一种用茶皂素溶解月经血红细胞分离宫膜间充质干细胞的方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种用茶皂素溶解月经血红细胞分离宫膜间充质干细胞的方法。
背景技术：
：干细胞是一类具有自我更新与增殖分化能力的细胞，在细胞和组织修复，以及作为基因治疗的载体等方面有巨大的应用价值。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)来源广泛、可塑性强，同时拥有易于分离培养、多种因子分泌功能以及免疫调节功能等诸多优点，是目前干细胞领域的研究热点。诸多研究表明mscs在组织损伤修复和各种疾病治疗方面有良好的应用前景，包括参与骨、软骨和肌腱等组织缺损修复、改善心肌梗死模型的心脏功能、降低急性肺损伤程度、促进糖尿病模型中的葡萄糖调节恢复、降低药物诱导的肝纤维化水平、以及促进神经元再生、皮肤再生和伤口愈合等。研究发现除了骨髓、脐带、脂肪等组织，月经血中也存在丰富的宫膜来源间充质干细胞(宫膜间充质干细胞)，由于其体外增殖能力强可增殖390次，传代50次，分化潜能大，免疫原性低，生长因子分泌速率高等优点而受到再生医学研究领域的关注。目前宫膜干细胞分离主要利用淋巴细胞分离液、羟乙基淀粉等除去月经血中红细胞，获得有核细胞，并进一步通过贴壁培养方法获得，分离过程耗时较长，所用试剂成分复杂。因此，进一步研究和开发高效的宫膜干细胞分离技术，缩短分离时间、减少外源引入试剂成分、降低分离成本，对于促进宫膜干细胞制备的产业化和提高宫膜干细胞应用安全性具有重要意义。专利申请号为201810065994.3的中国专利，公开的宫膜干细胞获取方法中主要使用密度梯度离心和羟乙基淀粉沉降联用的方法，传统的密度梯度离心法和羟乙基淀粉沉降收获到的仅为白膜层的单个核细胞，而脱落的组织块则会沉淀在底部废弃掉，该方法收获到的细胞数量较少。专利申请号为201711371272.2的中国专利，公开的一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法，细胞分离过程采用氯化钠溶液对细胞进行处理，会对细胞造成损伤，从而影响后续细胞培养的数量。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于提供一种用茶皂素溶解月经血红细胞分离宫膜间充质干细胞的方法，不对目的细胞和组织造成损伤，可从月经血中快速高效分离提取单个核细胞和宫膜组织诱导获得宫膜间充质干细胞，且数量是传统白膜层的数倍。为解决上述技术问题，本发明提供的一种用茶皂素溶解月经血红细胞分离宫膜间充质干细胞的方法，包括如下步骤：(1)试剂配制：配置茶皂素溶液，所述茶皂素溶液为茶皂素浓度为375-1500mg/lpbs溶液，经过滤灭菌保存；(2)获得细胞沉淀：将月经血样品过滤，离心除去上层血浆，获得细胞沉淀a；向所述细胞沉淀a中加入所述茶皂素溶液，混合均匀后离心去除上清液，获得细胞沉淀b；(3)细胞培养：将所述细胞沉淀b用细胞培养液悬浮于培养箱中贴壁培养，在24h-48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜细胞培养液，而后每2-3天换细胞培养液，待细胞长至85％-90％汇合时，消化传代，收集第3代细胞，即为宫膜间充质干细胞。进一步地，所述月经血样品是女性月经周期第二天或第三天的月经血，添加等体积的含至少一种抗菌物质的缓冲液。进一步地，所述抗菌物质为头孢噻肟钠、两性霉素b、万古霉素盐酸盐、环丙沙星、卡那霉素和盐酸四环素中的一种或几种。进一步地，所述步骤(2)中茶皂素溶液与细胞沉淀a的体积比为9:1。进一步地，所述步骤(3)中细胞培养液为添加体积浓度5％血清替代物的基础培养基。进一步地，所述步骤(3)中培养箱为温度为37℃、饱和湿度、含5％co2的环境。进一步地，所述步骤(3)中，所述细胞沉淀b用细胞培养液悬浮后，以2*105/cm2密度接种至培养箱中。进一步地，所述步骤(3)中，所述贴壁培养包括原代培养和传代扩增。本发明的有益之处在于：1、利用茶皂素的皂素e环上22的脂键和血红素发生作用，引起红细胞膜通透性发生改变，使红细胞解体，仅对红细胞作用，对其他细胞和组织无影响，不对细胞造成损伤即可获得目的有核细胞，经传代培养后获得纯化的宫膜间充质干细胞；能够得到除传统方法得到的单个核以外的宫膜组织，收获的宫膜间充质干细胞数量是传统白膜层的数倍，且茶皂素为天然抑菌物，有效控制样本污染情况，制备时间更短，所得细胞活性保持较好，相同代次所得细胞量均明显高于传统方法所得。2、所用分离试剂为茶皂素溶液，通过茶皂素溶液去除月经血中红细胞，成分简单可控，操作方便，大大降低制备成本，并提高安全性。3、在月经血样品中加入抗菌物质保证除菌的彻底性，使得到的宫膜间充质干细胞产品不被污染。附图说明下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。图1为本发明分离获得的宫膜干细胞形态图。图2为传统方法分离获得的宫膜干细胞形态图。图3本发明分离获得的宫膜干细胞三系分化成软骨细胞图。图4本发明分离获得的宫膜干细胞三系分化成骨细胞图。图5本发明分离获得的宫膜干细胞三系分化成脂细胞图。具体实施方式实施例1一种用茶皂素溶解月经血红细胞分离宫膜间充质干细胞的方法，包括如下步骤：(1)试剂配制：配置茶皂素溶液，所述茶皂素溶液为茶皂素浓度为750mg/l的pbs溶液，经过滤灭菌；其中茶皂素粉剂可由市购获得。(2)获得细胞沉淀：将20ml月经血样品过滤，300g离心3min除去上层血浆，获得细胞沉淀a；向5ml细胞沉淀a中加入45ml茶皂素溶液，充分混合均匀，静置0.5-2.5min，混合均匀后300g离心5min去除上清液，获得细胞沉淀b。其中月经血样品是女性月经周期第二天或第三天的月经血，添加等体积的含至少一种抗菌物质的缓冲液，所述抗菌物质为头孢噻肟钠、两性霉素b、万古霉素盐酸盐、环丙沙星、卡那霉素和盐酸四环素中的一种或几种。(3)细胞培养：将细胞沉淀b用含5％体积浓度血清替代物(购自达科为生物技术股份有限公司)的基础培养基(购自达科为生物技术股份有限公司)悬浮，同时取少量悬液通过全自动血液分析仪进行计数，最后将有核细胞调整密度后以2*105/cm2密度接种至75cm2塑料细胞培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、含5％co2培养箱中培养，24h–48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜培养液，而后每2-3天换液，待细胞长至85％-90％汇合时，消化传代，p3代细胞收集鉴定，即为宫膜间充质干细胞。实施例2一种用茶皂素溶解月经血红细胞分离宫膜间充质干细胞的方法，包括如下步骤：(1)试剂配制：配置茶皂素溶液，所述茶皂素溶液为茶皂素浓度为375mg/l的pbs溶液，经过滤灭菌；其中茶皂素粉剂可由市购获得。(2)获得细胞沉淀：将20ml月经血样品过滤，300g离心3min除去上层血浆，获得细胞沉淀a；向5ml细胞沉淀a中加入45ml茶皂素溶液，充分混合均匀，静置0.5-2.5min，混合均匀后300g离心5min去除上清液，获得细胞沉淀b。其中月经血样品是女性月经周期第二天或第三天的月经血，添加等体积的含至少一种抗菌物质的缓冲液，所述抗菌物质为头孢噻肟钠、两性霉素b、万古霉素盐酸盐、环丙沙星、卡那霉素和盐酸四环素中的一种或几种。(3)细胞培养：将细胞沉淀b用含5％体积浓度血清替代物(购自达科为生物技术股份有限公司)的基础培养基(购自达科为生物技术股份有限公司)悬浮，同时取少量悬液通过全自动血液分析仪进行计数，最后将有核细胞调整密度后以2*105/cm2密度接种至75cm2塑料细胞培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、含5％co2培养箱中培养，24h–48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜培养液，而后每2-3天换液，待细胞长至85％-90％汇合时，消化传代，p3代细胞收集鉴定，即为宫膜间充质干细胞。实施例3一种用茶皂素溶解月经血红细胞分离宫膜间充质干细胞的方法，包括如下步骤：(1)试剂配制：配置茶皂素溶液，所述茶皂素溶液为茶皂素浓度为1500mg/l的pbs溶液，经过滤灭菌；其中茶皂素粉剂可由市购获得。(2)获得细胞沉淀：将20ml月经血样品过滤，300g离心3min除去上层血浆，获得细胞沉淀a；向5ml细胞沉淀a中加入45ml茶皂素溶液，充分混合均匀，静置0.5-2.5min，混合均匀后300g离心5min去除上清液，获得细胞沉淀b。其中月经血样品是女性月经周期第二天或第三天的月经血，添加等体积的含至少一种抗菌物质的缓冲液，所述抗菌物质为头孢噻肟钠、两性霉素b、万古霉素盐酸盐、环丙沙星、卡那霉素和盐酸四环素中的一种或几种。(3)细胞培养：将细胞沉淀b用含5％体积浓度血清替代物(购自达科为生物技术股份有限公司)的基础培养基(购自达科为生物技术股份有限公司)悬浮，同时取少量悬液通过全自动血液分析仪进行计数，最后将有核细胞调整密度后以2*105/cm2密度接种至75cm2塑料细胞培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、含5％co2培养箱中培养，24h–48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜培养液，而后每2-3天换液，待细胞长至85％-90％汇合时，消化传代，p3代细胞收集鉴定，即为宫膜间充质干细胞。实施例4本实施例为对照试验，为传统方法分离宫膜干细胞，包括以下步骤：(1)20ml月经血300g离心3min，去除上层血浆后，获得细胞沉淀a；向5ml细胞沉淀a中加入15ml生理盐水并充分混匀，获得稀释血样。(2)取干净离心管，转移10ml人淋巴细胞分离液(购自杭州联科生物技术有限公司)至50ml离心管中。(3)铺层加样：将20ml步骤1中的稀释血样加至步骤2中人淋巴细胞分离液的液面上，400g离心20min；提取单个核细胞：离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上依次为红细胞粒细胞层、分离液层、单个核细胞层和血浆层。(4)小心吸取步骤(3)中得到的雾状单个核细胞层，并加入生理盐水以300g离心5min，弃上清，获得细胞沉淀。(5)步骤(4)获得的细胞沉淀用含5％体积浓度血清替代物(购自达科为生物技术股份有限公司)的基础培养基(购自达科为生物技术股份有限公司)悬浮，同时取少量悬液通过全自动血液分析仪进行计数，最后将有核细胞调整密度后以2*105/cm2密度接种至75cm2塑料细胞培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、含5％co2培养箱中培养，24h-48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜培养液，而后每2-3天换液，待细胞长至85％-90％汇合时，消化传代，p3代细胞收集鉴定，即为宫膜间充质干细胞。对本发明的上述实施例1-3和传统方法实施例4细胞培养得到的细胞进行细胞数量和细胞形态分析，结果如下：表1本发明和传统方法所得细胞培养细胞数量情况表2本发明和传统方法所得细胞培养细胞形态情况取本发明实施例1和传统方法实施例4进行流式鉴定：取本发明实施例1和传统方法实施例4获得的第3代宫膜干细胞各1*106，分别均匀分装成9管，离心后用pbs重悬至200μl，洗涤2次。离心后留1管做空白，表型标记按每管一个标记进行添加(抗体分别为小鼠抗人cd73-pe、cd90-pe、cd105-pe、cd34-pe、cd45-pe、cd19-pe、cd14-fitc和hla-dr-fitc)。避光常温孵育30min，离心后洗涤2次，然后离心后加200μlpbs重悬，用流式细胞仪测定，结果如下：表面标志实施例1实施例4标准(db33/t2030-2017)cd7399.6299.54＞95％cd9099.6699.90＞95％cd10595.7495.78＞95％cd340.340.44＜2％cd450.630.48＜2％cd190.450.26＜2％cd140.550.47＜2％hla-dr0.580.63＜2％对本发明方法的实施例1所得宫膜干细胞进行三系分化，得到如图3-5所示的分化图，其中图3为宫膜干细胞三系分化成软骨细胞图、图4为宫膜干细胞三系分化成骨细胞图、图5为宫膜干细胞三系分化成脂细胞图。综上结果表明，本发明方法与传统方法相比较：(1)利用本发明方法所得宫膜间充质干细胞的纯度与传统方法所得基本一致，皆符合间充质干细胞表面标志物鉴定标准(db33/t2030-2017)；(2)本发明方法中细胞原代制备所需时间更短，分离过程耗时不超过15min，传统方法分离耗时30min以上；(3)本发明方法利用茶皂素的皂素e环上22的脂键和血红素发生作用，引起红细胞膜通透性发生改变，使红细胞解体，仅对红细胞作用，对其他细胞和组织无影响，不对细胞造成损伤即可获得目的有核细胞，经传代培养后获得纯化的宫膜间充质干细胞；能够得到除传统方法得到的单个核以外的宫膜组织，收获的宫膜间充质干细胞数量是传统白膜层的数倍，且茶皂素为天然抑菌物，有效控制样本污染情况，制备时间更短，所得细胞活性保持较好，相同代次所得细胞量均明显高于传统方法所得；(4)本发明方法所用分离试剂为茶皂素溶液，通过茶皂素溶液去除月经血中红细胞，成分简单可控，操作方便，大大降低制备成本，并提高安全性；(5)本发明方法在月经血保存液中中加入抗菌物质等多种手段保证了除菌的彻底性，使得到的宫膜干细胞产品不被污染。(6)本发明方法所得细胞能够进行三系分化，符合间充质干细胞特性。上述说明是示例性的而非限制性的。通过上述说明本领域技术人员可以意识到本发明的许多种改变和变形，其也将落在本发明的实质和范围之内。当前第1页12