrp标记的羊抗鼠抗体)，并用dab显色。结果显示突变蛋白为阳性。(5)突变蛋白产量的检测将步骤(3)得到的突变蛋白用bca蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。结果表明突变蛋白的浓度为1.3mg/ml。实施例3β-内酰胺类抗生素检测方法的建立(1)制备hrp标记的氨苄西林采用碳二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺(edc/nhs)法(pengetal.,2013)合成酶标药物，即辣根过氧化物酶标记的氨苄西林hrp-amp，分别测定amp、hrp以及hrp-amp放入紫外全波长图，得到各物质的最大吸收波长，鉴定是否偶联成功。(2)突变蛋白最佳包被浓度的确定采用方阵滴定法初步选定最佳的包被突变蛋白的浓度，选择标准以od450值位于2.0附近，且相邻两孔od值有较大变化的包被浓度和对应的酶标记物稀释度为最佳组合。突变蛋白用pbs缓冲液稀释后，向酶标板内每孔加入蛋白溶液100μl，4℃过夜包被，倒掉孔内液体，每孔加入pbst250μl，静置2min，弃去孔内液体并拍干，重复洗涤3次；每孔加入封闭缓冲液250μl，4℃封闭12h，弃去孔内液体，每孔加入pbst250μl，静置2min，弃去孔内液体并拍干，重复洗涤3次；每孔加入pbs缓冲液50μl和按照体积比为1:150、1:300、1:600、1:1200、1:2400进行稀释步骤(1)得到的hrp-amp溶液50μl，混匀后37℃孵育45min，弃去孔内液体，每孔加入pbst250μl，静置2min，弃去孔内液体并拍干，重复洗涤3次；每孔加入现配的底物混合液100μl，37℃避光显色15min；每孔加入终止液50μl；用酶标仪测定各孔od450值。结果表明当蛋白稀释倍数为1300倍(即蛋白浓度为1μg/ml)，酶标记物稀释倍数为1200倍(即酶标记物浓度为0.36μg·l-1)时，为其最佳包被浓度。(3)包被液的确定分别用ph值为7.4的pbs缓冲液和ph值为9.6的cbs缓冲液稀释突变蛋白到最佳稀释度，充分混匀后，每孔加入100μl，4℃过夜包被，后续按照elisa操作程序进行，测定包被液的od450值。结果表明以pbs缓冲液作为包被液的od值明显高于cbs缓冲液，因此本申请选择pbs缓冲液作为包被液。(4)封闭条件的确定封闭液的优化：使用优化后所确定的缓冲液稀释突变蛋白，每孔加入100μl，4℃过夜包被，然后分别加入1％的ova(卵清蛋白)和bsa(牛血清白蛋白)封闭液进行封闭，并设置阴性对照孔，每孔250μl，4℃湿盒中过夜，后续按照elisa程序进行，测定封闭液的od450值。结果表明以bsa缓冲液作为封闭液的效果明显优于ova缓冲液，因此选择bsa缓冲液作为封闭液。封闭方式的优化：使用pbs缓冲液稀释突变蛋白，每孔加入100μl，4℃过夜包被，用bsa封闭液分别放入37℃封闭2h和4℃封闭12h，后续按照elisa程序进行，测定封闭液的od450值。结果表明4℃，封闭12h的效果优于37℃，封闭2h的效果，因此本申请选择封闭条件为4℃，封闭12h。(5)反应条件的确定使用pbs缓冲液稀释突变蛋白，每孔加入100μl，4℃过夜包被，用bsa封闭液4℃封闭12h，加入hrp-amp(辣根过氧化物酶标记的氨苄西林)后，置于25、30、33、35、37℃中分别反应15、30、45、60min，后续按照elisa程序进行，测定封闭液od450值。结果表明30℃反应30min时封闭液的od值最大，因此反应条件选择30℃反应30min。(6)相关试剂的配制1)包被有突变蛋白的酶标板将实施例2中突变的大肠杆菌kcc用步骤(3)制备得到的突变蛋白，用pbs缓冲液稀释至1μg/ml，向聚丙乙烯酶标板内每孔加入所述的突变蛋白溶液100μl，在4℃湿盒中过夜包被，倒掉孔内液体，每孔加入pbst洗涤缓冲液(见后所述)250μl，静置2min，弃去孔内液体并拍干，重复洗涤3次；每孔加入250μl封闭液，于4℃湿盒中封闭12h，弃去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。2)其他试剂的配制包被缓冲液(优选pbs缓冲液，即，磷酸盐缓冲液)：准确称取8.0g氯化钠，0.2g磷酸二氢钠，0.2g氯化钾，2.9g磷酸氢二钠，加双蒸水约800ml，ph调至7.4，加双蒸水定容至1l。洗涤缓冲液(pbst)：pbs缓冲液中加入0.05％的tween-20，混匀后备用。封闭缓冲液(优选bsa)：准确称取牛血清白蛋白10g，加入1l的pbs缓冲液，搅拌至蛋白完全溶解。底物a液：准确称取160mg的四甲基联苯胺(tmb)，加入10ml的二甲基乙酰胺，搅拌至完全溶解。底物b液：准确称取13.70g柠檬酸，10.14g柠檬酸三钠和282.00mg过氧化氢脲，加入双蒸水溶解，定容止1l。底物混合液：准确称取10ml底物b液，加入100μl底物a液，混匀，现配现用。终止液：准确量取浓硫酸100ml，缓慢滴加至800ml的双蒸水中。3)头孢喹肟标准品溶液的配制头孢喹肟标准品储备液：准确称取头孢喹肟标准品4.815mg(德国dr.ehrenstorfer公司，纯度96.3％)，少量甲醇水(甲醇：水体积比＝1：1)溶解，用蒸馏水定容至5ml，即为1mg·ml-1的母液，分装并在-20℃下贮藏。头孢喹肟系列浓度标准溶液的配制方法：10μg·ml-1标准液：准确吸取10μl标准品储备液于990μl的pbs，涡旋20s充分混匀，得到10μg·ml-1标准液。100μg·l-1标准液：准确吸取10μg·ml-1标准液10μl于990μl的pbs，涡旋20s充分混匀，得到100μg·l-1标准液。8μg·l-1标准液：准确吸取100μg·l-1标准液10μl于1840μl的pbs，涡旋20s充分混匀，得到8μg·l-1标准液。4μg·l-1标准液：准确吸取8μg·l-1标准液1ml于1mlpbs，涡旋20s充分混匀，得到4ng/ml标准液。2μg·l-1标准液：准确吸取4μg·l-1标准液1ml于1mlpbs，涡旋20s充分混匀，得到2μg·l-1标准液。1μg·l-1标准液：准确吸取2μg·l-1标准液1ml于1mlpbs，涡旋20s充分混匀，得到1μg·l-1标准液。0.5μg·l-1标准液：准确吸取1μg·l-1标准液1ml于1mlpbs，涡旋20s充分混匀，得到0.5μg·l-1标准液。(7)用突变蛋白检测头孢喹肟的标准曲线具体步骤如下：1)向包被有突变蛋白的酶标板中每孔加入pbst250μl，静置2min，弃去孔内液体并拍干，重复洗涤3次。2)每孔加入50μl头孢喹肟标准品溶液和50μl酶标记物，用盖板盖上板子后，放入30℃水浴锅中反应30min，甩干孔内液体。3)每孔加入pbst250μl，静置2min，弃去孔内液体并拍干，重复洗涤3次。4)每孔加入现配的底物显色液100μl，37℃恒温箱中避光显色15min。5)每孔加入终止液50μl，用酶标仪测定各孔od450值。零孔的od值为b0，各药物孔的od值为b，以药物浓度的对数值为横坐标，抑制率(b/b0)为纵坐标，绘制标准曲线如图，得到回归方程和相关系数分别为y＝-0.4547x+0.7687,r＝0.9998，计算出ic50值为3.90μg·l-1，其线性范围为0.5-8μg·l-1。(8)用突变蛋白检测头孢喹肟的精密度按照步骤(7)所述步骤，将头孢喹肟标准品浓度0.5、1、2、4、8μg·l-1对应的od值分别代入到上述建立的标准曲线方程中，计算相应的药物浓度，以标准品浓度测定值来计算elisa方法标准曲线的板内及板间变异系数。结果如表6所示，板内变异系数和板间变异系数均不超过10％，表明具有较好的精密度。表6标准曲线的变异系数测定(9)用突变蛋白检测头孢喹肟的灵敏度按照步骤(7)所述步骤，对20个0μg·l-1标准品溶液进行检测，将检测值代入标准曲线方程中计算对应的标准品浓度，并求出平均值(c)和标准差(sd)。根据公式z＝c+3×sd(公式1)计算，得到的数据为此方法的灵敏度。结果如表7所示，表明该受体分析法对头孢喹肟的灵敏度为0.73μg·l-1。表7elisa方法的灵敏度测定(10)用突变蛋白检测β-内酰胺类抗生素的特异性将其他β-内酰胺类抗生素标准品用pbs缓冲液进行梯度稀释，按照步骤(7)所述步骤将各个标准品稀释液进行检测。零孔的od值为b0，各药物孔的od值为b，以药物浓度的对数值为横坐标，抑制率(b/b0)为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数，并计算ic50值。各种β-内酰胺类抗生素结果显示，吸光度值与每孔加入的各药物浓度成反比，证明突变蛋白具有识别多种β-内酰胺类抗生素的特性，并呈现线性关系，说明突变蛋白可以用于β-内酰胺类抗生素的检测。以头孢喹肟为标准药物，按照以下公式计算交叉反应率(crossreactivity,cr)：cr(％)＝ic50(头孢喹肟)/ic50(其他药物)×100(公式2)，结果见表8。如表8所示，本发明的突变蛋白对35种β-内酰胺类抗生素均有较高的交叉反应率，可用于动物组织中β-内酰胺类抗生素残留检测方法的建立；但本实施例中本发明的突变蛋白与头孢辛呋、头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄、亚胺培南的交叉反应率较低，且不识别氨曲南。见表8。表8突变蛋白i188k-s19c-g24c对β-内酰胺类抗生素的交叉反应率测定实施例4用突变蛋白检测β-内酰胺类抗生素的应用试验(1)样品的处理准确称取新鲜的全脂牛奶样品1.00±0.02g置于1.5ml的离心管中，添加预先稀释好的各种β-内酰胺类药物，充分涡旋混合均匀后，加入提取液pbs缓冲液使样品稀释到合适的浓度，混合均匀后取混合溶液用于分析。准确称取经过匀浆处理的新鲜猪肉、鸡肉、牛肉组织样品2.00±0.02g置于50ml的离心管中，添加预先稀释好的各种β-内酰胺类药物，加入提取液pbs缓冲液，充分混匀后于4000rpm离心10min，取上清充分涡旋混合均匀后用于分析。(2)最低检测限按照实施例3步骤(7)所述步骤，测定20份牛奶空白样品或组织空白样品的od值。将其带入标准曲线中计算其相应的样品浓度，并计算20份样品的平均值(c)和标准差(sd)。根据公式z＝c+3×sd(公式1)计算，得到的数据为组织方法的最低检测限(lod)，根据公式q＝c+10×sd(公式3)计算，得到的数据为组织方法的最低定量限(loq)。牛奶、猪肉、鸡肉、牛肉组织中β-内酰胺类抗生素最低检测限如表9所示，该类药物的最低检测限均低于欧盟规定的最高残留限量(mrl)。(3)回收率试验取空白样品，按照1×loq、2×loq、4×loq将β-内酰胺类抗生素添加到空白样品中，每个浓度重复3次，每个样品做5个平行样品，对样品进行处理。按照实施例3建立的方法进行检测，将检测值带入相应β-内酰胺类抗生素的标准曲线中计算样品浓度的测量值，按照以下公式计算回收率和变异系数：回收率(％)＝实测浓度/添加浓度×100(公式4)变异系数cv(％)＝样品标准差/样品平均值×100(公式5)按照公式4计算回收率，考核方法的准确度；按照公式5计算批内和批间变异系数，考核方法的重复性。β-内酰胺类抗生素在牛奶、猪肉、鸡肉、牛肉组织中的添加回收率及批内与批间变异系数测定结果见表10、11。结果表明，样品中的平均回收率在51.77％～119.77％之间，大部分药物基本符合农业部对回收率在60％～120％的要求，说明准确度良好；批内和批间变异系数均在20％以内，说明重复性良好。表9样品中β-内酰胺类抗生素的检测限与定量限表10牛奶、猪肉样品中β-内酰胺类抗生素的添加回收率表11鸡肉、牛肉样品中β-内酰胺类抗生素的添加回收率实施例5大肠杆菌kcc的保存从转化的琼脂平板上挑取i188k-s19c-g24c的单克隆菌落即为大肠杆菌kcc，于2ml的lb/kan肉汤培养基中，37℃，220rpm恒温摇床中震摇培养至od600达到0.5左右，取500μl大肠杆菌kcc菌液加入500μl的40％甘油，置于-70℃冰箱冻存。40％甘油的配制：取4ml甘油加入到6ml的去离子水中，混合均匀后于121℃灭菌15min。参考文献：程古月等，β-内酰胺类抗生素残留受体分析法的研究进展，畜牧兽医学报,2014,45:354-362，张静.基于青霉素结合蛋白pbp3的β-内酰胺类药物残留检测及蛋白结构的初步研究[d].中国农业大学,2015.ahmeds,ningj,etal.receptor-basedscreeningassaysforthedetectionofantibioticsresidues-areview.talanta,2017,166:176-186；cheny,etal.agoldimmunochromatographicassayfortherapidandsimultaneousdetectionoffifteenbeta-lactams.nanoscale,2015,7:16381-16388；ferriniam,etal.detectionandidentificationofbeta-lactamresiduesinmilkusingahybridbiosensor.journalofagricultural&foodchemistry,2008,56:784-788；gaudin,v,etal.validationofacommercialreceptorkitsulfasensor(r)honeyforthescreeningofsulfonamidesinhoneyaccordingtocommissiondecision2002/657/ec.foodadditivesandcontaminantsparta-chemistryanalysiscontrolexposure&riskassessment,2012,29:942-950；gaudinv,etal.screeningofpenicillinresiduesinmilkbyasurfaceplasmonresonance-basedbiosensorassay:comparisonofchemicalandenzymaticsamplepre-treatment.analyticachimicaacta,2001,436:191-198；liangx,etal.aproof-of-conceptreceptor-basedassayforsulfonamides.analyticalbiochemistry,2013,438:110-116；moellern,etal.anewstrategyfortheanalysisoftetracyclineresiduesinfoodstuffsbyasurfaceplasmonresonancebiosensor.europeanfoodresearch&technology,2007,224:285-292；pazzolam,etal.evaluationoftherapidassaybetastarcombo3.0forthedetectionofpenicillin,amoxicillin,cefazolinandoxytetracyclineinindividualsheepmilk.smallruminantresearch,2015,124:127-131pengj,etal.developmentofadirectelisabasedoncarboxy-terminalofpenicillin-bindingproteinblarforthedetectionofbeta-lactamantibioticsinfoods.analyticalandbioanalyticalchemistry,2013,405:8925-8933；zengk,etal.developmentofarapidmulti-residueassayfordetectingβ-lactamsusingpenicillinbindingprotein2x.biomedical&environmentalsciencesbes,2013,26:100-109。序列表<110>华中农业大学<120>利用突变蛋白检测β-内酰胺类类抗生素残留的方法<141>2018-03-24<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>765<212>dna<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<220><221>gene<222>(1)..(765)<220><221>mutation<222>(563)..(564)<220><221>mutation<222>(70)..(70)<220><221>mutation<222>(55)..(55)<220><221>cds<222>(1)..(765)<400>1atgcaaagagatacgcactttttatctggtgcaaatgtagaatacgaa48metglnargaspthrhispheleuserglyalaasnvalglutyrglu151015gatgactgcaccttttttgattgcttctcaggaggttttgtcctgttt96aspaspcysthrphepheaspcyspheserglyglyphevalleuphe202530gattctaacaggaaaaagtatacaatatacaataggaaagaaagcacc144aspserasnarglyslystyrthriletyrasnarglysgluserthr354045gccagattcgcacctgcttctacatacaaggtgttcagcgcattgctc192alaargphealaproalaserthrtyrlysvalpheseralaleuleu505560gcactggaatccgggatcatcacgaagaacaattctcaaatgacgtgg240alaleugluserglyileilethrlysasnasnserglnmetthrtrp65707580gacggaactcaatatccgtataaagaatggaatcaagaccaggattta288aspglythrglntyrprotyrlysglutrpasnglnaspglnaspleu859095ttctctgcgatgagcagctccgcaacatggtattttcaaaaactggac336pheseralametserserseralathrtrptyrpheglnlysleuasp100105110cggcaaattggagaggatcatttgcgtcgctatctcaaatctatccat384argglnileglygluasphisleuargargtyrleulysserilehis115120125tatggaaatgaggatttctcaggtccggcgaattattggctggatggc432tyrglyasngluasppheserglyproalaasntyrtrpleuaspgly130135140tctcttcaaatttcccctcttgaacaggttaatatgttaaaaaagttt480serleuglnileserproleugluglnvalasnmetleulyslysphe145150155160tatgataacgaatttgattttaaacagtctaatattcaaactgtgaaa528tyraspasnglupheaspphelysglnserasnileglnthrvallys165170175gattcgatacgtttagaagaatcaaatggcagaaaactatccggtaaa576aspserileargleuglugluserasnglyarglysleuserglylys180185190accgggacttcagttatcaacggagaacttcatgccggctggtttgtc624thrglythrservalileasnglygluleuhisalaglytrppheval195200205ggatatgtagaaactgccgaaaatacttttttctttgctgttcatatt672glytyrvalgluthralagluasnthrphephephealavalhisile210215220caaggtgaaaaacgggctgccggaagcactgctgccgagattgcactt720glnglyglulysargalaalaglyserthralaalagluilealaleu225230235240tccatcttggataaaaaagggatttatccatccgcttcccgataa765serileleuasplyslysglyiletyrproseralaserarg245250<210>2<211>254<212>prt<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<400>2metglnargaspthrhispheleuserglyalaasnvalglutyrglu151015aspaspcysthrphepheaspcyspheserglyglyphevalleuphe202530aspserasnarglyslystyrthriletyrasnarglysgluserthr354045alaargphealaproalaserthrtyrlysvalpheseralaleuleu505560alaleugluserglyileilethrlysasnasnserglnmetthrtrp65707580aspglythrglntyrprotyrlysglutrpasnglnaspglnaspleu859095pheseralametserserseralathrtrptyrpheglnlysleuasp100105110argglnileglygluasphisleuargargtyrleulysserilehis115120125tyrglyasngluasppheserglyproalaasntyrtrpleuaspgly130135140serleuglnileserproleugluglnvalasnmetleulyslysphe145150155160tyraspasnglupheaspphelysglnserasnileglnthrvallys165170175aspserileargleuglugluserasnglyarglysleuserglylys180185190thrglythrservalileasnglygluleuhisalaglytrppheval195200205glytyrvalgluthralagluasnthrphephephealavalhisile210215220glnglyglulysargalaalaglyserthralaalagluilealaleu225230235240serileleuasplyslysglyiletyrproseralaserarg245250<210>3<211>25<212>dna<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<220><221>primer_bind<222>(1)..(25)<400>3gatgactgcaccttttttgatggct25<210>4<211>25<212>dna<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<220><221>primer_bind<222>(1)..(25)<400>4ggtgcagtcatcttcgtattctaca25<210>5<211>25<212>dna<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<220><221>primer_bind<222>(1)..(25)<400>5tttgattgcttctcaggaggttttg25<210>6<211>25<212>dna<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<220><221>primer_bind<222>(1)..(25)<400>6agaagcaatcaaaaaaggtgcagtc25<210>7<211>42<212>dna<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<220><221>primer_bind<222>(1)..(42)<400>7gtcccggttttaccggatagttttctgccatttgattcttct42<210>8<211>42<212>dna<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<220><221>primer_bind<222>(1)..(42)<400>8agaagaatcaaatggcagaaaactatccggtaaaaccgggac42当前第1页12当前第1页12