本发明涉及免疫细胞制备领域，具体地，本发明涉及一种利用cas9/rnp制备pd-1和lag3敲除的cd19car-t细胞。
背景技术：
继手术、放疗、化疗后，肿瘤的免疫疗法已成为行之有效的治疗方式，近期收到广泛关注。其中嵌合抗原受体t细胞技术(cheimericantigenreceptors-tcell,car-t)是一种新出现的过继性细胞疗法(adoptivecelltransfertherapy,act)，该技术将患者t细胞在体外修饰、活化和增殖后回输到患者体内，通过t细胞表达的特异性受体，靶向性的识别肿瘤细胞，并显示较强的杀伤活性和持久性。
死亡分子-1(programmeddeath-1,pd-1,也称为cd279)属于t淋巴细胞的抑制性共受体，是一种重要的免疫检查点，其配体(programmeddeathligand1,pd-l1,也称为b7-h1或cd274)可在多种肿瘤细胞表面表达。pd-1/pd-l1结合介导负性免疫调节通路，有利于形成肿瘤微环境，促进肿瘤免疫逃逸。
淋巴细胞活化基因-3(lymphocyteactivationgene-3,lag-3)是一种重要的免疫检查点，主要表达于活化后的效应t细胞、调节性t细胞、自然杀伤细胞、b细胞及浆细胞样树突状细胞等，在调节t细胞免疫应答中发挥着十分微妙的作用。越来越多的证据表明，无论在体内还是体外，lag-3都会负调控效应t细胞的功能(活化、细胞因子释放和细胞杀伤)，同时会增强调节性t细胞的免疫抑制功能。lag-3还是t细胞耗竭的一个标志，在肿瘤和慢性感染环境中，lag-3的表达会在t细胞表面明显上调，通过单克隆抗体阻断lag-3，会增强t细胞的增殖和细胞因子释放，而且会延迟细胞周期停滞，增加记忆t细胞亚型的比例。
在慢性感染和肿瘤的临床前研究发现，pd-1和lag-3在促进免疫逃逸的过程中发挥协同作用，同时阻断pd-1和lag-3信号通路可以逆转t细胞耗竭，提高t细胞抗感染和抗肿瘤的能力。目前单独使用lag-3抗体或联合使用pd-1抗体和lag-3抗体治疗血液肿瘤和实体瘤的临床试验正在进行(clinicaltrials.gov,no.nct02061761,nct01968109)。
嵌合抗原受体(car)由胞外抗体结合区、铰链区、跨膜区胞内信号传导区等构成，一般通过病毒转导或电穿孔，使car分子表达在t细胞表面形成car-t细胞。car分子的设计根据胞内信号区的不同经历了四代发展，其中第一代信号区仅包含cd3ζ；第二代信号区在第一代基础上加了一个共刺激因子，如cd28、4-1bb、ox40等；第三代在第一代基础上加了两个串联的共刺激因子；第四代包含il12、il7、ccl19等能改善微环境的细胞因子。靶向血液肿瘤方向的cd19的car-t细胞，部分研究中总体缓解率达90％以上。然而在部分血液肿瘤及大部分实体肿瘤中由于肿瘤微环境的抑制，效果不是很理想，而免疫检验点是解除免疫抑制的关键环节之一，所以免疫检查点在t细胞上的敲除具有重要的临床应用价值。
过继性细胞输注前，体外通过cas9/rnp(ribonucleoproteins)与单链引导rna(single-guidernas,sgrna)靶向基因编辑技术永久敲除car-t细胞上的免疫检查点受体如pd-1和lag-3，能够提高car-t的功能，促进可识别肿瘤抗原并产生特异性反应的t细胞增殖，发挥其杀伤肿瘤细胞的作用。有研究报道在t细胞或car-t细胞中敲除pd-1能够增强t细胞或car-t细胞抗肿瘤功能，但目前还没有关于t或car-t细胞敲除pd-1和lag-3的报道。本发明首次利用crispr-cas9系统在t细胞和car-t细胞中进行pd-1和lag-3的敲除，并观察基因编辑后的t和car-t细胞免疫表型和功能变化。
技术实现要素：
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的瓶颈，提供一种cas9/rnp制备pd-1和lag3双基因敲除cd19car-t细胞的方法，并证明了其在肿瘤治疗中的潜在应用。具体地说，发明提供一种crispr/cas9体外编辑t细胞或car-t的方法，通过编辑是t细胞或者car-t细胞表面的pd-1和lag3蛋白的表达水平下调或消失，解除免疫抑制信号，赋予t细胞更强的肿瘤杀伤能力。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种cd4+/cd8+t细胞提取的方法，其中cd4+t细胞和cd8+t细胞分别由easyseq试剂盒(stemcell)按对应说明书操作分别提取出来。
本发明的第二个目的是提供一种靶向敲除t细胞pd-1和lag3基因的cas9/rnp体外编辑的方法，其中包括sgrna和cas9蛋白的合成，以及将两者电穿孔转染进t细胞中；进一步地，所述sgrna由序列固定的tracrrna和靶向dna的crrna两部分组成，其中靶向pd-1的序列如seqno.1～2，靶向lag3的序列如seqno.3～4；
进一步地，所述cas9为s.pyogenescas9蛋白，并且在其羧基端有一个ha标签和两个核定位信号(nls)序列如seqno.5～6；
进一步地，tracrrna与crrna按浓度比1:1混合成sgrna，随后将sgrna与cas9蛋白按浓度比1:1混合成casrnp；
更进一步地，将3×105个cd4+/cd8+t细胞与20μlamaxa电穿孔转染试剂盒中试剂p3混合成细胞悬液，将3μl20mmcas9/rnp与细胞悬液混合，按4d-nuclelfecter电转仪电转程序eh-115进行电穿孔转染。
本发明的第三个目的是提供一种cd19car慢病毒载体；
进一步地，所述car分子是利用pcdh载体依次串联人ef1α、csf2ra嵌合受体信号肽、胞外抗体结合区、铰链区、跨膜区胞内信号传导区和t2a短肽连接的筛选基因copgfp制备而成；
进一步地，胞内信号区为ox40-4-1bb-cd3ζ，ox40和4-1bb为嵌合受体共刺激分子；
优选地，所述铰链区为cd8hinge区域，所述跨膜区为cd8α；
更进一步地，cd19carpcdh载体质粒在辅助质粒pspa2和vsv-g包膜质粒pmd2.g存在的情况下，待细胞长至80-90％，共转染hek293t细胞，收集上清，浓缩后即可制成高质量的带有car分子的慢病毒。
最后，本发明第四个目的是提供一种含有pd-1和lag3敲除的编码cd19car基因的重组表达载体的宿主细胞；
进一步地，所述宿主细胞为t细胞或者含有t细胞的细胞群；
进一步地，所述带有cd19car分子的慢病毒与宿主细胞的moi值为1～5；
进一步地，所述宿主细胞转染后采用anti-cd3+cd28抗体磁珠激活，用于筛选并培养扩增转染后的t细胞以获得pd-1和lag3敲除的cd19car-t细胞。
在一个实施例中，将cd19car-t细胞与表达cd19(+)pd-1(-)lag3(-)、cd19(+)pd-1(+)lag3(+)的肿瘤细胞系k652共孵育，结果显示cd19car-t细胞能够在cd19(+)pd-1(-)lag3(-)靶细胞刺激的情况下大量的产生ifn-γ；但是却不能与cd19(+)pd-1(+)lag3(+)靶细胞共孵育时产生ifn-γ；同时非cd19靶向的t细胞不能够在cd19(+)靶细胞刺激下产生ifn-γ。该实施案例说明了pd-1和lag3双基因敲除的car-t细胞有良好的靶向性，能够在cd19靶点的刺激下将t细胞杀伤功能激活，并且能够解除pd-1和lag-3免疫抑制剂对免疫的抑制效果。
在另一个实施中，证明了在一定的效靶比(car-t细胞：靶细胞)下，cd19car-t细胞或敲除pd-1和lag3的cd189car-t细胞，均能够杀伤cd19阳性的肿瘤细胞，且无论是否敲出pd-1和lag3，两者杀伤的能力差异不显著；但是非靶向cd19的t细胞或pd-1和lag3敲除的t细胞，均不能杀伤cd19阴性的肿瘤细胞。该实例说明cd19car-t细胞能够有效杀伤cd19阳性的肿瘤细胞，且敲除pd-1和lag3对cd19car-t细胞的活性影响较小。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
目前，car-t技术在实体瘤领域的应用并不成功，一个重要的原因就是免疫微环境的免疫抑制效应，通过体外cas9/rnp敲除pd-1和lag3基因，能够通过免疫检验点的减弱从而解除免疫微环境的抑制功能；cas9/rnp是通过体外带有引导入核序列的s.pyogenescas9蛋白和合成的pd-1和lag3sgrna组成，避免了载体转染时外部序列对细胞的干扰，增加了临床应用的安全性。本发明所述的利用cas9/rnp将pd-1和lag3基因敲除的car-t细胞制备方法，能够特异性解除免疫微环境的抑制，特异高效杀伤靶向肿瘤细胞。
附图说明
图1为靶向pd-1和lag3基因的sgrna靶向序列的说明示意图；
图2为慢病毒pcdh载体的基因结构的说明示意图；
图3为流式检测pd-1和lag3敲除t细胞的敲除pcr结果示意图；
图4为流式检测pd-1和lag3敲除t细胞的敲除t7eh1酶切结果示意图；
图5为流式检测cd19car表达水平的示意图；
图6为正常car-t细胞和pd-1(-)lag3(-)cd19(+)car-t细胞，分别与k562白血病细胞系和raji淋巴瘤细胞共培养后，分泌ifn-γ情况的示意图；
图7a和图7b为正常car-t细胞和pd-1(-)lag3(-)cd19(+)car-t细胞体外杀伤cd19+k652细胞的结果示意图。
具体实施方式
本发明提供一种cas9/rnp制备pd-1和lag3双基因敲除cd19car-t细胞的方法，其包括cd4+/cd8+t细胞制备、pd-1和lag3敲除的sgrna和cas9蛋白准备、将cas9/rnp与t细胞的电穿孔转染、cd19car慢病毒的转染、anti-cd3+cd28抗体磁珠激活并通过筛选培养获得cd19car-t细胞。
cd4+/cd8+t的制备：
用edta抗凝管采集健康人外周血，将入等体积磷酸缓冲液pbs稀释，将外周血稀释液加入到等体积淋巴细胞分离液(ficoll)的50ml离心管中，400g30min离心；小心吸取淋巴分离液上的白膜层细胞，转入新的50ml离心管中，用pbs离心300g10min洗涤3次，即可获得pbmc细胞；将pbmc细胞分别按照easyseq试剂盒(easyseptmhumancd4+/cd8+tcellenrichmentkit,stemcell)说明书操作即可获得cd4+和cd8+t细胞；
t细胞存储在含有20％人ab血清和10％dmso的rpim培养基中；t细胞复苏后，用含有30u/ml的t细胞培养基培养过夜；t细胞培养基(tcellculturemedium,tcm)由以下组成：x-vivo15(lonza)，5％人ab血清(valleybiomedical)，55μmβ-巯基乙醇，10mmn-乙酰l-半胱氨酸。
cas9/rnp介导t细胞基因编辑的sgrna和cas9蛋白的准备：
cas9/rnp由靶向基因的sgrna和用于剪切基因的cas9蛋白两部分组成；sgrna由固定组成的tracrrna和靶向目标基因的crrna构成，用于敲除pd-1和lag3基因的crrna的靶向序列(seqno.1～2和seqno.3～4)由上海吉满生物化学合成，示意图见图1；cas9为s.pyogenescas9蛋白，为了能够监测cas9蛋白以及利于cas9蛋白的入核，在其羧基端有一个ha标签和两个核定位信号(nls)序列(seqno.5～6)，由上海近岸科技合成。
cas9rnp与t细胞的电穿孔转化：
人cd4+或cd8+t细胞解冻后，用tcm培养24h；随后用含有30u/mlil2的tcm培养基培养，同时用anti-cd3(10μg/ml,)和anti-cd28(5μg/ml,)刺激48h；
将化学合成的tracrrna、靶向pd-1或lag3外显子1的crrna分别悬浮于10mmtris-hclph7.4，得到80μmtracrrna和80μmcrrna；crrna与tracrrna按照1:1的比例混合，置于37℃30min，得到40μmcrrna:tracrrna混合的sgrna；将等体积的40μmsgrna与40μmspcas9蛋白(冻存于20mmhepes,150mmkcl,10％甘油,1mmtcep)混合，得到20μmcas9rnp；cd4+或cd8+t细胞悬浮于p3缓冲液(amaxap3primarycellkit)中使其细胞浓度为～3×105，得到t细胞悬液；将3μl20μmcas9rnp加入到20μl细胞悬液中，混匀；4d-nucleofecter(lonza)程序eh-115进行电穿孔转化；
随后提取t细胞基因组dna，并利用设计好的pd-1引物(5’-tttcccttccgctcacctc-3’和5’-cacctacctaagaaccatcctg-3’)和lag3引物(5’-attccggcctctggtcatcc-3’和5’-ggagaggcttcactaggtgag-3’)，进行pcr扩增，目的片段纯化回收；利用t7en1酶切检测突变体，3％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，如图3凝胶电泳图所示。将pcr产物用pmd18t载体中，转化入top10大肠杆菌感受态细胞，随机挑取克隆进行测序，评估目标片段被切割后碱基变化和切割效率。
构建car分子到慢病毒载体pcdh：
本发明中car分子是利用pcdh载体依次串联人ef1α、csf2ra嵌合受体信号肽、胞外抗体结合区、铰链区、跨膜区胞内信号传导区和t2a短肽连接的筛选基因copgfp制备而成，其信号域为ox40-4-1bb-cd3ζ，其分子结构见图2慢病毒pcdh结构示意图；
首先化学合成cd19fmc63核酸片段至puc57载体中，noti/xbai双酶切得到fmc63片段；noti/xbai双酶切慢病毒载体pcdh；将线性pcdh载体与fmc63片段使用t4连接酶链接，室温1～2小时，随后转化入stb13感受态细胞，过夜培养后，挑取阳性单克隆扩增培养并提取质粒，测序验证其序列，正确的质粒命名为pcdh-ef1α-csf2ra-cd19scfv(fmc63)-cd8hinge-cd8α-ox40-4-1bb-cd3ζ-t2a-copgfp(以下简写为pcdh-cd19scfv)。
pd-1和lag3基因敲除的cd19car-t(pd-1:lag3-dkocar-t)细胞的构建：
car慢病毒的包装：首先使用无内毒素大提质粒试剂盒提取pcdh-cd19scfv以及慢病毒系统辅助包装质粒pmd2.g和pspax2。转染前一天将2.0～3.0*107hek293t细胞铺至t75培养方瓶中，待细胞长至80％左右后用于转染。转染前将293t细胞培养基更换为10ml无血清培养基，使用转染试剂
pd-1和lag3敲除t细胞转导：将电穿孔后的cd4+或cd8+t细胞中加入80μl预热的tcm培养基，37℃30min；将细胞与anti-cd3+cd28(invitrogen)抗体磁珠以1:1的比例混合，并且用tcm将细胞浓度调整为1×106/ml，培养2-4h；加入含有cd19car的慢病毒，培养24-36h；72h后利用流式细胞术检测gfp表达以检测car分子转导效率；磁珠在刺激4-6天后移除；将cd4+pd-1(-)lag3(-)cd19car-t细胞与cd8+pd-1(-)lag3(-)cd19car-t细胞按等浓度1:1比例混合，即可得到最终的pd-1和lag3基因敲除的cd19car-t细胞。
pd-1和lag3基因敲除的cd19car-t细胞活性测定：
将pd-1和lag3敲除cd19car-t细胞与表达cd19(+)pd-1(-)lag3(-)、cd19(+)pd-1(+)lag3(+)的肿瘤细胞系k652共孵育，结果显示pd-1和lag3敲除cd19car-t细胞能够在cd19(+)pd-1(-)lag3(-)靶细胞刺激的情况下大量的产生ifn-γ；但是却不能与cd19(+)pd-1(+)lag3(+)靶细胞共孵育时产生ifn-γ；同时非cd19靶向的t细胞不能够在cd19(+)靶细胞刺激下产生ifn-γ，如图5所示。该实施案例说明了pd-1和lag3双基因敲除的car-t细胞有良好的靶向性，能够在cd19靶点的刺激下将t细胞杀伤功能激活，并且能够解除pd-1和lag-3免疫抑制剂对免疫的抑制效果。
pd-1和lag3基因敲除的cd19car-t细胞杀伤cd19靶细胞的能力：
用5-竣基荧光素琥珀酰亚胺基(cfse)将靶细胞染色，将pd-1(-)lag3(-)cd19car-t细胞或未敲除pd-1和lag3的car-t细胞与k652、raji细胞按以下效靶比混合培养：05:1,1:1,2:1,5:1。经过4小时共培养后，将细胞用pi试剂盒染色，同时设置对照组，对照组中的效应细胞为t淋巴细胞，空白组中不加任何效应细胞。使用流式细胞术对细胞杀伤进行检测。结果见图7a和图7b。无论是否敲除pd-1和lag3，car-t细胞均能够有效杀伤k652和raji细胞，但是对照组中的t细胞没有能够有效杀伤细胞。该实施案例说明了cdcar-t具备明确的肿瘤细胞杀伤活性，同时也表明电穿孔转化敲除pd-1和lag3对car-t细胞的杀伤活性没有产生实质性的影响。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110>杭州荣泽生物科技有限公司
<120>一种cas9/rnp敲除t细胞pd-1和lag3基因及制备car-t细胞的方法
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