本发明属于生物材料技术领域，更具体地，涉及一种低免疫原性生物敷料及其制备方法。
背景技术：
在对严重的深度烧伤、皮肤缺损的治疗中，需要创面敷料来促进创面快速愈合。创面生物敷料作为一种新兴的创面敷料，市场势头十足，主要分为动物皮敷料(如自体皮、同种异体皮、异种皮等)和非动物皮敷料(如胶原、壳聚糖、蜂蜜生物敷料等)。自体皮在疗效上是最好的，但皮源极为有限。同种异体皮的渗透性和粘附性与烧伤病人的皮肤相似,能有效降低抗原性,减少排斥反应。但主要来源于尸体皮,尸体皮来源极为有限,价格高昂，保存条件要求极高，其应用也存在宗教和伦理方面的问题。异种皮敷料相对于同种自体皮和同种异体皮而言,来源相对比较广泛,价格低廉。
目前，猪皮作为临时的皮肤替代品在临床烧伤或者皮肤损伤的治疗中发挥作用。但是，猪皮自身存在的免疫原性，使得其在短时间内(约一周)被排斥，病人在治疗过程中需多次换药，切削痂，植皮，增加了患者痛苦，且又在供皮区易留下瘢痕或色素沉着。
因而，如何降低猪皮的免疫原性，继而减少免疫排斥反应，实现治疗途中少换药，免去病人换药、削痂之苦，减少并发症，具有十分重要的意义。
技术实现要素：
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种降低免疫原性sgrna、低免疫源性敷料及其制备方法，其目的在于通过采集降低免疫源性基因的表达或者沉默免疫源性基因猪皮作为敷料，由此解决现有猪皮敷料免疫源性高，需多次换药切削痂、植皮的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种降低免疫原性sgrna，其特征在于，其与猪ggta1基因序列结合，并且具备以下特征：
(1)其长度在18nt至22nt之间；
(2)其在ggta1基因上的靶序列的3’末端含gg,gc含量在40％-60％；
(3)其与靶向结合位点基因组序列内不存在snps；
(4)其与猪ggta1基因进行全基因脱靶效应分析，脱靶位点最大允许5个碱基错配。
优选地，所述降低免疫原性sgrna，其为以下序列中的任意一条：
gctgcttgtctcaactgtaatgg；
cccagaaggttctttgttctgg；
aaggctccagtggtatgggaagg。
优选地，所述降低免疫原性sgrna，其为以下序：aaggctccagtggtatgggaagg。
按照本发明的另一个方面，提供了一种低免疫原性敷料，所述敷料为猪皮，所述猪皮来源于ggta1基因敲除猪。
优选地，所述低免疫原性敷料，其ggta1基因敲除猪，其具有本发明提供的sgrna。
按照本发明的另一个方面，提供了所述低免疫原性敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)转染载体的制备：将如权利要求1至3任意一项所述的sgrna靶序列的正义链模板的5’端添加rna序列tagg，反义链模板的5’端添加caaa，合成寡聚核苷酸链单链经退火形成的双链，将线性化的转染载体crispr/cas骨架质粒和体外转录crispr/cas骨架质粒分别与所述双链连接，获得转染载体质粒和体外转录载体；
(2)转染成体成纤维细胞：将步骤(1)中获得的转染载体电穿孔转染猪成体成纤维细胞，单细胞克隆的培养经鉴定确定ggta1基因的敲除的猪成体成纤维细胞；
(3)克隆胚胎的制备：将步骤(2)中获得的ggta1基因的敲除的猪成体成纤维细胞的细胞核注入去核卵母细胞，并胞浆注射步骤(1)获得的体外转录载体和cas9的mrna，得到克隆胚胎；
(4)ggta1基因敲除猪制备：将步骤(3)中获得的克隆胚胎植入母猪子宫，培育获得ggta1基因敲除猪；
(5)取皮制备敷料：将步骤(4)中获得的ggta1基因敲除猪取头层中厚皮，冲洗之后依次进行疏水处理、蛋白酶解处理、封闭抗原处理、冻干处理，得到所述低免疫原性敷料。
优选地，所述低免疫原性敷料的制备方法，其步骤(1)所述转染载体crispr/cas骨架质粒为u6-crispr/cas骨架质粒；所述体外转录crispr/cas骨架质粒为t7-crispr/cas骨架质粒。
优选地，所述低免疫原性敷料的制备方法，其步骤(3)所述胞浆注射体外转录载体和cas9的mrna，其注射液中体外转录载体和cas9的mrna的质量之比在1:9～1:3之间。
优选地，所述低免疫原性敷料的制备方法，其所述中厚皮厚度在0.4mm～0.5mm之间。
优选地，所述低免疫原性敷料的制备方法，其所述疏水处理为采用浓度为5～10％(m/v)聚乙二醇溶液浸泡50～60min；
所述蛋白酶解处理为采用浓度为0.3～0.4％的胰蛋白酶溶液生理盐水溶液浸泡70～100min；
所述封闭抗原处理为采用浓度为1～2％的十二烷基硫酸钠溶液持续震荡12～20h后，最后再用戊二醛交联，封闭残余抗原。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
采用crispir/cas9基因敲除和脱细胞真皮基质，可双重降低猪皮的免疫原性，制得的猪皮的免疫原性极低，甚至无免疫原性，可作为人体皮肤替代物，降低了并发症的风险。
附图说明
图1是本发明实施例流程示意图；
图2是本发明实施例中体外酶切活性检测过程中酶切dna的构建图；
图3是本发明实施例中体外酶切活性检测过程中酶切条带的灰度图；
图4是本发明实施例中使用的crispr/cas9系统载体构建示意图；
图5是本发明实施例中细胞转染效率效果图；
图6是本发明实施例中克隆胚体外验证crisrp/cas9切割效果图；
图7是本发明实施例中显微注射得到的ggta1基因敲除猪；
图8是本发明实施例中ggta1基因敲除猪的各组织中ggta1基因敲除效果的鉴定；
图9是本发明实施例中猪皮、原生型猪皮和市场脱细胞猪皮的α-1,3gal含量检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
猪皮与人类亲缘性十分接近,且质地柔软,与人体皮肤结构也类似。猪皮作为敷料应用,具有良好的弹性、创面粘性及透水性,移植后易于成活,不会阻碍自体微粒皮的生长,能快速封闭创面。
α-半乳糖苷转化酶1(alpha-galactosyltransferase1,ggta1)基因编码的α1，3-半乳糖基转移酶(α-1，3gt)可以催化udp-半乳糖分子(udp-gal)的半乳糖残基转移至半乳糖的受体n-乙酰半乳糖胺分子(galnac)上，形成α-1，3半乳糖苷(α-1，3gal)。猪的细胞表面表达这种糖类化合物α-1，3gal。人类细胞由于缺乏有功能的ggta1基因，不能合成α-1，3gal化合物，实验证实，而人体在体内细菌的刺激下会产生大量针对α-1，3gal的抗体。当把猪皮与病人皮肤损伤面的体液接触后，人类抗原与主细胞表面的异种抗原结合，激活补体，产生免疫排斥反应。因此，ggta1基因的敲减能够沉默或降低甚至消除猪血管内皮细胞α-1，3gal的表达，从而减少猪的免疫原性。
规律性重复短回文序列簇(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,crisprs)是一类广泛存在于原核生物基因组中，是原核生物的一种获得性免疫系统。crispr/cas9是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的dna序列，进行特定位点的切割造成双链dna断裂，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端链接，造成移码突变，导致基因敲除。该系统中包含cas9核酸酶，tracrrna和crrna。tracrrna和crrna结合形成一条rna链，简称sgrna(singleguiderna)。sgrna识别特异dna序列，cas9蛋白的ruvc和hnh负责目标位置的切割。这一技术不仅能快速、简便、高效地靶向基因组的基因，且操作简单，可高通量制备，成本低，因而备受关注。
然而采用crisprs系统进行基因沉默，高脱靶率可能使之在与靶序列相似的位点发生非特异性切割，破坏基因组结构，导致基因敲除或沉默效果不佳，也可能导致个体无法存活。由于基因的靶向精确度高度依赖于sgrna靶序列，设计并制备出精准靶向的sgrna成为敲除目的基因的关键技术和难点因此需要设计和实验论证sgrna的沉默效果和安全性，否则无法制备ggta1基因被有效沉默同时，保证个体存活和发育。
本发明提供的降低免疫原性sgrna，其特征在于，其与猪ggta1基因序列结合，并且具备以下特征：
(1)其长度在18nt至22nt之间；
(2)其在ggta1基因上的靶序列3’末端含gg,gc含量在40％-60％；
(3)其与靶向结合位点基因组序列内不存在snps；
(4)其与猪ggta1基因进行全基因脱靶效应分析，脱靶位点最大允许5个碱基错配。
优选为以下序列中的任意一条：
gctgcttgtctcaactgtaatgg；
cccagaaggttctttgttctgg；
aaggctccagtggtatgggaagg。
更优选其为以下序列：aaggctccagtggtatgggaagg。
本发明提供的低免疫原性敷料，其特征在于，所述敷料为猪皮，所述猪皮来源于ggta1基因敲除猪。
所述ggta1基因敲除猪，优选具有本发明提供的sgrna。
本发明提供的低免疫原性敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)转染载体的制备：将本发明提供的sgrna靶序列的正义链模板的5’端添加rna序列tagg，反义链模板的5’端添加caaa，与载体质粒黏性末端互补，合成寡聚核苷酸链单链经退火形成的双链；。用限制性内切酶bbsⅰ酶切crispr/cas骨架质粒，将酶切后的质粒纯化；将线性化的质粒与sgrna寡核苷酸双链连接，转化、测序、抽提无内毒素质粒用于细胞转染。将线性化的转染载体crispr/cas骨架质粒和体外转录crispr/cas骨架质粒分别与所述双链连接，获得转染载体质粒和体外转录载体；所述转染载体crispr/cas骨架质粒为u6-crispr/cas骨架质粒；所述体外转录crispr/cas骨架质粒为t7-crispr/cas骨架质粒。
(2)转染成体成纤维细胞：将步骤(1)中获得的转染载体电穿孔转染猪成体成纤维细胞，单细胞克隆的培养经鉴定确定ggta1基因的敲除的猪成体成纤维细胞；将所述成纤为细胞提取基因组dna，pcr扩增ggta1包含靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶切，确定ggta1基因的敲除情况，富集ggta1敲除细胞，进行单细胞克隆的培养以及鉴定：pcr扩增出包含1个靶序列的基因片段，保证靶序列不处于扩增片段的中间位置，回收纯化产物后，用t1ne1核酸内切酶进行酶切反应。如果靶位点处存在突变，则会被t1ne1切成两条带，反之则切不开。
(3)克隆胚胎的制备：将步骤(2)中获得的ggta1基因的敲除的猪成体成纤维细胞的细胞核注入去核卵母细胞，并胞浆注射步骤(1)获得的体外转录载体和cas9的mrna，得到克隆胚胎；所述胞浆注射体外转录载体和cas9的mrna，其注射液中体外转录载体和cas9的mrna的质量之比在1:9～1:3之间。具体地：
从屠宰场收集合格的猪卵巢中挑选出带有第一极体的成熟卵母细胞，去核，将合适的体细胞注入去核卵母细胞。将所述体外转录载体和cas9的mrna混合后，注射克隆胚胎。体外转录载体、t7-cas9的mrna混合液，其终浓度质量之比在1:9～1:3之间。
(4)ggta1基因敲除猪制备：将步骤(3)中获得的克隆胚胎植入发情手提母猪子宫，培育获得ggta1基因敲除猪；
(5)取皮制备敷料：在37℃、110～150转/分钟的恒温摇床中进行如下操作：将步骤(4)中获得的ggta1基因敲除猪取头层中厚皮，冲洗之后依次进行疏水处理、蛋白酶解处理、封闭抗原处理、冻干处理，得到所述低免疫原性敷料。所述中厚皮厚度在0.4mm～0.5mm之间。
具体地：
从ggta1基因敲除猪上取头层中厚皮，置入含抗生素的磷酸盐缓冲液中漂洗数次，置入聚乙二醇中，增强分子间的疏水作用后，用含抗生素的磷酸盐缓冲液对其充分浸泡和洗涤，放入含胰蛋白酶的生理盐水内浸泡，经过十二烷基硫酸钠(sds)持续震荡后最后再用戊二醛交联，封闭残余抗原。用灭菌水充分冲洗，冷冻干燥后4℃下保存。
所述疏水处理为采用浓度为5～10％(m/v)聚乙二醇溶液浸泡50～60min；所述聚乙二醇是mw＝400,600,800,2000,4000中的任意一种。
所述蛋白酶解处理为采用浓度为0.3～0.4％的胰蛋白酶溶液生理盐水溶液浸泡70～100min；
所述封闭抗原处理为采用浓度为1～2％的十二烷基硫酸钠溶液持续震荡12～20h后，最后再用戊二醛交联，封闭残余抗原。
以下为实施例：
实施例一、ggta1基因sgrna的设计、筛选和crispr/cas9系统载体的制备
1、sgrna的设计
针对ggta1基因，sgrna设计的原则如下：
(1)长度20nt左右；
(2)3’末端含gg的sgrna，gc含量在40％-60％；
(3)sgrna靶向结合位点基因组序列内不存在snps；
(4)全基因脱靶效应分析，脱靶位点最大允许5个碱基错配。
基于以上设计原则，设计出表1所示的靶序列集合。
表1设计的sgrna的序列(灰色标记为pam序列)
2、sgrna的筛选及体外转录载体的制备
根据以上原则筛选出6条合适的sgrna，进一步通过体外酶切活性检测grna靶点效率，筛选sgrna，具体步骤如下:
(1)体外转录载体sgrna
合成引物t7-grna-fpg，详见表2，其中nnnnnnnnnnnnnn是grna靶点(不带pam序列)。使用t7-grna-fpg和grna-rp引物对，标准sgrna1(g1)引物g1-fp或者标准sgrna2(g2)引物g2-fp和grna-rp引物对，以标准sgrna片段为模板做pcr，pcr产物120bp左右，过全式金柱ep101-01)纯化，使用depch2o洗脱dna后测浓度，作为后续体外转录的dna模板。
表2体外转录sgrna的合成引物对
反应体系(50μl)如下：
sgrna质粒：10ng
t7-grna-fpg(10μm)：1.5μl
grna-rp(10μm)：1.5μl
2×pfumix：25μl
depch2o：加至50μl
将上述反应体系放入pcr仪中，并按以下程序进行反应：
(2)酶切dna的准备
将sgrna靶点(包括pam序列)可通过搭桥pcr的方式构建到pcr产物中，如图2所示。其中所用序列如下：
nnnnnnnnn(270bp)mmmmmmmmmmm(grna靶位点位置，含有pam序列)nnnnnnnnnnn(450bp)
酶切之前片段大小为740bp，酶切之后目的条带大小应分别为：280bp+460bp左右。
(3)cas9/sgrna体外酶切反应
表3cas9/sgrna体外酶切反应的反应体系
按照表3反应体系次序加样，充分混合后，37℃反应0.5h，65℃煮5min。用琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。每次酶切反应，都同时做标准靶点的sgrna酶切反应，将其作为阳性参照进行活性比对。酶切条带的灰度图如图3，换算为sgrna的活性结果如表4。一般地，样品sgrna的酶切效率<标准sgrna1(g1)，表明样品sgrna靶点活性比较差，不建议使用；若40％-50％≥样品sgrna的酶切效率≥标准sgrna1(g1)，表明样品sgrna靶点活性合格；样品sgrna的酶切效率≥40％-50％，表明样品sgrna靶点活性良好，建议使用；若样品sgrna的酶切效率≥标准sgrna2(g2)，表明样品sgrna靶点活性非常高，建议使用。由此可知，酶切活性良好并可使用的sgrna有sgrna-1、sgrna-2、sgrna-5。
表4体外酶切活性检测grna的靶点效率
3、crispr/cas9系统转染载体的制备
如图4所示，cas9grna表达载体是以购买的px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9载体为骨架，按照固定的oligo设计模式插入所需的引导序列。具体步骤如下：
(1)合成寡聚核苷酸链双链：分别在sgrna-5正义链模板的5’端添加cacc反义链模板的5’端添加caaa，与载体质粒黏性末端互补。合成的寡聚核苷酸链单链经退火形成双链。
(2)用限制性内切酶bbsⅰ酶切px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9骨架质粒。按照以下酶切体系进行配置：
10×nebbuffer4：5ul
100×bsa：0.5ul
bsaⅰ：2ul
pdr274环状质粒：25ul
ddh2o水：加至50ul
将酶切体系置于37℃下反应2-3h,在65℃下失活20min。
(3)质粒dna酶切纯化：将酶切后的质粒利用highpurepcrproductpurificationkit纯化。
(4)将线性化的质粒与sgrna-5寡核苷酸双链连接，连接体系如下：10×buffer：2ul
t4连接酶：0.5ul
sgrna-5寡核苷酸双链：1ul
线性化质粒：20ng
ddh2o：加至20ul
在22℃恒温培养箱内连接过夜，65℃失活20min。
(5)质粒转化、测序、抽提无内毒素质粒进行细胞转染。
实施例二、转染成体纤维细胞
1、细胞转染和筛选
将u6-grna-3质粒电穿孔转染猪成体成纤维细胞。按以下具体步骤进行：
①显微镜下观察细胞生长状况，挑选长势良好、汇合度达80％左右的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化2-3min，1500g离心5min，倒掉上层液；
②500uldpbs缓冲液悬浮细胞沉淀，1500g离心5min，彻底清洗掉细胞中残余的胰蛋白酶；
③加入一定体积电转缓冲液悬浮上述细胞，按每组电转体系为50ul将电转液均分到各组离心管内，并向其中加入一定质量的对应电转质粒，移液枪混匀细胞悬液；
④打开ecm2001electorcellmanipulator电转仪，设置电转所需电压(130v-170v)、电击时间(3ms)、电击次数(1次)；
⑤10ul移液枪分批吸取50ul电转悬液到电转杯的电击槽内，将电转杯放入电转仪器槽，旋紧螺丝使电转杯与槽内电极金属面充分接触，按automaticstart开始电击；
⑥指示灯停止闪烁时电击完毕，旋转螺丝拿出电转杯，10ul移液枪吸取电转液到对应培养皿内，向培养皿中加入一定体积培养基。依次完成各组电穿孔转染；
⑦电转完成，各组细胞放入39℃、5％co2饱和湿度培养箱内培养，24h后，待细胞贴壁，用dpbs洗去电转死亡的细胞，添加新培养基；36h后，荧光倒置显微镜下观察细胞生长状况，粗略估计绿色荧光占总细胞数的比例，计算转染效率并拍照。
sgrna表达质粒稳定转染到细胞基因组dna后，质粒中的egfp基因也会随着基因组的表达而表达，在400倍(或200倍)荧光镜下可统计发出荧光的细胞百分比。如图5所示，与对照组转染的egfp-n1质粒荧光量相比，实验组sgrna质粒转染效率高达80％左右。
转染36h后，提取基因组dna，以其为模板扩增ggta1包含靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶切，确定ggta1基因的敲除情况。富集ggta1敲除细胞，进行单细胞克隆的培养以及鉴定。
2、单细胞克隆的培养以及鉴定
转染成功的细胞采用有限稀释法挑选其单克隆细胞。具体操作步骤：在荧光显微镜蓝色光源下观察细胞，挑选长有绿色荧光蛋白的细胞，取0.25％胰蛋白酶500ul消化5min；吸掉胰蛋白酶，向消化好的细胞中加入培养基，用移液器反复吹打，使细胞全部悬浮成单细胞；用10ul移液枪吸取1ul悬浮好的细胞到新的培养孔内，荧光倒置显微镜下观察荧光细胞数；将经有限稀释过的细胞继续培养，待荧光细胞长成克隆斑时，用挑克隆斑法和点消化法进行挑选。直到荧光细胞纯度达90％时，消化收集，分两份，一份进行后续鉴定，一份冻存。
实施例三、ggta1基因敲除猪克隆胚胎鉴定
采用tianampgenomicdnakit提取基因组dna，针对每一个靶位点设计一对引物进行pcr扩增，引物序列见表5。pcr反应体系50ul，反应条件如下：94℃7min；(94℃30s，58℃1min，72℃30s)×35；72℃7min；4℃保存。扩增片段大小分别为603bp和504bp，pcr纯化试剂盒纯化pcr产物。取15ulpcr产物于1.5ml离心管内，封口后沸水中煮沸5min变性，然后室温复性30min。t7ne1酶切体系15ul：pcr产物，12.5ul；
10×neb2，1.5ul；t7ne1酶，1ul。37℃水浴酶切30min后，取1ul进行2％凝胶电泳。实验中待测样品取双份，均进行变性退火，实验组样品进行酶切，阴性对照组样品不酶切。二者均置于37℃水浴30min。
表5引物序列
用pcr扩增靶点附近基因序列，然后通过ta克隆、测序来进一步验证突变存在以及突变情况。将t7-grna-m和t7-cas9的mrna混合物注射入克隆胚胎中。克隆胚体外验证crisrp/cas9切割效果如图6所示。
将t7-grna-m和t7-cas9的mrna混合后(sgrna终浓度为30ng/μl，cas9mrna终浓度为180ng/μl)注射到1500个克隆胚胎，用胚胎培养液洗涤5遍后，转入预平衡好的胚胎培养液，置于39℃、饱和湿度、低氧(5％o2+5％co2+90％n2)的条件下培养过夜。
实施例四ggta1基因敲除猪制备与鉴定
次日早上采用输卵管移植法将发育到二代细胞的胚胎移植入到四头发情受体母猪子宫。常规手术缝合，术后连续4h注射抗生素消炎，每天记录受体母猪的生理情况。移植后30及60d左右进行2次b超检测，确定受体猪怀孕状况。最后得到5头克隆猪(如图7所示)。对其分别采集肝脏、心脏和耳皮组织样本，抽提各组织中的rna，采用rt-pcr分析ggta1基因的表达变化，初步测定结果如图8所示。结果显示：肝脏、心脏和耳皮组织中ggta1的表达量都有显著降低。
实施例四、脱细胞真皮基质的ggta1敲除猪猪皮的制备
新鲜猪皮取自6个月大的ggta1基因敲除猪，除去皮下组织，进行脱脂、二次脱脂、浸灰、脱灰、浸硝、剖层等预处理过程。用剖层机剖取0.45mm厚的头层中厚皮，置入含抗生素的磷酸盐缓冲液中漂洗数次，再放入8％聚乙二醇(mw＝800)溶液中，在37℃、150转/分钟的恒温摇床中浸泡60min,再用含抗生素的磷酸盐缓冲液对其充分浸泡和洗涤；随后放在0.35％的胰蛋白酶溶液(采用生理盐水按重量体积比配置)中，在37℃、150转/分钟的恒温摇床中浸泡处理1.5h，用含抗生素的磷酸盐缓冲液对其充分浸泡和洗涤，再置入含1.2％的sds的水溶液中，在37℃、150转/分钟的恒温摇床中浸泡30h，用含抗生素的磷酸盐缓冲液对其充分洗涤；然后将其浸泡于新鲜配制的0.32％(v/v)的戊二醛溶液中交联12min，用灭菌水充分冲洗，冷冻干燥即可得低免疫原性的猪皮，在4℃下可保存1～2年。
实施例五、免疫原性鉴定及比较
将实施例四中ggta1敲除猪(ggta1-/+型)所得的猪皮，分别与同批正常猪(原生型)、市场脱细胞猪皮的α-1,3gal蛋白含量进行比较。采用蛋白质印迹法进行检测，具体方法如下：
将消毒好的研钵取出，称取100mg猪皮，放入研钵内，加入液氮，研磨片刻后加入150微升ripa蛋白裂解液[50mmol/ltris-cl(ph＝8.0)，150mmol/lnacl，1％np-40，1％去氧胆酸钠，1mmol/ledta，0.1％sds，0.2mmol/lpmsf，1μg/ml蛋白酶抑制剂]，继续研磨，使猪皮充分裂解；再将裂解液移入1.5ml的ep管中，冰冰上静置5min；4℃，12000rpm离心15min，小心吸取上清液至另一新的ep管中；采用bca法进行蛋白定量，蛋白样品与5x上样缓冲液按4：1比例混合，沸水加热10min，高速离心5min，用10％sds-page凝胶电泳分离蛋白，电泳结束后，取下凝胶，切除多余的分离胶及浓缩胶；按负极、海绵、三层虑纸、凝胶、pvdf膜、三层虑纸、海绵、正极的顺序放置，并排气泡；恒压100v电转1h，断开电源，将凝胶转移至盛有合适的考马斯亮蓝的容器中染色；转膜后的pvdf做标记，放入1×tbst配制5％的脱脂奶粉封闭1h；弃封闭液，用1×tbst洗膜三次，1：1000稀释一抗，室温孵育2h，1×tbst洗4次，每次10min；室温孵育山羊抗兔带hrp标记的igg(1×tbst稀释比例1：10000)，洗膜5次，每次10min；根据说明书增强发光液在化学发光成像系统发光显色。
检测结果如图9，ggta1-/+型猪皮的α-1,3gal蛋白含量低于原生型猪皮的α-1,3gal蛋白含量(约68％)和市场脱细胞猪皮(约41％)。这说明与原生型和市场脱细胞猪皮相比，本实施例中的ggta1-/+型猪皮具有较低的α-1,3gal蛋白含量，免疫原性较低，在人体皮肤应用中，可有效减少免疫排斥反应的发生。
经动物实验和临床证明，所制备的脱细胞真皮基质ggta1敲除猪猪皮，抗原性极低，保存时间长，且解决了已有人工皮肤产品的价格昂贵，抗原性强、细菌感染率较高、弹性较差等缺点。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。