本发明涉及一种用于检测产肠毒素大肠杆菌菌毛基因的多重pcr引物组、试剂盒及检测方法，特别涉及用于检测产肠毒素大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因的多重pcr引物组、试剂盒及检测方法。本发明属于生物检测技术领域。
背景技术：
大肠杆菌(escherichiacoli，e.coli)为革兰阴性无芽孢短杆菌，自1885年被发现后一直被当作正常肠道菌群的组成部分，是非致病菌。直到20世纪中叶，研究发现一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物，尤其对婴儿和幼龄动物有致病性，常引起严重腹泻和败血症。目前致病性大肠杆菌可分为产肠毒素大肠杆菌(etec)、产志贺毒素大肠杆菌(stec)、肠致病性大肠杆菌(epec)、肠侵袭性大肠杆菌(eiec)、肠出血性大肠杆菌(ehec)、肠聚集性大肠杆菌(eaec)、黏附和损伤性大肠杆菌(aeec)、广泛黏附性大肠杆菌(daec)、败血性大肠杆菌(sepec)、禽致病性大肠杆菌(apec)和尿道致病性大肠杆菌(upec)。其中etec是导致幼畜腹泻的主要病原菌之一，可引起仔猪白痢、仔猪黄痢、犊牛白痢等腹泻性疾病，严重者脱水，死亡，给养殖业造成巨大经济损失。调查发现，引起幼畜腹泻的etec常带有不同类型的菌毛，并借助菌毛的黏附作用定居在肠绒毛上皮细胞，分泌肠毒素产生致病作用。etec常见的菌毛有f4、f5、f6、f41、f18，因此对编码这些菌毛的基因的快速检测有助于对大肠杆菌分离菌的致病性、菌毛血清型快速鉴定和疾病的快速诊断。
etec多经消化道感染，其中新生幼畜及婴幼儿易感性最高。据调查，etec引起新生幼畜腹泻所占的比例，猪为35％，牛为26％，羊为17％。目前我国针对etec相关菌毛的检测方法主要以传统检测方法为主，具体操作流程是在分离培养的基础上用菌毛单因子血清进行玻板凝集试验检测菌毛或用pcr方法检测菌毛编码基因。由于pcr技术的广泛应用，菌毛单因子血清产品越来越少，玻板凝集试验受到限制。目前国内虽有检测大肠杆菌菌毛基因的单一pcr和多重pcr方法，但最多同时只能检测4种(f4、f5、f6、f41)菌毛基因，而针对f4、f5、f6、f41、f185种菌毛基因的多重pcr方法还未见报道，因此，本发明建立了一种多重pcr检测方法，该方法能够实现上述5种菌毛基因的同时检测，适用于etec菌毛血清型鉴定和幼畜腹泻病的诊断，可推广应用。
多重pcr是指在同一反应体系中加入两对或两对以上的引物，针对多个dna模板或同一模板的不同区域进行扩增。该方法可在同一个反应体系中对多个菌毛基因进行检测，省去了使用多种单因子血清或pcr方法对分离菌多次检测的步骤，具有简单、灵敏度高、特异性好的优点。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于检测产肠毒素大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因的检测引物组、试剂盒及多重pcr检测方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种用于检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因的多重pcr引物组，包括用于检测大肠杆菌f4(k88)菌毛基因的引物对、用于检测大肠杆菌f5(k99)菌毛基因的引物对、用于检测大肠杆菌f6(987p)菌毛基因的引物对、用于检测大肠杆菌f41菌毛基因的引物对和用于检测大肠杆菌f18菌毛基因的引物对，其中：
所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌f4菌毛基因的引物对为：
f1：5’-atttcaatggttcggtcg-3’(seqidno.1所示)
r1：5’-gattgctacgttcagcggagcg-3’(seqidno.2所示)
所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌f5菌毛基因的引物对为：
f2：5’-aaacactgctagctattatc-3’(seqidno.3所示)
r2：5’-ataagtgactaagaaggatgc-3’(seqidno.4所示)
所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌f6菌毛基因的引物对为：
f3：5’-acttctaatctgtcgcaaacc-3’(seqidno.5所示)
r3：5’-gaacgaatagtcattactgcac-3’(seqidno.6所示)
所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌f41菌毛基因的引物对为：
f4：5’-atcagcggcagtatctggtt-3’(seqidno.7所示)
r4：5’-gaggtcatcccaattgtg-3’(seqidno.8所示)
所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌f18菌毛基因的引物对为：
f5：5’-ggtgatgatgattagtgatgtg-3’(seqidno.9所示)
r5：5’-tgttgcccccactgaga-3’(seqidno.10所示)。
进一步的，本发明还提出了所述的多重pcr引物组在制备检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因的试剂或试剂盒中的用途。以及所述的多重pcr引物组在制备产肠毒素大肠杆菌菌毛血清型鉴定的试剂或试剂盒中的用途。
其中，优选的，所述的产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因包括大肠杆菌f4、f5、f6、f41和f18菌毛基因。
更进一步的，本发明还提出了一种用于检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因的多重pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明以上所述的引物组。
使用所述的试剂盒检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因时，包括如下步骤：
(1)提取待检样品dna；
(2)利用权利1要求所述的引物组进行多重pcr扩增反应；
(3)根据pcr产物判断待检样品中是否含有5种菌毛基因。
其中，优选的，所述多重pcr扩增反应体系的组成如下所示：
其中，所述多重pcr扩增反应的参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火35s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃终延伸7min；4℃保存产物。
其特异性扩增产物电泳后出现769bp条带为大肠杆菌f4菌毛基因，出现532bp条带为大肠杆菌f5菌毛基因，出现421bp条带为大肠杆菌f6菌毛基因，出现642bp条带为大肠杆菌f41菌毛基因，出现1139bp为大肠杆菌f18菌毛基因。
本发明分别以产肠毒素大肠杆菌参考菌株c83903(f4+)、c83199(f5+)、c83915(f6+)、c83920(f5+、f41+)、c83684(f18+)、大肠杆菌分离菌dn48a(无菌毛)、dn67a(无菌毛)、绿脓杆菌51-b、巴氏杆菌cvcc430、猪丹毒杆菌cvcc124、猪霍乱沙门氏菌cvcc503的基因组进行实验，以验证该方法的特异性。结果显示，本发明方法能够对产肠毒素大肠杆菌的参考菌株进行特异性的检测，且设计合成的引物对之间以及引物与其他细菌之间无交叉反应，证明本发明方法具有较强特异性。
取5种过夜培养的新鲜菌液等量混合后，进行10倍梯度稀释，从每个稀释度产肠毒素大肠杆菌混合菌液中各取2.5μl，作为模板进行pcr检测。同时，分别取各稀释度的菌液100μl均匀涂布于lb琼脂平板上，置于37℃温箱培养10h，菌落计数。结果表明，该多重pcr方法同时检测5种产肠毒素大肠杆菌菌毛基因的最小检出量为：f49×104cfu/ml；f59×104cfu/ml；f69×105cfu/ml；f419×104cfu/ml；f189×104cfu/ml。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
使用本发明的多重pcr引物组检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因，具有特异性高、敏感性强，检测快速可靠、操作简便的优点，本发明的提出为产肠毒素大肠杆菌菌毛基因的快速检测提供了一种有效的手段。
附图说明
图1为产肠毒素大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因pcr检测结果电泳图；
m：dnamarker；泳道1-5分别为大肠杆菌f4菌毛基因，大肠杆菌f5菌毛基因，大肠杆菌f6菌毛基因，大肠杆菌f41菌毛基因，大肠杆菌f18菌毛基因的单独pcr结果，泳道6为大肠杆菌f4菌毛基因，大肠杆菌f5菌毛基因，大肠杆菌f6菌毛基因，大肠杆菌f41菌毛基因，大肠杆菌f18菌毛基因的混合pcr扩增结果；泳道7为阴性对照；
图2为产肠毒素大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18的菌毛基因不同退火温度扩增的结果电泳图；
m：dnamarker；泳道1-8分别代表60.0℃、59.2℃、58.0℃、56.1℃、53.8℃、51.9℃、50.7℃、50.0℃时的扩增产物电泳图，泳道9和10为阴性对照；
图3为产肠毒素大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因检测试剂盒特异性实验结果电泳图；
m：dnamarker；泳道1为阴性对照；泳道2为大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因的混合pcr扩增结果，泳道3～8分别为大肠杆菌分离菌dn48a(无菌毛)、dn67a(无菌毛)、巴氏杆菌cvcc430、猪霍乱沙门氏菌cvcc503、猪丹毒杆菌cvcc124、绿脓杆菌51-b的扩增结果；
图4为产肠毒素大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因检测试剂盒敏感性实验结果电泳图。
m：dnamarker；泳道1-8分别为稀释度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-710-8下的pcr结果；泳道9为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步的说明，但并不局限于此。
以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括dna模板制备、pcr扩增、质粒提取、质粒转化、dna片段连接、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(sambrookj，russelldw，janssenk，argentinej.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1引物设计
设计用于检测产肠毒素大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因的特异性引物对，用于检测5种菌毛基因的引物对的核苷酸序列如下所示：
用于检测产肠毒素大肠杆菌f4菌毛基因的引物对为：
f1：5’-atttcaatggttcggtcg-3’(seqidno.1所示)
r1：5’-gattgctacgttcagcggagcg-3’(seqidno.2所示)
用于检测产肠毒素大肠杆菌f5菌毛基因的引物对为：
f2：5’-aaacactgctagctattatc-3’(seqidno.3所示)
r2：5’-ataagtgactaagaaggatgc-3’(seqidno.4所示)
用于检测产肠毒素大肠杆菌f6菌毛基因的引物对为：
f3：5’-acttctaatctgtcgcaaacc-3’(seqidno.5所示)
r3：5’-gaacgaatagtcattactgcac-3’(seqidno.6所示)
用于检测产肠毒素大肠杆菌f41菌毛基因的引物对为：
f4：5’-atcagcggcagtatctggtt-3’(seqidno.7所示)
r4：5’-gaggtcatcccaattgtg-3’(seqidno.8所示)
用于检测产肠毒素大肠杆菌f18菌毛基因的引物对为：
f5：5’-ggtgatgatgattagtgatgtg-3’(seqidno.9所示)
r5：5’-tgttgcccccactgaga-3’(seqidno.10所示)。
设计的5对引物分别扩增769bp、532bp、421bp、642bp和1139bp菌毛基因特异性片段。
实施例2试剂盒的制备
所述的试剂盒包括以下表1所示的各组分：
表1
其中，所述的阳性质控标准品按照以下方法制备：采用pcr方法分别扩增产肠毒素大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因或部分基因，分别将产物与克隆载体pmd-19-t连接，转化感受态大肠杆菌transt1，获得阳性重组菌，参照中科瑞泰普通质粒小提试剂盒说明书制备阳性质粒。
实施例3产肠毒素大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因多重pcr检测方法的建立
1、多重pcr检测方法的建立
(1)大肠杆菌dna模板的制备
各大肠杆菌参考菌株c83903(f4+)、c83199(f5+)、c83915(f6+)、c83920(f5+、f41+)、c83684(f18+)接种至lb液体培养基，37℃增菌过夜。取1ml各参考菌株培养物于一个1.5ml的离心管中，经10000×g离心5min后，去上清，加入100μl灭菌去离子水进行重悬，100℃煮沸10min后立即置冰水混合物中冷却5min，再经10000×g离心5min后取上清于﹣20℃保存，作为dna模板备用。
(2)多重pcr扩增反应体系及组成
配制总体积为25μl的多重pcr的反应体系，具体组成如表2所示：
表2多重pcr反应体系
(3)反应体系的反应参数和扩增：取pcr管，分别加pcr反应混合液5.5μl、引物混合液10μl、模板2.5μl、灭菌去离子水7.0μl，混匀；
将多重pcr反应体系置于pcr仪中，反应参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火35s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃终延伸7min；4℃保存产物。
(4)pcr检测结果判定
取4μl扩增产物，点样于2％琼脂糖凝胶加样孔中，90v电压，电泳20min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现(图1第7泳道)，阳性对照出现5条大小分别为769bp、532bp、421bp、642bp和1139bp的条带(图1第6泳道)。
具体判定方法：电泳结果出现769bp条带为大肠杆菌f4菌毛基因(图1第1泳道)，出现532bp条带为大肠杆菌f5菌毛基因(图1第2泳道)，出现421bp条带为大肠杆菌f6菌毛基因(图1第3泳道)，出现642bp条带为大肠杆菌f41菌毛基因(图1第4泳道)，出现1139bp条带为大肠杆菌f18菌毛基因(图1第5泳道)。
(5)pcr条件优化
pcr反应体系在0.2ml的eppendorf管中进行，采用所述的反应体系，以f4-f1/r1、f5-f2/r2、f6-f3/r3、f41-f4/r4、f18-f5/r5为引物，以etecc83903(f4+)、etecc83199(f5+)、etecc83915(f6+)、etecc83920(f5+、f41+)、etecc83684(f18+)参考菌株的混合培养物提取的dna为模板，模板量为2.5μl，进行pcr扩增。对影响多重pcr扩增的退火温度进行优化，选取50℃～60℃作退火温度梯度pcr。退火温度为60℃时多重pcr扩增产物最明亮且无其他非特异性条带(图2第1泳道)，故最适退火温度应为60℃。
2、产肠毒素大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因检测试剂盒的特异性及敏感性评价
对制备的产肠毒素大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因检测试剂盒特异性及敏感性等主要特征分别进行了测评。
2.1试剂盒特异性试验
取大肠杆菌分离菌dn67a(无菌毛)、dn48a(无菌毛)、绿脓杆菌51-b、巴氏杆菌cvcc430、猪丹毒杆菌cvcc124、猪霍乱沙门氏菌cvcc503的基因组，按照试剂盒使用说明操作进行pcr，产物于2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因可扩增到特异性条带(图3第2泳道)，其他菌株的扩增结果均为阴性(如图3第3～8泳道)，泳道3～8分别为：大肠杆菌分离菌dn48a(无菌毛)、dn67a(无菌毛)、巴氏杆菌cvcc430、猪霍乱沙门氏菌cvcc503、猪丹毒杆菌cvcc124、绿脓杆菌51-b，第1泳道为阴性对照。
2.2以细菌培养物dna为模板的试剂盒敏感性试验
分别接种etec参考菌株c83903(f4+)、c83199(f5+)、c83915(f6+)、c83920(f5+、f41+)、c83684(f18+)至lb液体培养基中，37℃增菌过夜，各取200μl菌液，分别10倍梯度稀释菌液，稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。各吸取2.5μl加入反应体系，按照试剂盒操作说明进行，根据试验结果测定试剂盒的敏感性。结果表明，本发明建立的多重pcr体系对f4、f5、f41和f18基因的最小检出量为9×104cfu/ml；对f6基因的最小检出量为9×105cfu/ml(如图4)。
通过条件优化，确定了最佳的pcr反应体系和反应参数，组装了产肠毒素大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因检测试剂盒。对实验室已保存的阳性菌株进行扩增，均可扩增到特异性条带，而其他细菌参考菌株等对照样品均未扩增到特异性条带，说明该试剂盒具有很好的特异性。敏感性检测表明，试剂盒具有较高的敏感性，综合其最小检出量为9×104cfu/ml细菌菌液。研究结果表明，本发明研制的大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因检测试剂盒具有灵敏、特异、快速的优点，本发明的提出为大肠杆菌f4、f5、f6、f41、f18菌毛基因检测提供了新的技术手段。
以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述引物组、反应体系和反应参数的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
本发明不局限于上述实施例，基于上述实施例的、未做出创造性劳动的简单替换，应当属于本发明揭露的范围。
序列表
<110>东北农业大学
<120>用于检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因的多重pcr引物组、试剂盒及检测方法
<160>10
<170>patent-in3.5
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>1
atttcaatggttcggtcg18
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>2
gattgctacgttcagcggagcg22
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>3
aaacactgctagctattatc20
<210>4
<211>21
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>4
ataagtgactaagaaggatgc21
<210>5
<211>21
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>5
acttctaatctgtcgcaaacc21
<210>6
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<212>dna
<213>artificialsequence
<400>6
gaacgaatagtcattactgcac22
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>7
atcagcggcagtatctggtt20
<210>8
<211>18
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>8
gaggtcatcccaattgtg18
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<213>artificialsequence
<400>9
ggtgatgatgattagtgatgtg22
<210>10
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<212>dna
<213>artificialsequence
<400>10
tgttgcccccactgaga17