一种降解有机质蜡样芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高效降解水体有机质的蜡样芽孢杆菌yb1806及其应用。

背景技术

我国是渔业大国，养殖行业产量居世界首位。20世纪以来，我国水产行业的养殖规模、产量以及集约化程度飞速提高，包括投饵养殖在内的饲养行为带来的水体内源性污染日益严重，造成生态恶化及环境污染。在养殖过程中，水生动物排泄物以及剩余的饵料不断积累，当超过水体自净化速度时，水中的溶解氧下降，氨氮、亚硝酸态氮上升，鱼类病原菌大量繁殖，进而导致疾病频发、水生动物生长发育异常等后果，给我国的水产养殖行业造成了巨大经济损失。养殖水体去污的常用方法包括物理、化学和综合处理等。但是，物化处理方法容易带来二次污染，并且会破坏生态环境的稳定性。微生物是养殖水体中的分解者，对水产养殖所产生的残饵、养殖生态排泄物、浮游动植物的残体都有降解作用。异养细菌能够将高分子有机物如脂肪、蛋白质、淀粉等分解成小分子有机物，最终转化为可被藻类和其他生物利用的无机物，实现水体有机质的降解。

细菌性疾病也是制约水产养殖业发展的重要因素，常见的水产病原菌包括嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华菌，能引起鱼类红鳃病、腐皮病等。抗生素类药物一直都是防治细菌性疾病的主要手段。但是，抗生素的滥用和不规范使用诱发病原菌产生多重耐药性，同时还会在水生动物、水体中药物残留，严重威胁了人类健康、食品安全、养殖环境以及生态环境。当今，我国人民的生活水平不断提高，食品安全和健康意识不断加强，传统的水产养殖业为了片面追求产量和经济利益从而无节制地使用抗生素、化学药物已经阻碍了养殖行业的发展。因此，寻求抗生素的替代品用于水产养殖具有十分重要的意义。研究发现，大多数鱼类病原菌中均存在群体感应机制，利用该机制能够降低细菌毒力因子、生物膜等产生，从而降低细菌的致病性。关于群体感应淬灭酶产生菌的研究一直都备受关注。天然、无污染、无残留的生物防治和生物修复是水产养殖业是水产养殖行业未来的发展方向，也是可持续发展和水产品质量安全的关键保障。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一株从中国江苏省南黄海沿岸的潮汐带鱼塘淤泥中筛选出的，能够高效降解有机质的蜡样芽孢杆菌，菌株号为yb1806，拉丁名称为bacilluscereus，菌株yb1806于2018年06月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno：15979。

所述的蜡样芽孢杆菌yb1806菌学特性描述如下：

依据《伯杰氏细菌鉴定手册》，菌株yb1806菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，形成芽孢；细菌生理生化鉴定结果如表1。该菌株是需氧菌，有运动性，氧化酶，接触酶，明胶液化，淀粉水解和柠檬酸盐试验结果为阳性。

表1是蜡样芽孢杆菌yb1806生理生化鉴定结果

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从菌株yb1806的纯培养物中提取基因组dna，使用细菌16srrna基因扩增特定上游引物(27f5'-agagtttgatcmtggctcag-3')和下游引物(1492r5'-cggttaccttgttacgactt-3')，通过pcr扩增和测序分析得到16srrna序列。其序列如图1所示。通过genbank中的blast软件将得到16srrna序列与genbank数据库中的序列进行比对，菌株yb1806的部分16srrna基因序列与芽孢杆菌属菌株16srrna有较高的相似性(图2)，属于芽孢杆菌属。

将不同的底物加入lb(luriabroth)琼脂中，通过琼脂扩散法检测该菌株产胞外酶的活性。加入1％(m/v)的脱脂奶粉检测蛋白酶活性，加入2％(m/v)的可溶性淀粉检测淀粉分解活性，加入2％(m/v)的羧甲基纤维素钠盐(cmc-na)检测纤维素分解活性，加入spiritblue琼脂(sba)(hi-media，mumbai，india)检测脂肪酶活性。在28℃孵育24h后观察接种于平板上的菌株的酶活。脱脂牛奶平板上接种物周围形成水解脱脂奶粉后的透明圈(图2a)，表明该菌株具有较高的蛋白降解活性；spiritblue琼脂平板上接种物周围形成蓝色的光晕圈(图2b)，表明该菌株具有较高的脂肪降解活性。检测淀粉水解活性时，在室温下用1％碘溶液覆盖平板，接种物周围有透明圈(图2c)，结果为阳性，表明该菌株具有较高的淀粉水解活性。检测纤维素降解活性时，将平板板用刚果红溶液(0.1％)覆盖10分钟，然后用1nnaoh溶液洗涤脱色。接种物周围出现透明圈(图2d)，表明该菌株有较好的纤维素降解能力。

对菌株bacilluscereusyb1806降解有机质的作用进行研究表明：菌株yb1806在实验室条件下对有机质降解效率如图3所示。通过化学需氧量(cod)评估yb1806对有机物的降解效率。结果表明：经过14天的降解处理，yb1806对cod的去除率均达到79.69％以上。实验组cod在6d内迅速下降，达到19.5±2.84mg/l，在第14天达到13.2±4.08mg/l。菌株yb1806对水体有机质具有高效的降解作用。因此本发明的第二个目的是提供贝莱斯芽孢杆菌yb1806在降解有机质中的应用。

附图说明

图1是蜡样芽孢杆菌yb1806在16srrna系统发育树中位置图。

图2是蜡样芽孢杆菌yb1806水解蛋白情况(a)、降解脂肪情况(b)、水解淀粉情况(c)、降解纤维素情况(d)(图中6号菌为yb1806)。

图3是蜡样芽孢杆菌yb1806对养殖污水的降解效率(cod)。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

蜡样芽孢杆菌yb1806的菌株来源、菌株分离鉴定

所述的蜡样芽孢杆菌yb1806是通过下列具体分离步骤获得：

a样品采集：从中国江苏省黄海南部沿岸十处潮汐带和鱼塘采集淤泥样品(共十个样品)，每个样品(约100g)置于带有冰袋的无菌塑料袋中，10小时内运输至实验室，4℃低温保存备用；

b菌株分离：称取采集的样品约10g，加入90ml0.9％无菌生理盐水，37℃、220r/min震荡摇匀15min，取出1ml加入9ml无菌水充分震荡成10^-2的样品稀释液，依次梯度稀释，得到10^-4稀释液。每个样品取100μl稀释液均匀涂布于蛋白酶筛选培养基平皿，每个处理设3个重复。

c纯化培养：将上述平皿在28℃下孵育24-48小时，挑取有蛋白溶解圈的单菌落至lb固体培养基平皿上，采用划线分离的方法进行纯化，置入30℃培养箱中恒温培养直至长出单菌落，将纯化培养后的单菌落再转接至lb液体培养基，在旋转式摇床220rpm转速下，30℃培养24h，分别用淀粉酶筛选培养基、纤维素酶筛选培养基、spiritblue琼脂(sba)(hi-media，mumbai，india)培养基、群体感应淬灭酶筛选培养基检测菌株淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶和群体感应淬灭酶活性。选取具有上述酶活的菌株接种至含有lb培养基的斜面管内，继续于30℃培养箱中恒温培养3-7天，得到单菌落斜面管，4℃保存备用；

步骤b所述的蛋白酶筛选培养基，其配方为：胰化蛋白胨1g/100ml，酵母提取物0.5g/100ml，nacl1g/100ml，脱脂奶粉1g/100ml，琼脂1.5g/100ml，ph值7.3。

步骤c所述的lb液体培养基，其配方为：胰化蛋白胨1g/100ml，酵母提取物0.5g/100ml，nacl1g/100ml，ph值7.3。

步骤c所述的lb固体培养基，其配方为：向lb液体培养基中加入1.5g/100ml的琼脂。

步骤c所述的淀粉酶筛选培养基，其配方为：向lb固体培养基中加入2g/100ml的可溶性淀粉。

步骤c所述的纤维素酶筛选培养基，其配方为：向lb固体培养基中加入2g/100ml的羧甲基纤维素钠盐(cmc-na)。

镜检结果表明：所述的菌株菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，形成芽孢。常规生理生化实验表明，该菌株为需氧菌，有运动性，氧化酶，接触酶，明胶液化，淀粉水解和柠檬酸盐试验呈阳性。

基因序列测定：从菌株yb1806的纯培养物中提取基因组dna，使用细菌16srrna基因扩增特定上游引物(27f5'-agagtttgatcmtggctcag-3')和下游引物(1492r5'-cggttaccttgttacgactt-3')，pcr扩增，1％琼脂糖电泳进行产物检测。扩增产物经纯化后，送交测序公司测序分析得到16srrna序列。其序列如seqidno.1所示。通过genbank中的blast软件将得到16srrna序列与genbank数据库中的序列进行比对，与各类芽孢杆菌属16srrna序列相似性为100％，所得16srrna序列提交至genbank。结合其生理生化和分子生物学鉴定结果，我们将其命名为蜡样芽孢杆菌yb1806，该菌株于2018年06月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，该菌株保藏编号为cgmccno：15979。

水产养殖废水有机物降解试验：

选用水族箱(90×55×45cm)中连续曝气的100l鲫鱼养殖废水作为试验对象。实验组使用饲料将初始化学需氧量(cod)调节至65.0mg/l，加入1×10⁸cfuml^-1的菌株yb1806的培养液使水族箱水样中菌含量为1×10⁵cfuml^-1。对照组不加入菌液，设三个重复。实验组在14天时对cod的去除率均高于79.69％。cod在6d内迅速下降，达到19.5±2.84mg/l，此后cod值稳步下降，第14天达到13.2±4.08mg/l，显著高于对照组。

序列表

<110>中国药科大学

<120>一种降解有机质蜡样芽孢杆菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1438

<212>dna

<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

gctatacatgcaagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcgga60

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