一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制作方法

本发明属于小分子荧光探针分析检测领域，具体涉及一种快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针。

背景技术：

β-半乳糖苷酶(β-gal)是一种能够将β-半乳糖苷水解成半乳糖和糖苷的酶。随着科学技术的快速发展，β-半乳糖苷酶在环境、生物、医学、化学、等领域的应用越来越多。在食品工业领域，利用β-半乳糖苷酶能够水解乳糖的性质来降低乳制品中的乳糖含量。在生物领域，β-半乳糖苷酶是一种被广泛应用的基因标记酶，可用来研究基因的转录调控和基因表达等。β-半乳糖苷酶基因是基因工程中最常用的报告基因，利用其表达产物β-半乳糖苷酶来研究目的基因的表达调控。最近报道的文献发现β-半乳糖苷酶与动物细胞的衰老有密切的关系。因此，在医学研究、基因诊断、生物免疫等方面，检测β-半乳糖苷酶活性显得十分重要。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，以gctpoc作为荧光团，通过β-半乳糖苷酶选择性脱去半乳糖基团来实现对β-半乳糖苷酶的荧光检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，简称为r-gal，其结构式如式（i）所示：

式（i）。

一种上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）4-三氨基酮酸和1,6-二羟基萘在三氟乙酸中，加热回流反应，蒸除溶剂得化合物1：

；

（2）β-d-半乳糖五乙酸酯与hbr在乙酸中室温反应，产物分离纯化得化合物2：

；

（3）化合物1与化合物2在na2so4和cs2co3存在下于乙腈中加热反应，产物分离纯化得化合物3：

；

（4）化合物3与甲醇钠在甲醇中室温反应，产物分离纯化得荧光探针：

。

步骤（1）中，反应温度为75℃，反应时间为12h。

步骤（2）中反应时间为1h。

步骤（2）中，分离纯化步骤为：产物加入等体积的二氯甲烷和冰，分层后水相用二氯甲烷萃取，有机层以nahco3和饱和食盐水分别洗涤，再以无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂。

步骤（3）中，反应温度为60℃，反应时间为24h。

步骤（3）中，分离纯化步骤为：产物蒸除溶剂得粗产品，再用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚=1:2（v/v）。

步骤（4）中，反应时间为4h。

步骤（4）中，分离纯化步骤为：产物蒸除溶剂得粗产品，再用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇=10:1（v/v）。

一种上述β-半乳糖苷酶探针的用途，该荧光探针可以应用于溶液或活细胞中β-半乳糖苷酶含量的检测。

本发明具有以下优点：

本发明的荧光探针的合成只需要几步就可以完成，且后处理过程相对简单；该探针可以实现β-半乳糖苷酶分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。此外，在紫外灯下可以观察到荧光颜色增强，是一种具有生色传感功能的荧光探针。基于其特异性且显著的颜色变化，该试剂可作为显示水溶液中和生物细胞内β-半乳糖苷酶存在的专一性指示剂。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的β-半乳糖苷酶特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例1中探针的¹hnmr图谱；

图2是探针随β-半乳糖苷酶浓度增加荧光谱图的变化图；

图3是探针对不同离子和分子的选择性荧光谱图；

图4是探针对不同离子和分子的选择性柱状图；

图5是探针在β-半乳糖苷酶加入前后溶液颜色对比图；

图6是探针应用于细胞中β-半乳糖苷酶的荧光成像图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1荧光探针的合成

（1）化合物1的合成：

4-三氨基酮酸（1eq），1,6-二羟基萘（1eq）溶于三氟乙酸中，75℃加热回流12h，减压旋干溶剂得化合物1，产率为92%；

（2）化合物2的合成：

β-d-半乳糖五乙酸酯（1eq，3.90g），溶于hbr（45%，10ml），acoh（5ml）中，室温搅拌1h。加入二氯甲烷（20ml）和冰（20g），分层，水相用二氯甲烷萃取，nahco3（30ml），饱和食盐水（30ml）洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得化合物2，产率95%；

（3）化合物3的合成：

化合物1（1eq），na2so4（2.5eq），cs2co3（5eq）溶于acn中，将化合物2（1.5eq）缓慢加入上述反应液中，60℃反应24小时，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:2，得化合物3，产率为55%；

（4）探针r-gal的合成：

化合物3（1eq）溶于甲醇中，加入溶于甲醇的甲醇钠（3eq），室温反应4小时，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/甲醇=10：1，得到荧光探针，产率为75%，¹hnmr谱图如图1所示。

实施例2荧光探针随β-半乳糖苷酶浓度升高荧光谱图的变化

取实施例1制备的荧光探针溶于二甲基亚砜（dmso）中，制成1mmol/l储备液。从储备液中取出20μl加入到5ml的离心管当中，加入不同单位（0-14u）的β-半乳糖苷酶标准溶液（80u/ml），用pbs缓冲溶液（0.1mol/l，ph=7.4）溶液稀释至2ml，测量其荧光性质（激发波长为540nm）。荧光光谱如图2所示。由图2可见，随着β-半乳糖苷酶加入量的增加荧光逐渐增强。

实施例3荧光探针对不同分子或离子的选择性

从实施例2中荧光探针储备液中取出20μl加入到5ml的离心管当中，分别加入竞争分子标准溶液（100eq），其中一个加入β-半乳糖苷酶溶液（4u），10min后检测溶液的荧光发射光谱变化，由图3和图4可以发现，其他离子对探针r-gal的荧光几乎没有影响，而β-半乳糖苷酶溶液的加入使探针r-gal的荧光显著增强。

实施例4荧光探针对β-半乳糖苷酶的可视化检测

从实施例2中荧光探针储备液中取出30μl加入到5ml的样品管当中，加入β-半乳糖苷酶标准溶液（40u），β-半乳糖苷酶可以使荧光探针的水溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色变深（图5）。伴随着紫外灯下肉眼可视的β-半乳糖苷酶诱导溶液颜色变化，说明是一种具有生色传感功能的荧光探针。

实施例5荧光探针对细胞内源性β-半乳糖苷酶的荧光成像

将实施例1中获得的探针应用于ovcar-3和hela细胞中对内源性的β-半乳糖苷酶进行荧光成像，具体操作步骤如下：将20μm探针dmso溶液加入到育有hela细胞以及的ovcar-3细胞培养液中在二氧化碳培养箱中培养50min后用共聚焦显微镜进行成像，如图6所示，其中，a）为探针浓度为1mm加入20μm到ovcar-3细胞中培养50min后明场图，b）为探针浓度为1mm加入20μm到ovcar-3细胞中培养50min后的荧光成像图，c）为a和b的叠加图。d）为探针浓度为1mm加入20μm到hela细胞中培养50min后的明场图，e）为探针浓度为1mm加入20μm到hela细胞中培养50min后的荧光成像图，f）为d和e的叠加图。由图6可知，以561nm为激发光，hela细胞中几乎无红色荧光，而ovcar-3细胞可以观察到有强烈的红色荧光，说明此荧光探针可以对内源性的β-半乳糖苷酶进行荧光成像。