本发明属于生物技术领域，具体涉及一种nk细胞表面修改的免疫检查点抑制剂及其应用。
背景技术
自然杀伤细胞(简称nk细胞)是人体中参与免疫反应的一类淋巴细胞，在人体免疫监视中占有重要地位，是机体识别自己和非己的关键效应细胞。作为先天免疫系统的一部分，nk细胞对异常细胞的反应很迅速，不同于b细胞和t细胞那样需要有一个免疫启动过程。nk细胞的这种固有性质对于保持机体对异常细胞的警戒状态非常重要。nk细胞主要通过识别细胞表面分子来确定自己和非己成分。一般情况下，正常机体细胞表面会表达第一类主要组织相容性复合体(mhci)来抑制nk细胞的杀伤作用。但是，异常细胞例如很多种癌变细胞表面常常缺乏mhci，但是其却能逃避nk细胞的免疫杀伤。研究发现，很多种癌变细胞表面唾液酸含量表达会异常增加，其通过与nk细胞表面的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-7(siglec-7)结合而抑制nk细胞的杀伤作用，逃避了正常的免疫监视过程，获得了免疫耐受。
唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-7(siglec-7)是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素家族的重要成员，其主要表达于人nk细胞，、单核细胞和部分cd8+t细胞表面。siglec-7是i型跨膜蛋白，胞外区由一个能结合唾液酸的n端免疫球蛋白结构域v区和两个免疫球蛋白结构域c2区构成，经过一个跨膜区，胞内区由两个免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)组成。因此siglec-7是一类抑制性受体，当其与相应的配体产生相互作用时，itim在src激酶催化下发生磷酸化，进一步招募抑制性磷酸酶类shp-1/2，向胞内传递抑制性信号。siglec-7主要通过两种方式与相应的配体发生相互作用，第一种是顺式相互作用，nk细胞表面的siglec-7可以与nk细胞表面的唾液酸结构相结合，另一种是反式相互作用，nk细胞表面的siglec-7也可以与非nk细胞表面的配体相结合。
唾液酸作为siglec-7的配体，在很多癌细胞表面的大量表达，其通过反式相互作用与nk细胞表面的siglec-7结合，启动了nk细胞内部的抑制信号通路，抑制了nk细胞的免疫杀伤功能。因此，肿瘤细胞表面的唾液酸可以看作一类新型的免疫检查点，通过阻止肿瘤表面的唾液酸与nk细胞表面的siglec-7的结合就能增强nk细胞对肿瘤细胞的监视，并释放nk细胞的杀伤功能，清除肿瘤。目前已有报道siglec-7抗体可有效促进nk细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。但是采用抗体治疗技术门槛较高，成本昂贵，不能使大部分癌症患者受益，如何研发出高效而低廉的siglec-7小分子抑制剂一直是人们所关注的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种nk细胞表面修改的免疫检查点抑制剂。
本发明的另一目的在于提供上述nk细胞表面修改的免疫检查点抑制剂的应用。
本发明的技术方案如下：
一种nk细胞表面修改的免疫检查点抑制剂，其结构式如下：
其中r为磺酰基、甲酰基、烷酰基、环烷酰基、芳香酰基、杂芳香酰基、烃基、芳基、环烃基或杂芳基。
在本发明的一个优选实施方案中，所述r包含至少一未饱和键。
在本发明的一个优选实施方案中，其结构式如下：
一种免疫检查点抑制剂在改造nk细胞中的应用，该免疫检查点抑制剂的结构式如下：
其中r为磺酰基、甲酰基、烷酰基、环烷酰基、芳香酰基、杂芳香酰基、烃基、芳基、环烃基或杂芳基。
在本发明的一个优选实施方案中，所述r包含至少一未饱和键。
在本发明的一个优选实施方案中，所述免疫检查点抑制剂的结构式如下：
一种nk细胞的改造方法，将nk细胞与免疫检查点抑制剂在培养基中共培养，使该免疫检查点抑制剂通过免疫细胞内正常代谢对免疫细胞的表面进行修饰，该免疫检查点抑制剂的结构式如下：
其中r为磺酰基、甲酰基、烷酰基、环烷酰基、芳香酰基、杂芳香酰基、烃基、芳基、环烃基或杂芳基。
在本发明的一个优选实施方案中，所述r包含至少一未饱和键。
在本发明的一个优选实施方案中，所述免疫检查点抑制剂的结构式如下：
本发明的有益效果是：本发明的nk细胞表面修改的免疫检查点抑制剂可经胞内代谢后呈递到nk细胞表面，通过顺式相互作用与siglec-7相互作用，从而抑制siglec-7与肿瘤细胞表面唾液酸的反式结合，在nk细胞与肿瘤细胞相互作用时释放nk细胞的杀伤活力。
附图说明
图1为本发明实施例2中的nk+细胞荧光定位分析图。
图2为本发明实施例2中的体外细胞毒性试验图。
图3为本发明实施例2种的nsg小鼠生存曲线图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
本实施例的制备路线如下：
包括如下步骤：
(1)tossiamethylester(2)的合成：将唾液酸(1)(15.0g，50mmol)、三氟乙酸(1ml)与无水甲醇(300ml)混合，将混合物在室温下搅拌至澄清。蒸发除去溶剂，得到唾液酸甲酯，为白色固体，无需进一步纯化。将固体与p2o5在真空干燥过夜，并与无水吡啶共蒸发两次以除去痕量的水，然后溶于无水吡啶(200ml)中。将溶液冷却至0℃，加入对甲苯磺酰氯(10.0g，53mmol)。将混合物加热至室温并搅拌过夜。减压加热除去溶剂，将残余物通过柱层析(20∶1etoac∶meoh)纯化，得到白色固体的tossiamethylester(2)(18.0g，38mmol)，产率为76％。
(2)n3siamethy１ester(3)：叠氮化钠(8.0g)，tossiamethylester(2)(14.0g，30mmol)加入dmf(150ml)中。将溶液加热至80℃过夜。完全除去溶剂，残余物通过柱层析(20∶1etoac∶meoh)纯化，得到n3siamethylester(3)，为浅黄色固体(8.5g，25mmol，83％)。
(3)将n3siamethylester(3)(3.0g，8.6mmol)、pd/c(300mg)与无水甲醇(100ml)混合均匀，加入乙酰氯调节至ph≈1-2；将混合物置于h2气氛下搅拌。通过tlc监测至反应完全时(≈12h)，将反应物过滤以除去催化剂。蒸发除去溶剂，将残余物、edc·hcl(2.0g，10.3mmol)、hobt(1.4g，10.3mmol)、三乙胺(3.6ml，25.8mmol)、化合物6(860mg，8.6mmol)与dmf(150ml)混合均匀。将混合物在黑暗中搅拌48h。蒸发除去溶剂，残余物通过柱层析(10∶1ch2cl2∶meoh)纯化，得到浅黄色固体产物(1.94g，4.8mmol，55％)。然后称取该浅黄色固体(2.7mg，6.6μmol)，将其溶于h2o(250μl)中，与溶于dmf(200μl)的5-叠氮荧光素(4.2mg，11.2μmol)混合。然后加入预先配置好的cui/ttta的dmf溶液(50μldmf，0.5mgcui，2.2mgttta)，室温下搅拌1h。加入50μl抗坏血酸钠(100mm)，继续反应2h，并用tlc监测反应进程，之后离心过柱(p-2柱，0.625×42.5cm)，将产物冻干后重溶于水中，除去不溶杂质，然后再将上清液进行过柱(c18柱，50％meohinh2o)，得到nk细胞表面修改的免疫检查点抑制剂(4)(3.8mg，4.95μmol，75％)。
实施例2
1本发明的nk细胞表面修改的免疫检查点抑制剂修饰nk细胞
抽取健康人体外周血，采用密度梯度离心对细胞进行初分离，然后采用nk细胞提取试剂盒(invitrogen，carlsbad，ca)对nk细胞进行进一步分离。采用流式细胞仪进行细胞分选，表型为nkp46+，cd3-，cd56+的细胞即为所需的nk细胞。分离后的细胞在imdm培养基(含10％人血清，1％非必须氨基酸，1％丙酮酸钠)中悬浮培养，之后更换为含100μm本发明的nk细胞表面修改的免疫检查点抑制剂的imdm培养基继续培养48h。更换培养基清洗三次，即得到本发明的nk细胞表面修改的免疫检查点抑制剂修饰的nk细胞(命名为nk+)。保持细胞密度约2×106个/ml。在进行其它实验前，需要将nk细胞在100iu/ml的白细胞介素-2中培养24h。采用共聚焦显微镜对经本发明的nk细胞表面修改的免疫检查点抑制剂修饰的nk细胞做定位分析。结果如图1所示。
从图1可以看出，经本发明的nk细胞表面修改的免疫检查点抑制剂修饰后的nk细胞(nk+细胞)表面有fitc的绿色荧光，表明本发明的nk细胞表面修改的免疫检查点抑制剂可以有效的经胞内唾液酸代谢途径呈递到nk细胞表面，这对于加强siglec-7与细胞表面配体的顺式结合非常重要。
2体外细胞毒性试验
将k562细胞、hela细胞及721.221细胞分别与nk细胞或nk+细胞以数量比1∶20的比例混合，然后在37℃培养箱中共孵育24h后，用乳酸脱氢酶检测试剂盒检测上清液中乳酸脱氢酶的含量，参照空白组计算细胞毒性。结果如图2所示。
乳酸脱氢酶ldh是存在于细胞质的一种酶，当细胞膜受到损伤时，ldh会释放到培养基中，nk细胞与靶细胞结合时，会释放穿孔素及nk细胞毒因子等，破坏靶细胞膜，从而造成ldh的释放，因此检测培养基中ldh的含量即可显示nk细胞的杀伤毒性。k562细胞是一种人类髓性白血病细胞，其细胞表面唾液酸含量高表达；hela细胞是人宫颈癌细胞，其细胞表面唾液酸含量高表达；721.221细胞是一种白血病细胞株，其表面唾液酸含量低表达。从上图可以看出，经化合物修饰后的nk+细胞对唾液酸高表达的k562和hela细胞的杀伤活力显著提高。这是因为经化合物修饰后的nk+细胞表面的siglec-7的顺式结合作用增强了，抑制了其通过反式结合癌细胞表面的唾液酸，这样可以有效释放nk细胞的杀伤活力。而对唾液酸低表达的721.221无影响，因为其对nk细胞的抑制作用不明显，因此采用修饰后的nk+细胞仍对其有较高的杀伤活性，并无明显提升。
3对白血病小鼠模型的治疗效果
对6-8周大的nsg小鼠尾静脉注射1×103个raji细胞，构建白血病小鼠模型，然后从第三天开始，每隔两天通过尾静脉注射1×107个nk细胞或者经化合物修饰后的nk+细胞。空白小鼠通过尾静脉注射pbs。每组15只小鼠，观察小鼠存活率。结果如图3所示。
从图3可以看出，白血病小鼠模型建立后小鼠最长存活期为20天左右，尾静脉输入nk细胞后可以稍微延长nsg小鼠的存活率，而尾静脉输入经化合物修饰后的nk细胞后可将nsg小鼠的最长存活期延长至38天左右。这显示经化合物修饰后的nk+细胞可以有效的限制癌细胞对其杀伤活力的抑制作用，释放nk细胞自身的杀伤活力，从而充分发挥nk细胞自身的免疫监视作用，造成对体内白血病细胞良好的追踪杀灭效果，其对于进一步的临床试验具有很好的借鉴意义。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。