本发明属于生物科技技术领域，尤其是一种完全利用小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法。
背景技术：
视网膜是光传感器和视觉信息处理器，视网膜一旦受损很容易引起视力损伤。目前，治疗的最有效的方法就是通过细胞移植来取代已受损的视网膜细胞，特别是视网膜色素上皮细胞(rpe)。rpe是位于脉络膜和视网膜神经层之间的一层单层细胞，在维持光感受器细胞和视网膜正常功能上发挥重要作用。rpe细胞降解或受损是产生色素性视网膜炎、老年性黄斑病变、斯特格氏病等疾病的原因。在许多视网膜受损的动物模型中，通过视网膜下腔移植rpe细胞，能有效的恢复光感受器的功能，从而修复视力。但是，供体rpe细胞来源非常有限，而且异体移植存在免疫排斥问题。
2006年，yamanaka等首次实现将四种转录因子通过反转录病毒导入到小鼠皮肤成纤维细胞,进而获得了类似于胚胎干细胞(escs)的多能性干细胞,并命名为“诱导多能性干细胞”(ipscs)。ipscs既具备了escs细胞一样的多能性，同时规避了escs所面临的免疫排斥和伦理学问题，具备了较好的临床应用价值。本发明在此基础上设计了一种采用小分子诱导ipscs分化为rpe的方法，从而为采用细胞移植治疗眼rpe退性型疾病奠定技术基础。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，该方法为治疗眼rpe疾病提供了新的方向，且诱导完全采用小分子，不依赖外源基因的导入，提高了未来用于临床应用的安全性，解决了现有技术中因通过异体视网膜下腔移植rpe细胞所带来的免疫排斥问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：①将获得的克隆团样的hipscs培养获取单散hipscs，②将培养的单散hipscs用去除bfgf的e7培养基进行培养2天后进行分化培养，分化培养过程中加入小分子促进诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞，小分子成分包括dkk-1、noggin、nicotinamide、igf-1、bfgf、activina和su5402，然后手工剔除形态非rpe铺路石样的杂细胞后，传达培养，富集得到hipscs-rpe，③完成免疫荧光检测、逆转录pcr(rt-pcr)检测、蛋白印迹检测、荧光素钠渗漏检测、pos吞噬功能检测、z-stack共聚焦膜极性检测。
进一步的，所述步骤②中，分化培养基的成分包括mem/f12、体积百分比1％的neaa和体积百分比1％的n2，分化培养过程包括rpe早期诱导、rpe中期诱导、rpe后期诱导以及rpe成熟诱导，rpe早期诱导过程中加入10ng/mldkk-1、50ng/mlnoggin、10mmnicotinamide(nic)和10ng/mligf-1，rpe中期诱导过程中加入10ng/mldkk-1、10ng/mlnoggin、5ng/mlbfgf、10mmnicotinamide和10ng/mligf-1，rpe后期诱导过程中加入10ng/mldkk-1、10ng/mligf-1和100ng/mlactivina，rpe成熟诱导过程中加入100ng/mlactivina和10μmsu5402。
进一步的，所述步骤②中富集得到hipscs-rpe后，用成熟rpe培养基进行培养，成熟rpe培养基主要含有：dmem/hg、体积百分比1％fbs、100ng/mlactivina、sodiumpyruvate和glutamax，培养第20天，细胞采用质量体积比0.25％edta胰蛋白酶进行消化传代，并用含有体积百分比10％fbs、100u/mlp/s的dmem/hg培养基进行常规培养。
进一步的，所述步骤①中，将获得的克隆团样的hipscs种植在体积百分比1％matrigel孵育过的6孔板上，37℃二氧化碳培养箱内培养，每天倒置显微镜观察生长状态，每天全量更换新鲜的e8培养基，发现有分化的细胞及时挑走，每间隔6天传代一次，传代比例3:1；传代时使用质量体积比0.25％edta处理3-5min，当克隆边缘部分开始卷起并快脱离培养皿底部时，用去离子的pbs洗1遍，然后用1ml的e8培养基轻轻吹打，吹打次数不超过10次，收集细胞到新的体积百分比1％matrigel孵育过的6孔板上继续培养；在每次传代后的第1天，培养基中添加10μmy-27632，对消化后的细胞吹打次数提高到30-50次，然后细胞悬液用40μm筛网进行过滤，除去细胞团；产生的单散细胞以1×106个/孔的密度种植到体积百分比1％matrigel孵育过的6孔板上，传代第1天培养基中同样添加10μmy-27632，后续采用半量更换新鲜的e8培养基的培养方式进行单散hipscs培养。
采用上述方案，本发明采用小分子诱导分化的有益效果如下：1)分化过程未引入外源基因，完全采用小分子诱导，提高了未来临床应用的安全性；2)小分子诱导过程灵活可控，避免了过度诱导，提高了诱导效率；3)诱导方法可操作性强，重复性好，可稳定诱导出视网膜色素上皮细胞，从而更适用于未来临床应用。
下面结合附图对本发明作进一步描述。
附图说明
附图1为小分子诱导人源可诱导多能性干细胞hipscs分化为人的视网膜色素上皮细胞hrpe，即分化靶细胞hipscs-rpe；(a)为小分子诱导分化流程图；(b)为不同时间点小分子诱导单散hipscs分化为hipscs-rpe并富集的明场图；
附图2为免疫荧光鉴定分化靶细胞hipscs-rpe特异蛋白表达；
附图3为逆转录pcr鉴定靶细胞hipscs-rpe特异性基因表达；
附图4为蛋白印迹鉴定分化靶细胞hipscs-rpe特异蛋白表达；
附图5为鉴定分化靶细胞hipscs-rpe屏障功能；其中，(a)为荧光素钠渗漏检测在0，4，12，24和36小时时间点实验组hipscs-rpe，阳性对照组hrpe和阴性对照组hadscs的荧光渗漏值并比较彼此的活性屏障功能；(b)为上皮细胞电阻模型teer检测实验组hipscs-rpe，阳性对照组hrpe和阴性对照组hadscs的细胞膜电阻，其中，*p<0.05表示差异显著，有统计学意义，#p>0.05表示差异不显著，无统计学意义；
附图6为鉴定分化靶细胞hipscs-rpe吞噬和膜极性功能；(a)为检测带有zo-1表达的hipscs-rpe和hrpe吞噬fitc-pos的功能；(b)为z轴三维共聚焦检测带有zo-1表达的hipscs-rpe和hrpe的极性。
具体实施方式
本发明的具体实施例如图1-6所示是小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其包括如下步骤，
①培养人源可诱导多能性干细胞(hipscs)：将获得的克隆团样的hipscs种植在体积百分比1％matrigel孵育过的6孔板上，37℃二氧化碳培养箱内培养，每天倒置显微镜观察生长状态，每天全量更换新鲜的e8培养基，发现有分化的细胞及时挑走，每间隔6天传代一次，传代比例3:1。为减少对hipscs的损害，传代时使用质量体积比0.25％edta处理3-5min，当克隆边缘部分开始卷起并快脱离培养皿底部时，用去离子的pbs洗1遍，然后用1ml的e8培养基轻轻吹打(不能超过10次)，收集细胞到新的体积百分比1％matrigel孵育过的6孔板上继续培养。在每次传代后的第1天，培养基中需要添加10μmy-27632。为了获取单散hipscs,消化后的细胞吹打次数提高到30-50次，然后细胞悬液用40μm筛网进行过滤，除去细胞团。产生的单散细胞以1×106个/孔的密度种植到体积百分比1％matrigel孵育过的6孔板上，传代第1天培养基中同样添加10μmy-27632。后续采用半量更换新鲜的e8培养基的培养方式进行单散hipscs培养。具体分化流程见图1a。
②诱导人源可诱导多能性干细胞(hipscs)分化为人的视网膜色素上皮细胞(hrpe)：当培养的单散hipscs达到融合时，定义此时间点为第-2天，此时细胞培养基换成去除bfgf的e7培养基进行培养，预处理2天，定义此时时间点为第0天。然后将培养基换成分化培养基proneuralmedium：dmem/f12、体积百分比1％的neaa和体积百分比1％的n2。从第0至2天，在分化培养基中加入10ng/mldkk-1、50ng/mlnoggin、10mmnicotinamide(nic)和10ng/mligf-1进行rpe早期诱导。从第2至4天，在分化培养基中加入10ng/mldkk-1、10ng/mlnoggin、5ng/mlbfgf、10mmnicotinamide和10ng/mligf-1进行rpe中期诱导。从第4至6天，在分化培养基中加入10ng/mldkk-1、10ng/mligf-1和100ng/mlactivina进行rpe后期诱导。从第6至14天，在分化培养基中加入100ng/mlactivina和10μmsu5402进行rpe成熟诱导。然后通过反向手工富集的方式，去除形态非rpe铺路石样的杂细胞，并用质量体积比0.25％edta进行37℃二氧化碳培养箱消化处理10分钟传代。传代后培养的6孔板预先孵育体积百分比1％matrigel，富集的hipscs-rpe采用成熟rpe培养基进行培养，成熟rpe培养基主要含有：dmem/hg、体积百分比1％fbs、100ng/mlactivina、sodiumpyruvate和glutamax。培养第20天，细胞采用质量体积比0.25％edta胰蛋白酶进行消化传代，并用含有体积百分比10％fbs、100u/mlp/s的dmem/hg培养基进行常规培养。
结果：克隆团样的hipscs在e8培养基中培养状态良好，培养6天可达到传代密度。然后将其消化后制成单散hipscs接种到孵育过1％matrigel的6孔板上，采用半定量换液的方式进行培养，培养6天可以达到100％融合。单散hipscs进行预处理后2天，部分细胞呈现凋亡状态。诱导分化8天后，细胞形态发生变化，核质比较一般培养的hipscs低，细胞颜色也开始变黑加深。诱导分化第14天，较多的细胞开始凋亡漂浮，洗涤后下面出现单层铺路石样的类似rpe细胞。然后，通过反向剔除杂细胞手工富集hipscs-rpe，按照1×105个/毫升传代培养，并定义为p1代，培养20天后细胞可达到100％融合(图1b)。
③免疫荧光检测
培养各组细胞达到融合后，吸弃上清，pbs洗1遍，分别加入体积百分比4％多聚甲醛室温下孵育15分钟，然后pbs洗3遍，每次5分钟，再加入含有质量体积比0.1％triton-x100和质量体积比3％的牛血清白蛋白(bsa)的pbs室温进行膜通透化处理1小时。然后不洗涤直接加入一抗：鼠单克隆cralbp抗体(该抗体与稀释液按1:350稀释)，鼠单克隆emmprin抗体(该抗体与稀释液按1:100稀释)，兔多克隆mitf抗体(该抗体与稀释液按1:1000稀释)，鼠单克隆otx2抗体(该抗体与稀释液按1:500稀释)，兔多克隆tyrosinase抗体(该抗体与稀释液按1:100稀释)，鼠单克隆rpe-65抗体(该抗体与稀释液按1:1000稀释)和鼠单克隆zo-1抗体(该抗体与稀释液按1:500稀释)，4℃孵育过夜。然后pbs洗3遍，每次5分钟，接着加入二抗：cy3标记羊抗兔igg抗体(该抗体与稀释液按1:100稀释)，cy3标记羊抗鼠igg抗体(该抗体与稀释液按1:100稀释)和fitc标记羊抗鼠igg抗体(该抗体与稀释液按1:100稀释)室温孵育2小时。之后pbs洗3遍，每次5分钟，接着加入dapi染色液室温避光孵育15分钟。最后pbs洗3遍，每次5分钟，直接倒置荧光显微镜下观察拍照。
对分化后产生的靶细胞ipscs-rpe进行免疫荧光鉴定，结果显示，富集后传代培养的hipscs-rpe能阳性的表达rpe特异性标志蛋白：cralbp,mitf,tyrosinase,otx2,emmprin和rpe-65(图2)。
④逆转录pcr(rt-pcr)检测
利用trizol(英潍捷基，美国)提取各组细胞总的rna，并测定od，保证提取各组的rnaod260/od280值在1.8和2.1之间，以保证其纯度。然后总rna利用逆转录试剂盒(东洋纺，日本)进行反转录成cdna，反应体系和反应程序参照产品说明书。产物cdna用来做rt-pcr，引物序列见表1所示。反应体系参考sybr试剂盒(宝日，日本)说明书。瞬离后上机，94℃预变性2分钟,反应35个循环(94℃，30秒；59℃，30秒；72℃，30秒)。反应产物吸取6μl加上2μl的6×loadingbuffer混匀后进行质量体积分数2％的琼脂糖凝胶电泳并拍照。
表1.引物序列
rt-pcr结果也显示，分化的hipscs-rpe能阳性表达rpe特异性标志基因:rpe-65,emmprin,otx2和cralbp(这些标志基因在阳性对照组hrpe细胞中表达呈阳性，在阴性对照组hipscs中表达呈阴性),阴性表达ipscs特异性标志基因：nanog,oct4,sox2,klf4或lin28(这些标志基因在阳性对照组hrpe细胞中表达呈阴性，在阴性对照组hipscs中表达呈阳性)(图3)。
⑤蛋白印迹检测
待细胞培养达到融合后，吸掉上清，pbs洗1遍，放置冰上操作，加入细胞裂解液(ripa)裂解30分钟，收集裂解液，4℃冷冻离心(16000转/分钟,15分钟)收集上清，bca定量试剂盒测定蛋白浓度后，-20℃冰箱保存。跑胶前解冻后与溴酚兰(体积比4:1)混混合，加入β巯基乙醇后煮沸制样。各组分别用微量注射器取50μg蛋白样进行质量体积分数12％十二烷基硫酸钠凝胶电泳，电泳后进行电转(按“滤纸-pvdf膜-胶-滤纸”的顺序叠好，电流恒流180ma，电压120v，湿转2.5小时)，将蛋白样转移到pdvf膜上。然后用质量体积比5％脱脂奶粉对pdvf膜进行4℃封闭处理1小时，接着加入一抗：鼠单克隆cralbp抗体(该抗体与稀释液按1:5000稀释)，鼠单克隆emmprin抗体(该抗体与稀释液按1:3000稀释)，兔多克隆mitf抗体(该抗体与稀释液按1:10000稀释)，鼠单克隆otx2抗体(该抗体与稀释液按1:5000稀释),兔多克隆tyrosinase抗体(该抗体与稀释液按1:5000稀释)，鼠单克隆rpe-65抗体(该抗体与稀释液按1:10000稀释),兔多克隆nanog抗体(该抗体与稀释液按1:5000稀释)，兔多克隆oct4抗体(该抗体与稀释液按1:2000稀释)，兔单克隆sox2抗体(该抗体与稀释液按1:1000稀释)，兔多克隆klf4抗体(该抗体与稀释液按1:3000稀释),兔多克隆gadph抗体(该抗体与稀释液按1:3000稀释)和鼠单克隆β-actin抗体(该抗体与稀释液按1:1000稀释)，4℃孵育过夜。然后tbst洗5遍，每次10分钟，接着加入二抗：hrp标记羊抗兔igg抗体(该抗体与稀释液按1:5000稀释)和hrp标记羊抗鼠igg抗体(该抗体与稀释液按1:5000稀释)室温孵育2小时。之后tbst洗5遍，每次10分钟，加入ecl发光液后在蛋白荧光成像系统下曝光并拍照。
蛋白印迹结果也显示，hipscs-rpe能阳性表达rpe特异性标志蛋白:rpe-65,cralbp,emmrpin,mitf,otx2和tyrosinase(这些标志蛋白在阳性对照组hrpe细胞中表达呈阳性，在阴性对照组hipscs中表达呈阴性),阴性表达hipscs特异性标志蛋白：nanog,oct4,sox2和klf4(这些标志蛋白在阳性对照组hrpe细胞中表达呈阴性，在阴性对照组hipscs中表达呈阳性)(图4)。
⑥荧光素钠渗漏检测
各组靶细胞分别以1×106个/孔的密度接种到0.4μm的inserts上，然后将inserts放入到特制的培养板中，加入培养基后37℃二氧化碳培养箱培养7天直到细胞达到100％融合。然后吸弃上清，加入体积百分比4％多聚甲醛室温下固定15分钟，然后用pbs洗涤2遍。然后每个inserts中分别加入500μl荧光素钠溶液(10μg/ml)在37℃二氧化碳培养箱孵育0,4,12,24或36小时，在不同的时间点收集渗漏到下面培养板中的总的荧光素钠溶液。不同点收集的荧光素钠溶液的总的荧光值通过酶标仪进行检测，激发波长为530nm,发射波长为485nm。其中不同时间点通过未经过体积百分比1％matrigel孵育处理的inserts荧光素钠的总荧光值作为各组的100％对照。各个时间点各组的荧光渗漏值(flt)则是根据他们的渗漏的荧光素钠的荧光值/100％对照。
对于rpe细胞来说能形成紧密连接结构从而具备屏障功能极其重要。形成丰富的紧密结合的单层结构，rpe才能在视网膜与脉络膜之间建立起视网膜外屏障层。荧光素钠渗漏结果显示，在4,12,24和36小时不同时间点，hipscs-rpe和hrpe的flt值无显著性差异(*p<0.05)，但各个时间点的flt值均显著低于对照组人源脂肪干细胞hadscs(#p>0.05)(图5a)。
另外，上皮细胞电阻模型(teer)检测结果显示，达到完全融合状态下的hipscs-rpe的膜电阻值显著高于阴性对照组hadscs(*p<0.05)，接近于阳性对照组hrpe(#p>0.05)(图5b)。这些数据说明，诱导分化产生的靶细胞hipscs-rpe细胞具备正常rpe的屏障功能。
⑦pos吞噬功能检测
从动物屠宰场购买新鲜的猪眼球，按照发表的文献方法进行光感受器外节段(pos)分离和fitc标记(参考文献：8.krohnetu,westenskowpd,kuriharat,etal.generationofretinalpigmentepithelialcellsfromsmallmoleculesandoct4reprogrammedhumaninducedpluripotentstemcells.stemcellstranslmed2012；1(2):96-109.)。hrpe和hipscs-rpe分别以1×106个/孔的密度种植到细胞培养板中，将其转移到37℃二氧化碳培养箱培养7天直到细胞达到100％融合。直接上清中加入一定量的fitc-pos在37℃二氧化碳培养箱孵育处理2小时。然后pbs洗涤细胞3遍，加入体积百分比4％多聚甲醛室温下固定15分钟。接着细胞pbs洗涤3次，分别加入含有质量体积比0.1％tritonx-100pbs溶液进行膜渗透处理15分钟和含质量体积比3％(w/v)bsa的pbs溶液处理1小时。然后加入鼠单克隆zo-1抗体(该抗体与稀释液按1:500稀释)4℃孵育过夜，pbs洗涤3遍，每遍5分钟。然后加入cy3标记的抗鼠二抗(该抗体与稀释液按1:1000稀释)常温下孵育1小时，并pbs洗涤3遍，每遍5分钟。最后倒置荧光显微镜下拍照观察。
对于rpe细胞来说另外一个重要的功能就是吞噬光感受器细胞脱落的外节段。为了检测分化后的hipscs-rpe的吞噬功能，fitc标记的pos被用来进行细胞孵育后示踪。结果显示，经过zo-1免疫染色后，能更直观的看到fitc-pos被hipscs-rpe和rpe吞噬进入细胞质中(图6a)。
⑧z-stack共聚焦膜极性检测
z-stack共聚焦检测被用来观察rpe细胞的膜极性。hrpe和hipscs-rpe分别以1×106个/孔的密度种植到细胞培养板中，将其转移到37℃二氧化碳培养箱培养7天直到细胞达到100％融合。然后细胞进行如上的zo-1免疫荧光处理和dapi染色，并用共聚焦显微镜进行三维拍照观察。
经过zo-1免疫荧光处理后，z-stack共聚焦观察结果显示，hipscs-rpe和hrpe都能显示极性膜结构(图6b)。这些数据说明，诱导分化产生的靶细胞hipscs-rpe细胞具备正常rpe的吞噬和极性功能。
综上，上述实验结果提示，在分化培养的基础上，外加小分子包括：dkk-1,noggin,nicotinamide,igf-1,bfgf,activina和su5402促进细胞分化，能够成功诱导hipscs分化为hrpe细胞。
本发明不局限于上述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。