一种NK细胞无血清培养基的制作方法

本发明涉及细胞培养的技术领域，尤其是一种nk细胞无血清培养基。

背景技术

nk细胞(naturalkillercells，nkcells)即自然杀伤细胞，是机体天然免疫系统的重要组成部分，也是抗病毒、抗肿瘤的重要组成细胞。研究表明，大多数肿瘤患者体内nk细胞数量下降和或nk细胞的清除癌细胞的能力下降，nk细胞表面活化受体和抑制受体的表达决定其抗肿瘤能力的强弱。肿瘤患者及肿瘤术后患者体内nk细胞的数量及活性都发生了一定的改变。肿瘤的发生、发展及转移与nk细胞的抗肿瘤免疫功能被抑制有密切的联系。

正常人体内nk细胞主要存在于外周血循环中，占nk细胞总数的90％。但nk细胞在外周血中的中的比例含量少(只约占淋巴细胞的5％-7％)，因此不管在实验研究还是临床治疗应用，nk细胞都必须进行体外培养和扩增，以达到理想的研究和治疗所需的状态。

目前，常见的nk细胞体外扩增和活化的方案中，为了提高扩增效果，使用添加了动物血清(如fbs)的培养基。但是动物血清成分复杂，且不同批次的动物血清难以做到一致性和稳定性，还可能会带来支原体、细菌、病毒或蛋白传染性疾病等污染。另外动物血清带来的异种蛋白，也会增加nk细胞在临床应用中的风险，异种蛋白会引起免疫反应、过敏反应和炎性反应等免疫排斥反应。因此含血清的细胞培养基限制了nk细胞在临床上的应用。

为适应临床应用的需要，利用无血清培养基(或者在基础培养基中添加血清替代物)培养nk细胞的方法被使用。但是目前市场上使用的无血清培养基往往不能达到有血清培养基的效果，同时大多数无血清培养基是培养免疫细胞的通用培养基，而没有特别有效的专门培养nk细胞的无血清培养基。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种nk细胞无血清培养基，旨在解决现有技术中缺乏一种特别有效的专门培养nk细胞的无血清培养基的问题。

本发明是这样实现的，一种nk细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加物，所述添加物包括白蛋白、氨基酸、缓冲剂、油酸、亚油酸和胰岛素。

进一步地，所述添加物中的组分的浓度为：白蛋白(1g/l)、油酸(0.05-0.2mg/l)、亚油酸(0.2-0.5mg/l)、胰岛素(5-10mg/l)。

进一步地，所述添加物中的氨基酸包括l-酪氨酸(30mg/l)、l-胱氨酸(70mg/l)、l-谷氨酰胺酸(50mg/l)、l-谷氨酰胺(350mg/l)、甘氨酸(20mg/l)、l-缬氨酸(60mg/l)、l-色氨酸(20mg/l)、l-苯丙氨酸(30mg/l)、l-丝氨酸(20mg/l)和l-苏氨酸(60mg/l)。

进一步地，所述缓冲剂包括l-磷酸甘油二钠盐水合物(1g/l)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(1g/l)。

进一步地，所述添加物中的组分的浓度为：白蛋白(1g/l)、油酸(0.12mg/l)、亚油酸(0.35mg/l)、胰岛素(7.5mg/l)。

进一步地，所述白蛋白为人血白蛋白。

进一步地，所述基础培养基为rpmi1640无血清培养基。

进一步地，所述添加物还包括d葡萄糖。

进一步地，所述d葡萄糖的浓度为：1-5g/l。

与现有技术相比，本发明提供了一种nk细胞无血清培养基，具有如下优点：

(1)、培养基成分明确，稳定性高，且市场来源基本不受限制，容易购得。

(2)、采用本发明制备的培养基，提升细胞的扩增效率和保证nk细胞的专一性，可以在简化细胞分离和培养步骤的情况下，得到高品质的细胞。

(3)、本发明制备的无血清培养基，无成分不明的异源蛋白，避免细胞污染和减少细胞制剂的安全隐患，有利于临床应用。

附图说明

图1是本发明实施例提供的使用本发明提供的无血清培养基培养的nk细胞扩增效率结果图；

图2是本发明实施例提供的使用本发明提供的无血清培养基培养的nk细胞流式细胞仪检测结果图；

图3是本发明实施例提供的使用本发明提供的无血清培养基培养的nk细胞杀伤检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。

以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细的描述。

参照图1-3所示，为本发明提供较佳实施例。

一种nk细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加物，添加物包括白蛋白、氨基酸、缓冲剂、油酸、亚油酸和胰岛素。

本发明提供了一种nk细胞无血清培养基，的nk细胞无血清培养基包括成分明确的替代血清的添加物，添加物包括白蛋白、氨基酸、缓冲剂、油酸、亚油酸和胰岛素。白蛋白是对nk细胞在体外存活和扩增影响最大的营养物质，是构建细胞膜和其他重要物质的基础。白蛋白中所携带的脂肪酸影响nk细胞的生长增殖、细胞功能等各个方面。培养基中油酸和亚油酸的浓度也是影响nk细胞增殖和杀伤活性的重要因素。胰岛素可刺激细胞对尿苷和葡萄糖的吸收，以此合成rna、蛋白质和脂质，胰岛素还能与细胞膜上的胰岛素受体结合而调控细胞内的多种代谢途径，增加脂肪酸和葡萄糖的合成，对细胞生长起重要作用。

上述提供的一种nk细胞无血清培养基，具有如下优点：

(1)、培养基成分明确，稳定性高，且市场来源基本不受限制，容易购得。

(2)、采用本发明制备的培养基，提升细胞的扩增效率和保证nk细胞的专一性，可以在简化细胞分离和培养步骤的情况下，得到高品质的细胞。

(3)、本发明制备的无血清培养基，无成分不明的异源蛋白，避免细胞污染和减少细胞制剂的安全隐患，有利于临床应用。

优选地，添加物中的组分的浓度为：白蛋白(1g/l)、油酸(0.05-0.2mg/l)、亚油酸(0.2-0.5mg/l)、胰岛素(5-10mg/l)。

进一步优选地，添加物各组分的浓度为：白蛋白(1g/l)、油酸(0.12mg/l)、亚油酸(0.35mg/l)、胰岛素(7.5mg/l)。

再者，添加物中的氨基酸包括l-酪氨酸(30mg/l)、l-胱氨酸(70mg/l)、l-谷氨酰胺酸(50mg/l)、l-谷氨酰胺(350mg/l)、甘氨酸(20mg/l)、l-缬氨酸(60mg/l)、l-色氨酸(20mg/l)、l-苯丙氨酸(30mg/l)、l-丝氨酸(20mg/l)和l-苏氨酸(60mg/l)。

缓冲剂包括l-磷酸甘油二钠盐水合物(1g/l)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(1g/l)。

具体地，白蛋白为人血白蛋白。

再者，基础培养基为rpmi1640无血清培养基。

本实施例中，添加物还包括d葡萄糖。

具体地，d葡萄糖的浓度为：1-5g/l。

以下为本发明提供的具体实施例：

nk细胞无血清培养基包括基础培养基和其他成分明确的替代血清的添加物，该培养基的基础培养基为rpmi1640无血清培养基，添加物包括白蛋白、氨基酸、缓冲剂、油酸、亚油酸和胰岛素。添加物的浓度为白蛋白1g/l、油酸0.12mg/l、亚油酸0.35mg/l、胰岛素7.5mg/l，白蛋白为人血白蛋白，添加物中的氨基酸包括l-酪氨酸(30mg/l)、l-胱氨酸(70mg/l)、l-谷氨酰胺酸(50mg/l)、l-谷氨酰胺(350mg/l)、甘氨酸(20mg/l)、l-缬氨酸(60mg/l)、l-色氨酸(20mg/l)、l-苯丙氨酸(30mg/l)、l-丝氨酸(20mg/l)和l-苏氨酸(60mg/l)，缓冲剂包括l-磷酸甘油二钠盐水合物(1g/l)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(1g/l)。

使用上述配置的无血清培养基体外扩增培养nk细胞，其具体实施步骤如下：

(1)细胞培养瓶包被：

本发明中使用的培养瓶包被液，使用添加以下抗体并稀释至优选浓度heceptin(800ug/ml)、cd16(0.5ug/ml)和nkp46(0.5ug/ml)的pbs。包被液加入培养瓶中，使液体均匀的铺开，37℃，孵育1h后吸弃包被液。

(2)pbmc分离：

本发明使用的nk细胞来源于外周血，利用以下步骤和方法分离得到外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)：采集患者的外周血，并转移到有抗凝剂的瓶中，再将收集到的血液轻轻倒入含有淋巴细胞分离液试管中(不要混匀)。室温下以2000rpm/min，离心20min。血液被分为四层，上层的血浆、血浆和分离液之间的单核细胞处于第二层、第三层的淋巴细胞分离液及第四层的红细胞。取第二层单核细胞和三层分离液，生理盐水离心洗净两次，获得目的pbmc。

(3)细胞激活

本发明中使用的细胞激活培养液，为添加了细胞刺激因子krestin的无血清培养基，刺激因子krestin的优选浓度为50ug/ml。

将步骤(2)获得的pbmc，用细胞激活培养液重悬，并调整细胞浓度1×10⁶/ml接种到步骤(1)包被处理的培养瓶中。

加入体积比为10％自体血浆，并加入500iu/mlil-2、50ng/mlil-12和50ng/mlil-15。控制培养体系在10-15ml。

温度37℃,5％co2环境下培养。

(4)细胞诱导扩增培养

本发明中细胞诱导扩增培养使用诱导培养液，的诱导培养液为添加了il-2、il-12和il-15中的一种或多种细胞因子的无血清培养基。添加的细胞因子优选浓度为：il-2(1000iu/ml、50ng/mlil-12和50ng/mlil-15)。

上述步骤(3)激活的细胞，激活培养24h后，直接补充添加诱导培养液，将培养体系补充至40ml。并加入一定比例和浓度(10％)的自体血浆，在温度37℃,5％co2环境下继续培养；中间根据细胞生长情况每2-3天一次补充培养液，倍增培养体系。

当培养体系超过400ml时，将细胞悬液转移到细胞培养袋中继续培养，并调整血浆比例为1％，维持il-2和il-12不变，但不再添加细胞因子il-15。培养11天后，培养体系补液至至1.6l。第十三天从培养袋中取出细胞，收获扩增的nk细胞，进行计数、流式分析检测和细胞活性检测。

(5)nk细胞扩增效率检测

步骤(3)(4)在细胞刺激和扩增培养过程中，记录细胞生长状况，在培养的不同时间段(从接种时间算起第0、2、4、6、8、10、12、14天)，进行细胞计数并绘制nk细胞生长曲线。

(6)nk细胞流式分析

步骤(4)收获的nk细胞，利用流式细胞仪检测分析细胞表面抗原表型，检测细胞的纯度。

方法如下：收集待测细胞，用台式低速自动平衡离心机离心细胞，相对离心力为1200g，缓升缓降均为5，离心5min后弃上清。pbs重悬细胞，洗涤细胞三次。用细胞计数仪进行计数，重新用pbs调整细胞密度为1.0×10⁶个/ml。取100微升加入流式专用管中，加入不同抗体(抗cd3和cd56抗体)。置于冰盒内避光孵育30分钟，分别上样进行分析。

(7)nk细胞杀伤活性检测

步骤(4)收获的nk细胞，采用乳酸脱氢酶(ldh)释放方法，检测nk细胞对靶细胞k562杀伤效果。乳酸脱氢酶存在于细胞内，正常情况下不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，ldh可从细胞内释放至培养液中。检测释放出来的ldh在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，可产生在特定波长(450nm)下具备吸收峰的化合物，因此可以在酶联检测仪读取450nm时的od值，计算nk细胞的杀伤活性。

结果：

细胞扩增效率结果如附图1所示；

分别在第0、2、4、6、8、10、12、14天，对培养细胞进行计数，绘制细胞生长曲线图。如图可见，细胞生长效率高，在扩增周期内获得了100-200倍的增长。

流式细胞检测结果如附图2所示；

图2是本实施例扩增的nk细胞流式细胞仪检测结果图，图象左上象限：cd56阳性、cd3阴性，代表nk细胞，占84％；如图所示，可以看出本实施例的扩增得到的nk细胞纯度高。

nk细胞杀伤检测结果如附图3所示；

采用nk细胞与靶细胞k562共培养的方法检测nk细胞的杀伤活性，同时用pbmc做对照组，按0.156、0.625、2.5、10、40的效靶比将效应细胞(e)和靶细胞(t)混合。如图所示，与pbmc相比，nk细胞的杀伤活性得到了显著的提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。