识别增强型亚稳态核酸适配体探针及在目标物质计数分析中的应用的制作方法

本发明属于核酸适配体探针技术领域，特别涉及识别增强型亚稳态核酸适配体探针及其在目标物质计数分析中的应用。

背景技术：

核酸适配体是一类具有分子识别性的功能核酸，是能够与靶分子高亲和力和高特异性结合的单链dna或rna。相比抗体，核酸适配体具有结构响应性、稳定和廉价等优势，它可以通过不依赖靶标分子抗原性的体外筛选过程高效获取，因此特别适用于构建只有低抗原性的小分子的高效识别元件。

然而核酸适配体和目标分子的结合效率是需要解决的关键问题，由于现有技术公开的核酸适配体探针难以既保持自身核酸结构的稳定性(双链杂交的解离常数kd值＜10^-9m)，又对弱结合力的目标分子的结合作用进行有效响应(适配体与目标分子作用的解离常数kd值一般在10^-5-10^-9m之间)，因此会导致核酸适配体探针对目标分子的识别效率低，只有高浓度的目标分子才能产生检测信号。为了提高核酸适配体探针对目标分子的响应性和识别效率，提升基于核酸适配体的传感分析方法的灵敏度和准确定量性，势必需要设计和合成新的核酸适配体探针。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供识别增强型亚稳态核酸适配体探针，以提高对目标分子的响应性和识别效率。本发明的再一目的是提供识别增强型亚稳态核酸适配体探针在目标物质计数分析中的应用，以提升基于核酸适配体的传感分析方法的灵敏度和准确定量性。

本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针，其熔炼温度tm低于45℃，为末端互补的发卡形结构，包括双链的茎部和单链的环部，所述茎部互补碱基小于5个；当有目标物质存在时，该核酸适配体探针能够与目标物质结合，并进而打开其末端茎部，通过phi29dna聚合酶的作用引发滚环扩增反应，当无目标物质存在时，该核酸适配体探针形成闭合结构，并可通过延长末端茎部使其双链结构更稳定，不能在phi29dna聚合酶的作用下引发滚环扩增反应，从而降低背景信号。

本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针，优选下述三种：

第一种识别增强型亚稳态核酸适配体探针，核苷酸序列为序列表中seqidno：1所述，其可结合的目标物质为赭曲霉毒素a，命名为rmsapt-ota。

第二种识别增强型亚稳态核酸适配体探针，核苷酸序列为序列表中seqidno：2所述，其可结合的目标物质为卡那霉素，命名为rmsapt-kana。

第三种识别增强型亚稳态核酸适配体探针，核苷酸序列为序列表中seqidno：3所述，其可结合的目标物质为l-酪氨酸胺，命名为rmsapt-l-tyrosinamide。

本发明通过实验证明，上述识别增强型亚稳态核酸适配体探针可在目标物质计数分析中应用，实现适配体与目标分子作用解离常数kd值在10^-5-10^-9m之间的目标分子高灵敏检测。

本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针在目标物质计数分析中的应用，步骤如下：

(1)制备用于滚环扩增的环形探针

将成环探针进行磷酸化反应，然后在连接酶的作用下将磷酸化反应后的成环探针连接成封闭的环形探针，再加入核酸外切酶切掉多余的碱基片段获得纯净的封闭环形探针，继后将含封闭环形探针的体系加热到75～85℃保持15～20min使连接酶和核酸外切酶失活；

(2)建立目标物质计数分析用的标准曲线

配制一系列不同浓度待测目标物质标准品的水溶液，然后将不同浓度待测目标物质标准品的水溶液分别与退火处理后的识别增强型亚稳态核酸适配体探针、phi29dna聚合酶缓冲溶液、延长酶和dntps混合均匀并在常温下静置50～60min，进行目标物质识别，并打开识别增强型亚稳态核酸适配体探针末端茎部的双链互补结构，再加入phi29dna聚合酶、步骤(1)制备的环形探针进行滚环扩增，滚环扩增完成后在60～65℃保持8～10min使phi29dna聚合酶失活终止反应，继后加入荧光染料yoyo-1进行dna染色，并用荧光显微镜对所述核酸适配体探针扩增产物进行成像和计数分析，建立以成像视野内核酸适配体探针扩增产物计数为纵坐标、待测目标物质浓度为横坐标的标准曲线；

(3)实际样品所含目标物质的计数分析

将待测实际样品与退火处理后的识别增强型亚稳态核酸适配体探针、phi29dna聚合酶缓冲溶液、延长酶和dntps混合均匀并在常温下静置50～60min，进行目标物质识别，并打开识别增强型亚稳态核酸适配体探针末端茎部的双链互补结构，再加入phi29dna聚合酶、步骤(1)制备的环形探针进行滚环扩增，滚环扩增完成后在60～65℃保持8～10min使phi29dna聚合酶失活终止反应，继后加入荧光染料yoyo-1进行dna染色，并用荧光显微镜对所述核酸适配体探针扩增产物进行成像和计数分析，将计数结果对照标准曲线即可得到实际样品所含目标分子物质的浓度。

上述应用中，所述目标物质为赭曲霉毒素a时，识别增强型亚稳态核酸适配体探针为rmsapt-ota，它的核苷酸序列为序列表中seqidno：1所述，成环探针的核苷酸序列为序列表中seqidno：4所述，命名为circularprobe-1。

上述应用中，所述目标物质为卡那霉素时，识别增强型亚稳态核酸适配体探针为rmsapt-kana，它的核苷酸序列为序列表中seqidno：2所述，成环探针的核苷酸序列为序列表中seqidno：4所述，命名为circularprobe-1。

上述应用中，所述目标物质为l-酪氨酸胺时，识别增强型亚稳态核酸适配体探针为rmsapt-l-tyrosinamide，它的核苷酸序列为序列表中seqidno：3所述，成环探针的核苷酸序列为序列表中seqidno：5所述，命名为circularprobe-2。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供的识别增强型亚稳态核酸适配体探针，为核酸适配体增加了新的种类。

2、将本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针用于目标物质的计数分析，可提升适配体探针对目标分子的响应灵敏性和识别效率，实验表明，本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针用于目标物质的计数分析，回收率高，可达88％～110％(见实施例7、8、9)。

3、实验表明，本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针用于计数分析，对目标物质选择性好，抗干扰能力强(见实施例7、8、9和对比例1、2、3)。

4、将本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针用于目标物质的计数分析，整个过程在均相体系中完成，操作大大简化，克服了传统分析检测方法中样品清理及富集的过程使得操作复杂、测试周期长等问题，并可减少样品异质性和前处理操作的差异等因素造成检测结果的误差。

附图说明

图1是本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt在目标物质计数分析中应用的反应示意图。

图2是本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-ota用于赭曲霉毒素a计数分析的标准曲线。

图3是本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-ota在计数分析中的选择性实验结果图。

图4是本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-kana用于卡那霉素计数分析的标准曲线。

图5是本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-kana在计数分析中的选择性实验结果图。

图6是本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-l-tyrosinamide用于l-酪氨酸胺计数分析的标准曲线。

图7是本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-l-tyrosinamide在计数分析中的选择性实验结果图。

图8是本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-ota、rmsapt-kana、rmsapt-l-tyrosinamide分别用于红酒所含赭曲霉毒素a、血清所含卡那霉素、血清所含l-酪氨酸胺计数分析的回收率结果图。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图对本发明所述识别增强型亚稳态核酸适配体探针及其在目标物质计数分析中的应用作进一步说明。

下述实施例中，t4磷酸化酶缓冲溶液(10×t4polynucleotidekinasereactionbuffer)、t4磷酸化酶(t4polynucleotidekinase)、t4连接酶缓冲溶液(10×t4dnaligasereactionbuffer)、t4dna连接酶(dnaligase(5u/μl))、核酸外切酶(exonucleasei和exonucleaseiii)、phi29dna聚合酶缓冲溶液(10×phi29buffer)、延长酶(klenowfragment,exo-(5u/μl))、dntps(10mmforeachofdatp,dgtp,dctpanddttp)、phi29dna聚合酶(phi29dnapolymerase(10u/μl))、荧光染料yoyo-1、atp(10mm)和2×ssc缓冲溶液购自赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)公司；赭曲霉毒素a、卡那霉素、赭曲霉毒素b、黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、购自艾博抗上海贸易有限公司和北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；荧光显微镜的型号为徕卡tcssp5共聚焦显微镜，由德国莱卡公司生产；链霉素、磺胺地索辛、氨苄青霉素、四环素及d-酪氨酸胺、l-酪氨酸、l-酪氨酸、l-苯丙氨酸、d-酪氨酸购自上海麦克林生化科技有限公司。

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：识别增强型亚稳态核酸适配体探针和成环探针的设计与合成

本实施例利用https://sg.idtdna.com/calc/analyzer和http://www.nupack.org网站，通过核酸杂交热力学辅助计算，构建低势能变化的核酸变构(识别前和识别后的探针核酸结构具有低的能量差异)，设计与赭曲霉毒素a、卡那霉素、l-酪氨酸胺相对应的核酸适配体相连的引物和用于滚环扩增的互补成环探针。所设计的各探针如下：

(1)识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-ota，茎部互补碱基为4个，熔炼温度tm＝32.5℃，核苷酸序列为序列表中seqidno：1所述，在赭曲霉毒素a计数分析中应用。

(2)识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-kana，茎部互补碱基为4个，熔炼温度tm＝39.1℃，核苷酸序列为序列表中seqidno：2所述，在卡那霉素计数分析中应用。

(3)识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-l-tyrosinamide，茎部互补碱基为4个，熔炼温度tm＝38.9℃，核苷酸序列为序列表中seqidno：3所述，在l-酪氨酸胺计数分析中应用。

(4)成环探针circularprobe-1，核苷酸序列为序列表中seqidno：4所述，制备成环形探针后，用于识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-ota和rmsapt-kana的滚环扩增。

(5)成环探针circularprobe-2，核苷酸序列为序列表中seqidno：5所述，制备成环形探针后，用于识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-l-tyrosinamide的滚环扩增。

将所设计的上述核苷酸序列交由专业合成公司——生工生物工程(上海)股份有限公司委托其合成，从该公司取得识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-ota、rmsapt-kana、rmsapt-l-tyrosinamide及成环探针circularprobe-1、circularprobe-2。

实施例2：以成环探针circularprobe-1制备滚环扩增用的环形探针

本实施例的步骤如下：

(1)在200μl离心管中，加入2μlt4磷酸化酶缓冲溶液(10×t4polynucleotidekinasereactionbuffer)、13μl去离子水、2μl成环探针circularprobe-1(浓度100μm)、2μlatp(浓度10mm)和1μlt4磷酸化酶(t4polynucleotidekinase(10u/μl))并混合均匀，然后在37℃静置2h及以上完成磷酸化反应；

(2)取2μl步骤(1)完成磷酸化反应所得产物、2μlt4连接酶缓冲溶液(10×t4dnaligasereactionbuffer)、15μl去离子水和1μlt4dna连接酶(dnaligase(5u/μl))并混合均匀，然后在25℃保温2h，将成环探针连接成封闭状态，再加热到65℃保温10min使t4dna连接酶失活；

(3)在步骤(2)所得产物中加入核酸外切酶exonucleasei和exonucleaseiii(exonucleasei的加入量为1μl，exonucleaseiii的加入量为0.5μl)，切掉多余的碱基片段，获得纯净的封闭环状探针，将含封闭环状探针的体系加热到80℃保温20min，使核酸外切酶失活终止反应，然后在-20℃储存备用。

实施例3：以成环探针circularprobe-2制备滚环扩增用的环形探针

本实施例的步骤与实施例2相同，除在步骤(1)中将成环探针circularprobe-1替换为成环探针circularprobe-2外，所用各种酶及化学试剂均与实施例2相同。

实施例4：建立用于赭曲霉毒素a计数分析的标准曲线

本实施例的步骤如下：

(1)用去离子水和赭曲霉毒素a配制八种不同浓度的赭曲霉毒素a溶液，各赭曲霉毒素a溶液的浓度分别为50fm、100fm、500fm、2500fm、12500fm、62500fm、125000fm、250000fm；

(2)把溶解在2×ssc缓冲溶液中的识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-ota加热到95℃保温5min，然后关闭电源自然冷却至室温完成退火；

(3)将八种不同浓度的赭曲霉毒素a溶液各取3μl分别装入八只试管中，然后向八只试管中分别加入3μl退火后的rmsapt-ota(浓度1μm)、3μlphi29dna聚合酶缓冲溶液(10×phi29buffer)、11μl去离子水、0.5μl延长酶(klenowfragment,exo-(5u/μl))和3μldntps(10mmforeachofdatp,dgtp,dctpanddttp)并混合均匀，在25℃保温1h进行赭曲霉毒素a识别，并打开rmsapt-ota末端茎部的双链互补结构；

(4)向八只试管中分别加入0.3μlphi29dna聚合酶(phi29dnapolymerase(10u/μl))和3μl实施例2制备好的环状探针并混合均匀，然后在30℃保温1h进行rmsapt-ota滚环扩增，扩增完成后加热至65℃保温10min使phi29dna聚合酶失活，终止反应；

(5)向八只试管中分别加入1.3μlyoyo-1(浓度100nm)进行dna染色，然后用荧光显微镜进行成像和计数分析，建立以成像视野内rmsapt-ota扩增产物计数为纵坐标，赭曲霉毒素a浓度为横坐标的标准曲线，如图2所示。

实施例5：建立用于卡那霉素计数分析的标准曲线

本实施例的步骤如下：

(1)用去离子水和卡那霉素配制六种不同浓度的卡那霉素溶液，各卡那霉素溶液的浓度分别为2×10^-14m、4×10^-14m、2×10^-13m、1×10^-12m、5×10^-12m、1×10^-11m；

(2)把溶解在2×ssc缓冲溶液中的识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-kana加热到95℃保温5min，然后关闭电源自然冷却至室温完成退火；

(3)将六种不同浓度的卡那霉素溶液各取3μl分别装入六只试管中，然后向六只试管中分别加入3μl退火后的rmsapt-kana(浓度1μm)、3μlphi29dna聚合酶缓冲溶液(10×phi29buffer)、11μl去离子水、0.5μl延长酶(klenowfragment,exo-(5u/μl))和3μldntps(10mmforeachofdatp,dgtp,dctpanddttp)并混合均匀，在25℃保温1h进行卡那霉素识别，并打开rmsapt-kana末端茎部的双链互补结构；

(4)向六只试管中分别加入0.3μlphi29dna聚合酶(phi29dnapolymerase(10u/μl))和3μl实施例2制备好的环状探针并混合均匀，然后在30℃保温1h进行rmsapt-kana滚环扩增，扩增完成后加热至65℃保温10min使phi29dna聚合酶失活，终止反应；

(5)向六只试管中分别加入1.3μlyoyo-1(浓度100nm)进行dna染色，然后用荧光显微镜进行成像和计数分析，建立以成像视野内rmsapt-kana扩增产物计数为纵坐标，卡那霉素浓度为横坐标的标准曲线，如图4所示。

实施例6：建立用于l-酪氨酸胺计数分析的标准曲线

本实施例的步骤如下：

(1)用去离子水和l-酪氨酸胺配制六种不同浓度的l-酪氨酸胺溶液，各l-酪氨酸胺溶液的浓度分别为5×10^-11m、1×10^-10m、5×10^-10m、2.5×10^-9m、1.25×10^-8m、6.25×10^-8m；

(2)把溶解在2×ssc缓冲溶液中的识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-l-tyrosinamide加热到95℃保温5min，然后关闭电源自然冷却至室温完成退火；

(3)将六种不同浓度的l-酪氨酸胺溶液各取3μl分别装入六只试管中，然后向六只试管中分别加入3μl退火后的rmsapt-l-tyrosinamide(浓度1μm)、3μlphi29dna聚合酶缓冲溶液(10×phi29buffer)、11μl去离子水、0.5μl延长酶(klenowfragment,exo-(5u/μl))和3μldntps(10mmforeachofdatp,dgtp,dctpanddttp)并混合均匀，在25℃保温1h进行l-酪氨酸胺识别，并打开rmsapt-l-tyrosinamide末端茎部的双链互补结构；

(4)向六只试管中分别加入0.3μlphi29dna聚合酶(phi29dnapolymerase(10u/μl))和3μl实施例3制备好的环状探针并混合均匀，然后在30℃保温1h进行rmsapt-l-tyrosinamide滚环扩增，扩增完成后加热至65℃保温10min使phi29dna聚合酶失活，终止反应；

(5)向六只试管中分别加入1.3μlyoyo-1(浓度100nm)进行dna染色，然后用荧光显微镜进行成像和计数分析，建立以成像视野内rmsapt-l-tyrosinamide扩增产物计数为纵坐标，l-酪氨酸胺浓度为横坐标的标准曲线，如图6所示。

实施例7：红酒样品所含赭曲霉毒素a的计数分析

本实施例的步骤如下：

(1)在红酒中加入赭曲霉毒素a，配制三种不同赭曲霉毒素a浓度的红酒样品，各红酒样品中赭曲霉毒素a的浓度分别为0.1pm、1pm、10pm；

(2)把溶解在2×ssc缓冲溶液中的识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-ota加热到95℃保温5min，然后关闭电源自然冷却至室温完成退火；

(3)将三种不同浓度赭曲霉毒素a的红酒样品各取3μl分别装入三只试管中，然后向三只试管中分别加入3μl退火后的rmsapt-ota(浓度1μm)、3μlphi29dna聚合酶缓冲溶液(10×phi29buffer)、11μl去离子水、0.5μl延长酶(klenowfragment,exo-(5u/μl))和3μldntps(10mmforeachofdatp,dgtp,dctpanddttp)并混合均匀，在25℃保温1h进行赭曲霉毒素a识别，并打开rmsapt-ota末端茎部的双链互补结构；

(4)向三只试管中分别加入0.3μlphi29dna聚合酶(phi29dnapolymerase(10u/μl))和3μl实施例2制备好的环状探针并混合均匀，然后在30℃保温1h进行rmsapt-ota滚环扩增，扩增完成后加热至65℃保温10min使phi29dna聚合酶失活，终止反应；

(5)向三只试管中分别加入1.3μlyoyo-1(浓度100nm)进行dna染色，然后用荧光显微镜进行成像和计数分析，将计数结果对照实施例4建立的标准曲线(见图2)，得到三种红酒样品中所含赭曲霉毒素a的浓度，然后分别计算三种红酒样品计数分析的回收率，计算结果见图8。

对比例1：rmsapt-ota用于计数分析的抗干扰、选择性实验

本对比例分别配制了浓度为10pm赭曲霉毒素b、黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、酪氨酸红酒样品，并准备了空白样品(纯红酒)进行实验。

(1)将含赭曲霉毒素b红酒样品、含黄曲霉毒素b1的红酒样品、含玉米赤霉烯酮的红酒样品、含酪氨酸的红酒样品和空白样品各取3μl分别装入五只试管中，然后向五只试管中分别加入3μl退火后的rmsapt-ota(浓度1μm)、3μlphi29dna聚合酶缓冲溶液(10×phi29buffer)、11μl去离子水、0.5μl延长酶(klenowfragment,exo-(5u/μl))和3μldntps(10mmforeachofdatp,dgtp,dctpanddttp)并混合均匀，在25℃保温1h；

(2)向五只试管中分别加入0.3μlphi29dna聚合酶(phi29dnapolymerase(10u/μl))和3μl实施例2制备好的环状探针并混合均匀，然后在30℃保温1h进行rmsapt-ota滚环扩增，扩增完成后加热至65℃保温10min使phi29dna聚合酶失活，终止反应；

(3)向五只试管中分别加入1.3μlyoyo-1(浓度100nm)进行dna染色，然后用荧光显微镜进行成像和计数分析，计数分析结果见图3，从图3可以看出，rmsapt-ota用于计数分析，对赭曲霉毒素a选择性好，抗干扰能力强。

实施例8：血清样品所含卡那霉素的计数分析

本实施例的步骤如下：

(1)在血清中加入卡那霉素，配制三种不同卡那霉素浓度的血清样品，各血清样品中卡那霉素的浓度分别为10fm、100fm、1pm；

(2)把溶解在2×ssc缓冲溶液中的识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-kana加热到95℃保温5min，然后关闭电源自然冷却至室温完成退火；

(3)将三种不同浓度的血清样品各取3μl分别装入三只试管中，然后向三只试管中分别加入3μl退火后的rmsapt-kana(浓度1μm)、3μlphi29dna聚合酶缓冲溶液(10×phi29buffer)、11μl去离子水、0.5μl延长酶(klenowfragment,exo-(5u/μl))和3μldntps(10mmforeachofdatp,dgtp,dctpanddttp)并混合均匀，在25℃保温1h进行卡那霉素识别，并打开rmsapt-kana末端茎部的双链互补结构；

(4)向三只试管中分别加入0.3μlphi29dna聚合酶(phi29dnapolymerase(10u/μl))和3μl实施例2制备好的环状探针并混合均匀，然后在30℃保温1h进行rmsapt-kana滚环扩增，扩增完成后加热至65℃保温10min使phi29dna聚合酶失活，终止反应；

(5)向三只试管中分别加入1.3μlyoyo-1(浓度100nm)进行dna染色，然后用荧光显微镜进行成像和计数分析，将计数结果对照实施例5建立的标准曲线(见图4)，得到三种血清样品中所含卡那霉素的浓度，然后分别计算三种血清样品计数分析的回收率，计算结果见图8。

对比例2：rmsapt-kana用于计数分析的抗干扰、选择性实验

本对比例分别配制了浓度为1pm的链霉素、磺胺地索辛、氨苄青霉素、四环素血清样品，并准备了空白样品(纯血清)进行实验。

(1)将含链霉素的血清样品、含磺胺地索辛的血清样品、含氨苄青霉素的血清样品、含四环素的血清样品和空白样品各取3μl分别装入五只试管中，然后向五只试管中分别加入3μl退火后的rmsapt-kana(浓度1μm)、3μlphi29dna聚合酶缓冲溶液(10×phi29buffer)、11μl去离子水、0.5μl延长酶(klenowfragment,exo-(5u/μl))和3μldntps(10mmforeachofdatp,dgtp,dctpanddttp)并混合均匀，在25℃保温1h；

(2)向五只试管中分别加入0.3μlphi29dna聚合酶(phi29dnapolymerase(10u/μl))和3μl实施例2制备好的环状探针并混合均匀，然后在30℃保温1h进行rmsapt-kana滚环扩增，扩增完成后加热至65℃保温10min使phi29dna聚合酶失活，终止反应；

(3)向五只试管中分别加入1.3μlyoyo-1(浓度100nm)进行dna染色，然后用荧光显微镜进行成像和计数分析，计数分析结果见图5，从图5可以看出，rmsapt-kana用于计数分析，对卡那霉素选择性好，抗干扰能力强。

实施例9：血清样品所含l-酪氨酸胺的计数分析

本实施例的步骤如下：

(1)在血清中加入l-酪氨酸胺，配制三种不同l-酪氨酸胺浓度的血清样品，各血清样品中l-酪氨酸胺的浓度分别为0.1nm、1nm、10nm；

(2)把溶解在2×ssc缓冲溶液中的识别增强型亚稳态核酸适配体探针rmsapt-l-tyrosinamide加热到95℃保温5min，然后关闭电源自然冷却至室温完成退火；

(3)将三种不同浓度的血清样品各取3μl分别装入三只试管中，然后向三只试管中分别加入3μl退火后的rmsapt-l-tyrosinamide(浓度1μm)、3μlphi29dna聚合酶缓冲溶液(10×phi29buffer)、11μl去离子水、0.5μl延长酶(klenowfragment,exo-(5u/μl))和3μldntps(10mmforeachofdatp,dgtp,dctpanddttp)并混合均匀，在25℃保温1h进行l-酪氨酸胺识别，并打开rmsapt-l-tyrosinamide末端茎部的双链互补结构；

(4)向三只试管中分别加入0.3μlphi29dna聚合酶(phi29dnapolymerase(10u/μl))和3μl实施例3制备好的环状探针并混合均匀，然后在30℃保温1h进行rmsapt-l-tyrosinamide滚环扩增，扩增完成后加热至65℃保温10min使phi29dna聚合酶失活，终止反应；

(5)向三只试管中分别加入1.3μlyoyo-1(浓度100nm)进行dna染色，然后用荧光显微镜进行成像和计数分析，将计数结果对照实施例6建立的标准曲线(见图6)，得到三种血清样品中所含l-酪氨酸胺的浓度，然后分别计算三种血清样品计数分析的回收率，计算结果见图8。

对比例3：rmsapt-l-tyrosinamide用于计数分析的抗干扰、选择性实验

本对比例分别配制了浓度为10nm的d-酪氨酸胺、l-酪氨酸、l-苯丙氨酸、d-酪氨酸血清样品，并准备了空白样品(纯血清)进行实验。

(1)将含d-酪氨酸胺的血清样品、含l-酪氨酸的血清样品、含l-苯丙氨酸的血清样品、含d-酪氨酸的血清样品和空白样品各取3μl分别装入五只试管中，然后向五只试管中分别加入3μl退火后的rmsapt-l-tyrosinamide(浓度1μm)、3μlphi29dna聚合酶缓冲溶液(10×phi29buffer)、11μl去离子水、0.5μl延长酶(klenowfragment,exo-(5u/μl))和3μldntps(10mmforeachofdatp,dgtp,dctpanddttp)并混合均匀，在25℃保温1h；

(2)向五只试管中分别加入0.3μlphi29dna聚合酶(phi29dnapolymerase(10u/μl))和3μl实施例3制备好的环状探针并混合均匀，然后在30℃保温1h进行rmsapt-l-tyrosinamide滚环扩增，扩增完成后加热至65℃保温10min使phi29dna聚合酶失活，终止反应；

(3)向五只试管中分别加入1.3μlyoyo-1(浓度100nm)进行dna染色，然后用荧光显微镜进行成像和计数分析，计数分析结果见图7，从图7可以看出，rmsapt-l-tyrosinamide用于计数分析，对l-酪氨酸胺选择性好，抗干扰能力强。

序列表

<110>四川大学

<120>识别增强型亚稳态核酸适配体探针及在目标物质计数分析中的应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>57

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

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