一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的方法与流程

文档序号:15457418发布日期:2018-09-15 01:29

本发明涉及免疫细胞制备领域,具体地,本发明涉及一种利用Cas9/RNP制备PD-1和 LAG3敲除的CD19 CAR-T细胞。



背景技术:

继手术、放疗、化疗后,肿瘤的免疫疗法已成为行之有效的治疗方式,近期收到广泛关注。其中嵌合抗原受体T细胞技术(Cheimeric Antigen Receptors-T cell,CAR-T)是一种新出现的过继性细胞疗法(Adoptive cell transfer therapy,ACT),该技术将患者T细胞在体外修饰、活化和增殖后回输到患者体内,通过T细胞表达的特异性受体,靶向性的识别肿瘤细胞,并显示较强的杀伤活性和持久性。

死亡分子-1(Programmed death-1,PD-1,也称为CD279)属于T淋巴细胞的抑制性共受体,是一种重要的免疫检查点,其配体(Programmed death ligand 1,PD-L1,也称为B7-H1 或CD274)可在多种肿瘤细胞表面表达。PD-1/PD-L1结合介导负性免疫调节通路,有利于形成肿瘤微环境,促进肿瘤免疫逃逸。

淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3,LAG-3)是一种重要的免疫检查点,主要表达于活化后的效应T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、B细胞及浆细胞样树突状细胞等,在调节T细胞免疫应答中发挥着十分微妙的作用。越来越多的证据表明,无论在体内还是体外,LAG-3都会负调控效应T细胞的功能(活化、细胞因子释放和细胞杀伤),同时会增强调节性T细胞的免疫抑制功能。LAG-3还是T细胞耗竭的一个标志,在肿瘤和慢性感染环境中,LAG-3的表达会在T细胞表面明显上调,通过单克隆抗体阻断LAG-3,会增强 T细胞的增殖和细胞因子释放,而且会延迟细胞周期停滞,增加记忆T细胞亚型的比例。

在慢性感染和肿瘤的临床前研究发现,PD-1和LAG-3在促进免疫逃逸的过程中发挥协同作用,同时阻断PD-1和LAG-3信号通路可以逆转T细胞耗竭,提高T细胞抗感染和抗肿瘤的能力。目前单独使用LAG-3抗体或联合使用PD-1抗体和LAG-3抗体治疗血液肿瘤和实体瘤的临床试验正在进行(ClinicalTrials.gov,No.NCT02061761,NCT01968109)。

嵌合抗原受体(CAR)由胞外抗体结合区、铰链区、跨膜区胞内信号传导区等构成,一般通过病毒转导或电穿孔,使CAR分子表达在T细胞表面形成CAR-T细胞。CAR分子的设计根据胞内信号区的不同经历了四代发展,其中第一代信号区仅包含CD3ζ;第二代信号区在第一代基础上加了一个共刺激因子,如CD28、4-1BB、OX40等;第三代在第一代基础上加了两个串联的共刺激因子;第四代包含IL12、IL7、CCL19等能改善微环境的细胞因子。靶向血液肿瘤方向的CD19的CAR-T细胞,部分研究中总体缓解率达90%以上。然而在部分血液肿瘤及大部分实体肿瘤中由于肿瘤微环境的抑制,效果不是很理想,而免疫检验点是解除免疫抑制的关键环节之一,所以免疫检查点在T细胞上的敲除具有重要的临床应用价值。

过继性细胞输注前,体外通过Cas9/RNP(ribonucleoproteins)与单链引导 RNA(single-guide RNAs,sgRNA)靶向基因编辑技术永久敲除CAR-T细胞上的免疫检查点受体如PD-1和LAG-3,能够提高CAR-T的功能,促进可识别肿瘤抗原并产生特异性反应的T 细胞增殖,发挥其杀伤肿瘤细胞的作用。有研究报道在T细胞或CAR-T细胞中敲除PD-1能够增强T细胞或CAR-T细胞抗肿瘤功能,但目前还没有关于T或CAR-T细胞敲除PD-1和 LAG-3的报道。本发明首次利用CRISPR-Cas9系统在T细胞和CAR-T细胞中进行PD-1和 LAG-3的敲除,并观察基因编辑后的T和CAR-T细胞免疫表型和功能变化。



技术实现要素:

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的瓶颈,提供一种Cas9/RNP制备PD-1和LAG3 双基因敲除CD19 CAR-T细胞的方法,并证明了其在肿瘤治疗中的潜在应用。具体地说,发明提供一种CRISPR/Cas9体外编辑T细胞或CAR-T的方法,通过编辑是T细胞或者CAR-T 细胞表面的PD-1和LAG3蛋白的表达水平下调或消失,解除免疫抑制信号,赋予T细胞更强的肿瘤杀伤能力。

为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:

本发明的第一个目的是提供一种CD4+/CD8+ T细胞提取的方法,其中CD4+ T细胞和CD8+ T 细胞分别由EasySeq试剂盒(STEMCELL)按对应说明书操作分别提取出来。

本发明的第二个目的是提供一种靶向敲除T细胞PD-1和LAG3基因的Cas9/RNP体外编辑的方法,其中包括sgRNA和Cas9蛋白的合成,以及将两者电穿孔转染进T细胞中;进一步地,所述sgRNA由序列固定的tracrRNA和靶向DNA的crRNA两部分组成,其中靶向PD-1的序列如SEQ NO.1~2,靶向LAG3的序列如SEQ NO.3~4;

进一步地,所述Cas9为S.pyogenes Cas9蛋白,并且在其羧基端有一个HA标签和两个核定位信号(NLS)序列如SEQ NO.5~6;

进一步地,tracrRNA与crRNA按浓度比1:1混合成sgRNA,随后将sgRNA与Cas9蛋白按浓度比1:1混合成Cas RNP;

更进一步地,将3×105个CD4+/CD8+ T细胞与20μL Amaxa电穿孔转染试剂盒中试剂P3混合成细胞悬液,将3μL 20mM Cas9/RNP与细胞悬液混合,按4D-Nuclelfecter电转仪电转程序EH-115进行电穿孔转染。

本发明的第三个目的是提供一种CD19 CAR慢病毒载体;

进一步地,所述CAR分子是利用pCDH载体依次串联人EF1α、CSF2RA嵌合受体信号肽、胞外抗体结合区、铰链区、跨膜区胞内信号传导区和T2A短肽连接的筛选基因CopGFP制备而成;

进一步地,胞内信号区为OX40-4-1BB-CD3ζ,OX40和4-1BB为嵌合受体共刺激分子;

优选地,所述铰链区为CD8hinge区域,所述跨膜区为CD8α;

更进一步地,CD19 CAR pCDH载体质粒在辅助质粒pSPA2和vsv-G包膜质粒pMD2.G存在的情况下,待细胞长至80-90%,共转染HEK293T细胞,收集上清,浓缩后即可制成高质量的带有CAR分子的慢病毒。

最后,本发明第四个目的是提供一种含有PD-1和LAG3敲除的编码CD19 CAR基因的重组表达载体的宿主细胞;

进一步地,所述宿主细胞为T细胞或者含有T细胞的细胞群;

进一步地,所述带有CD19 CAR分子的慢病毒与宿主细胞的moi值为1~5;

进一步地,所述宿主细胞转染后采用anti-CD3+CD28抗体磁珠激活,用于筛选并培养扩增转染后的T细胞以获得PD-1和LAG3敲除的CD19 CAR-T细胞。

在一个实施例中,将CD19 CAR-T细胞与表达CD19(+)PD-1(-)LAG3(-)、 CD19(+)PD-1(+)LAG3(+)的肿瘤细胞系K652共孵育,结果显示CD19 CAR-T细胞能够在 CD19(+)PD-1(-)LAG3(-)靶细胞刺激的情况下大量的产生IFN-γ;但是却不能与 CD19(+)PD-1(+)LAG3(+)靶细胞共孵育时产生IFN-γ;同时非CD19靶向的T细胞不能够在 CD19(+)靶细胞刺激下产生IFN-γ。该实施案例说明了PD-1和LAG3双基因敲除的CAR-T 细胞有良好的靶向性,能够在CD19靶点的刺激下将T细胞杀伤功能激活,并且能够解除PD-1 和LAG-3免疫抑制剂对免疫的抑制效果。

在另一个实施中,证明了在一定的效靶比(CAR-T细胞:靶细胞)下,CD19 CAR-T细胞或敲除PD-1和LAG3的CD189 CAR-T细胞,均能够杀伤CD19阳性的肿瘤细胞,且无论是否敲出PD-1和LAG3,两者杀伤的能力差异不显著;但是非靶向CD19的T细胞或PD-1 和LAG3敲除的T细胞,均不能杀伤CD19阴性的肿瘤细胞。该实例说明CD19 CAR-T细胞能够有效杀伤CD19阳性的肿瘤细胞,且敲除PD-1和LAG3对CD19 CAR-T细胞的活性影响较小。

与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:

目前,CAR-T技术在实体瘤领域的应用并不成功,一个重要的原因就是免疫微环境的免疫抑制效应,通过体外Cas9/RNP敲除PD-1和LAG3基因,能够通过免疫检验点的减弱从而解除免疫微环境的抑制功能;Cas9/RNP是通过体外带有引导入核序列的S.pyogenes Cas9蛋白和合成的PD-1和LAG3 sgRNA组成,避免了载体转染时外部序列对细胞的干扰,增加了临床应用的安全性。本发明所述的利用Cas9/RNP将PD-1和LAG3基因敲除的CAR-T细胞制备方法,能够特异性解除免疫微环境的抑制,特异高效杀伤靶向肿瘤细胞。

附图说明

图1为靶向PD-1和LAG3基因的sgRNA靶向序列的说明示意图;

图2为慢病毒pCDH载体的基因结构的说明示意图;

图3为流式检测PD-1和LAG3敲除T细胞的敲除PCR结果示意图;

图4为流式检测PD-1和LAG3敲除T细胞的敲除T7EH1酶切结果示意图;

图5为流式检测CD19 CAR表达水平的示意图;

图6为正常CAR-T细胞和PD-1(-)LAG3(-)CD19(+)CAR-T细胞,分别与K562白血病细胞系和Raji淋巴瘤细胞共培养后,分泌IFN-γ情况的示意图;

图7A和图7B为正常CAR-T细胞和PD-1(-)LAG3(-)CD19(+)CAR-T细胞体外杀伤CD19+ K652细胞的结果示意图。

具体实施方式

本发明提供一种Cas9/RNP制备PD-1和LAG3双基因敲除CD19 CAR-T细胞的方法,其包括CD4+/CD8+ T细胞制备、PD-1和LAG3敲除的sgRNA和Cas9蛋白准备、将Cas9/RNP 与T细胞的电穿孔转染、CD19 CAR慢病毒的转染、anti-CD3+CD28抗体磁珠激活并通过筛选培养获得CD19 CAR-T细胞。

CD4+/CD8+T的制备:

用EDTA抗凝管采集健康人外周血,将入等体积磷酸缓冲液PBS稀释,将外周血稀释液加入到等体积淋巴细胞分离液(Ficoll)的50ml离心管中,400g 30min离心;小心吸取淋巴分离液上的白膜层细胞,转入新的50ml离心管中,用PBS离心300g 10min洗涤3次,即可获得PBMC 细胞;将PBMC细胞分别按照EasySeq试剂盒(EasySepTMHuman CD4+/CD8+ T Cell Enrichment Kit,STEMCELL)说明书操作即可获得CD4+和CD8+ T细胞;

T细胞存储在含有20%人AB血清和10%DMSO的RPIM培养基中;T细胞复苏后,用含有 30U/ml的T细胞培养基培养过夜;T细胞培养基(T cell culture medium,TCM)由以下组成: X-Vivo15(Lonza),5%人AB血清(Valley Biomedical),55μMβ-巯基乙醇,10mM N-乙酰L- 半胱氨酸。

Cas9/RNP介导T细胞基因编辑的sgRNA和Cas9蛋白的准备:

Cas9/RNP由靶向基因的sgRNA和用于剪切基因的Cas9蛋白两部分组成;sgRNA由固定组成的tracrRNA和靶向目标基因的crRNA构成,用于敲除PD-1和LAG3基因的crRNA 的靶向序列(SEQ NO.1~2和SEQ No.3~4)由上海吉满生物化学合成,示意图见图1;Cas9为 S.pyogenes Cas9蛋白,为了能够监测Cas9蛋白以及利于Cas9蛋白的入核,在其羧基端有一个HA标签和两个核定位信号(NLS)序列(SEQ NO.5~6),由上海近岸科技合成。

Cas9 RNP与T细胞的电穿孔转化:

人CD4+或CD8+T细胞解冻后,用TCM培养24h;随后用含有30U/ml IL2的TCM培养基培 养,同时用anti-CD3(10μg/mL,)和anti-CD28(5μg/mL,)刺激48h;

将化学合成的tracrRNA、靶向PD-1或LAG3外显子1的crRNA分别悬浮于10mM Tris-HCl pH7.4,得到80μM tracrRNA和80μM crRNA;crRNA与tracrRNA按照1:1的比例混合, 置于37℃30min,得到40μM crRNA:tracrRNA混合的sgRNA;将等体积的40μM sgRNA 与40μM spCas9蛋白(冻存于20mM HEPES,150mM KCl,10%甘油,1mM TCEP)混合,得到 20μM Cas9 RNP;CD4+或CD8+T细胞悬浮于P3缓冲液(Amaxa P3Primary Cell Kit)中使其 细胞浓度为~3×105,得到T细胞悬液;将3μL 20μM Cas9 RNP加入到20μL细胞悬液中, 混匀;4D-Nucleofecter(Lonza)程序EH-115进行电穿孔转化;

随后提取T细胞基因组DNA,并利用设计好的PD-1引物(5’-tttcccttccgctcacctc-3’和5’ -cacctacctaagaaccatcctg-3’)和LAG3引物(5’-attccggcctctggtcatcc-3’和5’ -ggagaggcttcactaggtgag-3’),进行PCR扩增,目的片段纯化回收;利用T7EN1酶切检测突变 体,3%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,如图3凝胶电泳图所示。将PCR产物用pMD18T载 体中,转化入TOP10大肠杆菌感受态细胞,随机挑取克隆进行测序,评估目标片段被切割后 碱基变化和切割效率。

构建CAR分子到慢病毒载体pCDH:

本发明中CAR分子是利用pCDH载体依次串联人EF1α、CSF2RA嵌合受体信号肽、胞外抗体结合区、铰链区、跨膜区胞内信号传导区和T2A短肽连接的筛选基因CopGFP制备而成,其信号域为OX40-4-1BB-CD3ζ,其分子结构见图2慢病毒pCDH结构示意图;

首先化学合成CD19 FMC63核酸片段至pUC57载体中,Not I/Xba I双酶切得到FMC63片段; Not I/Xba I双酶切慢病毒载体pCDH;将线性pCDH载体与FMC63片段使用T4连接酶链接,室温1~2小时,随后转化入stb13感受态细胞,过夜培养后,挑取阳性单克隆扩增培养并提取质粒,测序验证其序列,正确的质粒命名为pCDH-EF1α-CSF2RA-CD19scFv(FMC63)-CD8 hinge-CD8α-OX40-4-1BB-CD3ζ-T2A-CopGFP(以下简写为pCDH-CD19scFv)。

PD-1和LAG3基因敲除的CD 19 CAR-T(PD-1:LAG3-DKO CAR-T)细胞的构建:

CAR慢病毒的包装:首先使用无内毒素大提质粒试剂盒提取pCDH-CD19scFv以及慢病毒系统辅助包装质粒pMD2.G和PSPAX2。转染前一天将2.0~3.0*107HEK 293T细胞铺至T75培养方瓶中,待细胞长至80%左右后用于转染。转染前将293T细胞培养基更换为10ml无血清培养基,使用转染试剂HQ(Polyplus,France)将质粒共转染到293T细胞中,转染24小时后将细胞培养基更换为完全培养基DMEM+10%FBS。转然后48小时后收集上清,并加入 15ml完全培养基,72小时后再收集上清,弃掉细胞。上清用0.45μm滤膜过滤,5000g离心 1min去除杂质,随后40000g离心2小时将病毒沉淀,用0.1ml PBS重悬病毒。置于-80℃冰箱,冻存备用;

PD-1和LAG3敲除T细胞转导:将电穿孔后的CD4+或CD8+ T细胞中加入80μL预热的TCM 培养基,37℃30min;将细胞与anti-CD3+CD28(Invitrogen)抗体磁珠以1:1的比例混合,并且用TCM将细胞浓度调整为1×106/ml,培养2-4h;加入含有CD19 CAR的慢病毒,培养24-36h; 72h后利用流式细胞术检测GFP表达以检测CAR分子转导效率;磁珠在刺激4-6天后移除;将CD4+PD-1(-)LAG3(-)CD19 CAR-T细胞与CD8+PD-1(-)LAG3(-)CD19 CAR-T细胞按等浓度1:1比例混合,即可得到最终的PD-1和LAG3基因敲除的CD19 CAR-T细胞。

PD-1和LAG3基因敲除的CD 19 CAR-T细胞活性测定:

将PD-1和LAG3敲除CD19 CAR-T细胞与表达CD19(+)PD-1(-)LAG3(-)、 CD19(+)PD-1(+)LAG3(+)的肿瘤细胞系K652共孵育,结果显示PD-1和LAG3敲除CD19 CAR-T细胞能够在CD19(+)PD-1(-)LAG3(-)靶细胞刺激的情况下大量的产生IFN-γ;但是却不能与CD19(+)PD-1(+)LAG3(+)靶细胞共孵育时产生IFN-γ;同时非CD19靶向的T细胞不能够在CD19(+)靶细胞刺激下产生IFN-γ,如图5所示。该实施案例说明了PD-1和LAG3 双基因敲除的CAR-T细胞有良好的靶向性,能够在CD19靶点的刺激下将T细胞杀伤功能激活,并且能够解除PD-1和LAG-3免疫抑制剂对免疫的抑制效果。

PD-1和LAG3基因敲除的CD 19 CAR-T细胞杀伤CD19靶细胞的能力:

用5-竣基荧光素琥珀酰亚胺基(CFSE)将靶细胞染色,将PD-1(-)LAG3(-)CD19 CAR-T细胞或未敲除PD-1和LAG3的CAR-T细胞与K652、Raji细胞按以下效靶比混合培养:05:1,1:1, 2:1,5:1。经过4小时共培养后,将细胞用PI试剂盒染色,同时设置对照组,对照组中的效应细胞为T淋巴细胞,空白组中不加任何效应细胞。使用流式细胞术对细胞杀伤进行检测。结果见图7A和图7B。无论是否敲除PD-1和LAG3,CAR-T细胞均能够有效杀伤K652和Raji 细胞,但是对照组中的T细胞没有能够有效杀伤细胞。该实施案例说明了CD CAR-T具备明确的肿瘤细胞杀伤活性,同时也表明电穿孔转化敲除PD-1和LAG3对CAR-T细胞的杀伤活性没有产生实质性的影响。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。

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