荧光蛋白的纯化方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种荧光蛋白的纯化方法。

背景技术：

1962年，旅居美国的日本科学家下村修对一种发光水母产生了兴趣，因为他发现这种水母在受到外界的惊扰后会发射绿色荧光。在从美国西海岸打捞了大约5万只发光水母后，通过艰苦的提取纯化工作，最终得到数百毫克的蛋白，其在508nm下自行发射绿色荧光，称之为绿色荧光蛋白。后人的研究发现，通过改造绿色荧光蛋白的氨基酸序列，在一个或数个位点进行突变，可以得到不同颜色的荧光蛋白如黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白和青色荧光蛋白等。

荧光蛋白无需辅助因子和底物即可自行发射荧光，这一特性使其在生物实验中得到了广泛的应用。在实际应用中，某些场合需要一定量的高纯度荧光蛋白，此时，利用基因工程的方法来获得荧光蛋白，相较于从天然来源中提取的方法显然更简便、经济。基因工程的方法具体为：通过在表达载体上插入目的基因，然后将表达载体导入到相应的宿主细胞中，通过培养和诱导即可大量表达目的基因对应的蛋白。同时，因为荧光蛋白不需要翻译后修饰，选择原核表达系统来表达是合理的。

大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，它的优势是分子操作简单，可在廉价的培养基中快速生长，且外源蛋白表达量通常较高。虽然很多蛋白在大肠杆菌中表达易形成无活性的包涵体沉淀，但可以通过优化培养和诱导的条件得到可溶性表达的目标产物。荧光蛋白一般都在胞内表达，细胞破碎后，荧光蛋白和菌体自身蛋白及其它大分子物质混杂在一起，因此，要将不带任何标签的荧光蛋白从细胞破碎后的溶液中分离纯化出来是一件困难的事情。

目前，利用荧光蛋白的一些特性，如耐受一定的有机溶剂、相对耐热、不易变性等，已经开发了一些分离纯化不带任何标签的荧光蛋白的方法，如双液相萃取、有机溶剂抽提、热处理等，但这些方法均存在纯化倍数低、工艺复杂、易引发环境污染等缺点。因而，寻找一种简单高效、经济同时适合大规模应用的荧光蛋白纯化方法显得十分必要。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种荧光蛋白的纯化方法，以缓解现有技术中荧光蛋白的纯化方法纯化倍数低、工艺复杂、易引发环境污染等技术问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种荧光蛋白的纯化方法，将细胞破壁液依次经沉淀和复溶处理后用离子交换层析进行纯化，得到所述荧光蛋白。

进一步地，所述沉淀包括在所述细胞破壁液中加入zn²⁺，得到沉淀蛋白的步骤。

进一步地，在所述细胞破壁液中加入zn²⁺后，在7000-9000rpm/min条件下离心5-15min，取沉淀得到所述沉淀蛋白。

进一步地，所述zn²⁺的浓度为2-200mm，优选为10-50mm，进一步优选为20mm。

进一步地，所述复溶包括将经所述沉淀得到的沉淀蛋白用tris缓冲液进行溶解，得到复溶溶液的步骤；

优选地，将经所述沉淀得到的沉淀蛋白用tris缓冲液进行溶解后，在7000-9000rpm/min条件下离心5-15min，取上清得到所述复溶溶液。

进一步地，所述离子交换层析的层析步骤包括：用nacl浓度为90-110mm的tris缓冲液对结合有荧光蛋白的离子交换层析柱进行洗脱，洗脱得到的溶液为纯化的荧光蛋白；

优选地，先用nacl浓度为40-60mm的tris缓冲液对结合有荧光蛋白的离子交换层析柱进行洗脱，再进行用nacl浓度为90-110mm的tris缓冲液对结合有荧光蛋白的离子交换层析柱进行洗脱的步骤。

进一步地，所述结合有荧光蛋白的离子交换层析柱通过将所述复溶得到的复溶溶液加入到离子交换层析柱得到；

优选地，所述离子交换层析柱在加入所述复溶溶液前经过tris缓冲液平衡处理；

优选地，所述复溶溶液加入所述离子交换层析柱后还包括用tris缓冲液冲洗所述结合有荧光蛋白的离子交换层析柱的步骤；

优选地，所述离子交换层析柱为阴离子交换层析柱。

进一步地，所述细胞破壁液经过热处理后再进行沉淀的步骤，所述热处理的条件包括：在60-70℃条件下，80-120rpm/min孵育10-20min；

优选地，所述热处理后还包括在7000-9000rpm/min条件下离心5-15min的步骤，得到所述细胞破壁液。

进一步地，所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或青色荧光蛋白。

进一步地，所述tris缓冲液的浓度为30-70mm，ph值为7.5-8.5，优选为50mm，ph8.0。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供一种荧光蛋白的纯化方法，将细胞破壁液依次经沉淀和复溶处理后用离子交换层析进行纯化，得到荧光蛋白。通过沉淀将荧光蛋白从细胞破壁液中沉淀下来，可以实现荧光蛋白与细胞破壁液中的其他物质的快速分离，起到初步纯化的效果。由于沉淀的选择性不高，这一过程中会有一些杂蛋白跟随荧光蛋白一起沉淀出来，通过复溶这一步骤可以将荧光蛋白从沉淀步骤得到的沉淀蛋白中复溶到溶液中，大部分的杂蛋白依然存在于沉淀蛋白中，以实现荧光蛋白的进一步纯化。为了得到高纯度的荧光蛋白，将复溶得到的复溶溶液通过离子交换层析进行更进一步的纯化，可以使荧光蛋白与杂蛋白分离，得到高纯度的产品。该纯化方法简便高效，适用于所有表达系统中荧光蛋白的纯化，安全对环境没有污染，纯化成本低，纯化得到的荧光蛋白纯度高并且浓度高，该方法适用于工业化的生产与应用。

附图说明

图1为本发明实施例3中荧光蛋白纯化的sds-page效果图；

图2为本发明实施例4中deae层析纯化的sds-page效果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

一种荧光蛋白的纯化方法，将细胞破壁液依次经沉淀和复溶处理后用离子交换层析进行纯化，得到荧光蛋白。

通过沉淀将荧光蛋白从细胞破壁液中沉淀下来，可以实现荧光蛋白与细胞破壁液中的其他物质的快速分离，起到初步纯化的效果。由于沉淀的选择性不高，这一过程中会有一些杂蛋白跟随荧光蛋白一起沉淀出来，通过复溶这一步骤可以将荧光蛋白从沉淀步骤得到的沉淀蛋白中复溶到溶液中，大部分的杂蛋白依然存在于沉淀蛋白中，以实现荧光蛋白的进一步纯化。为了得到高纯度的荧光蛋白，将复溶得到的复溶溶液通过离子交换层析进行更进一步的纯化，可以使荧光蛋白与杂蛋白分离，得到高纯度的产品。该纯化方法简便高效，适用于所有表达系统中荧光蛋白的纯化，安全对环境没有污染，纯化成本低，纯化得到的荧光蛋白纯度高并且浓度高，该方法适用于工业化的生产与应用。

需要说明的是，一般情况下荧光蛋白的表达都利用各宿主细胞表达系统，荧光蛋白的纯化分离首先要对宿主细胞进行破碎处理，使得细胞内的物质释放出来，对宿主细胞进行细胞破碎处理，通过离心将细胞膜等不溶杂质去除后得到的溶液即为细胞破壁液。

在本发明一个优选地实施方式中，细胞破壁液中的溶液为tris缓冲液。利用tris缓冲液有利于荧光蛋白的沉淀，同时有利于提高后续的离子交换层析纯化处理工艺的效果。

在本发明一个优选地实施方式中，沉淀包括在细胞破壁液中加入zn²⁺，得到沉淀蛋白的步骤。利用zn²⁺可以可逆的沉淀荧光蛋白这一特性，将荧光蛋白从细胞破壁液中沉淀出来，实现荧光蛋白的初步纯化。该步骤简单易操作，避免了使用有机溶剂易引发环境污染的问题。zn²⁺可以来源于各种锌盐等，具体例如但不限于为znso4、zncl2、zn(no3)2或zn(ch3coo)2。

在本发明一个优选地实施方式中，在细胞破壁液中加入zn²⁺后，在7000-9000rpm/min条件下离心5-15min，取沉淀得到沉淀蛋白。在细胞破壁液中加入zn²⁺后，荧光蛋白大量沉淀，通过离心的操作可以将沉淀蛋白与溶液分离的更加彻底，有利于尽可能的将上清液去除，保证后续复溶步骤中荧光蛋白的复溶不会受到抑制，更多的荧光蛋白复溶到溶液中，提高纯化效率。转速典型但非限制性的为7000rpm/min、7500rpm/min、8000rpm/min、8500rpm/min或9000rpm/min；时间典型但非限制性的为5min、7min、10min、13min或15min。

在本发明一个优选地实施方式中，zn²⁺的浓度为2-200mm，优选为10-50mm，进一步优选为20mm。zn²⁺的浓度对于荧光蛋白的沉淀效果起到直接的影响作用，浓度过低荧光蛋白沉淀不完全，荧光蛋白的纯化分离效率低；浓度过高会有更多的杂蛋白沉淀出来，影响后续的工艺操作效果。通过对zn²⁺的浓度不断的进行摸索和调整，最终得到2-200mm时，荧光蛋白的初步纯化效果最好。zn²⁺的浓度典型但非限制性的为2mm、10mm、20mm、50mm、100mm、130mm、150mm、180mm或200mm。

在本发明的一些实施方式中，复溶包括将经沉淀得到的沉淀蛋白用tris缓冲液进行溶解，得到复溶溶液的步骤。由于沉淀操作对荧光蛋白的纯化选择性不是很高，沉淀蛋白中依然有一定数量的杂蛋白，为了进一步提高荧光蛋白的纯度，对沉淀蛋白用tris缓冲液进行复溶处理，将zn²⁺和荧光蛋白的结合分开，使荧光蛋白复溶于tris缓冲液中。复溶过程中，荧光蛋白会率先溶解到tris缓冲液中，而杂蛋白大部分仍然保留在沉淀中，收集复溶溶液实现对荧光蛋白的进一步纯化分离。复溶使用tris缓冲液更加有利于后续的离子交换层析步骤，保证离子交换层析纯化效果。

在本发明一个优选地实施方式中，将经沉淀得到的沉淀蛋白用tris缓冲液进行溶解后，在7000-9000rpm/min条件下离心5-15min，取上清得到复溶溶液。通过离心操作更加有利于固液的分离，尽可能的去除杂蛋白。转速典型但非限制性的为7000rpm/min、7500rpm/min、8000rpm/min、8500rpm/min或9000rpm/min；时间典型但非限制性的为5min、7min、10min、13min或15min。

在本发明一个优选地实施方式中，离子交换层析的层析步骤包括：用nacl浓度为90-110mm的tris缓冲液对结合有荧光蛋白的离子交换层析柱进行洗脱，洗脱得到的溶液为纯化的荧光蛋白。洗脱液的nacl浓度直接影响到荧光蛋白的洗过效果和纯度，本发明通过大量的研究和试验最终确定了荧光蛋白的洗脱浓度。收集荧光蛋白的nacl的浓度典型但非限制性的为90mm、95mm、100mm、105mm或110mm。

在本发明一个优选地实施方式中，先用nacl浓度为40-60mm的tris缓冲液对结合有荧光蛋白的离子交换层析柱进行洗脱，再进行用nacl浓度为90-110mm的tris缓冲液对结合有荧光蛋白的离子交换层析柱进行洗脱的步骤。先用低浓度nacl的tris缓冲液进行洗脱，可以去除大部分的杂蛋白，有利于提高后续用90-110mmnacl的tris缓冲液洗脱得到的荧光蛋白的纯度。先洗脱的nacl的浓度典型但非限制性的为40mm、45mm、50mm、55mm或60mm。

在本发明一个实施方式中，结合有荧光蛋白的离子交换层析柱通过将复溶得到的复溶溶液加入到离子交换层析柱得到。

在本发明一个优选地实施方式中，离子交换层析柱在加入复溶溶液前经过tris缓冲液平衡处理。由于复溶溶液采用的是tris缓冲液，在复溶溶液加入到离子交换层析柱前用tris缓冲液对柱子进行平衡处理，有利于复溶溶液中蛋白结合到层析柱上。

在本发明一个优选地实施方式中，复溶溶液加入离子交换层析柱后还包括用tris缓冲液冲洗所述结合有荧光蛋白的离子交换层析柱的步骤。复溶溶液加入到离子交换层析柱中后，再用tris缓冲液对层析柱进行冲洗，可以初步将未与层析柱结合的杂蛋白冲洗下来，提高后续荧光蛋白的纯度。

在本发明一个优选地实施方式中，离子交换层析柱为阴离子交换层析柱。

在本发明一个优选地实施方式中，细胞破壁液经过热处理后再进行沉淀的步骤，热处理的条件包括：在60-70℃条件下80-120rpm/min孵育10-20min。利用荧光蛋白相对耐热的特性，先对细胞破壁液在沉淀处理前进行合适的热处理，可以首先去除掉一部分不耐热的杂蛋白。进一步提高后续纯化步骤中的荧光蛋白纯化效果，排除杂蛋白的干扰。热处理温度典型但非限制性的为60℃、63℃、65℃、67℃或70℃；热处理的转速典型但非限制性的为80rpm/min、90rpm/min、100rpm/min、110rpm/min或120rpm/min；孵育时间典型但非限制性的为10min、13min、15min、17min或20min。

在本发明一个优选地实施方式中，热处理后还包括在7000-9000rpm/min条件下离心5-15min的步骤，得到细胞破壁液。热处理后通过离心操作可以快速高效的将不耐热的杂蛋白去除。转速典型但非限制性的为7000rpm/min、7500rpm/min、8000rpm/min、8500rpm/min或9000rpm/min；时间典型但非限制性的为5min、7min、10min、13min或15min。

在本发明的一些实施方式中，荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或青色荧光蛋白。

在本发明一个优选地实施方式中，tris缓冲液的浓度为30-70mm，ph值为7.5-8.5，优选为50mm，ph8.0。tris缓冲液的浓度对整个荧光蛋白的纯化方法起到稳定纯化环境的作用。整个方法中用同一种缓冲液体系也有利于简化纯化操作，避免了几种溶液的相互干扰情况。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

下列实施例中未注明具体条件的实验，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南(第三版)》(j.萨姆布鲁克等著，2003)中所述的条件进行。

实施例1.荧光蛋白表达载体构建

以egfp-f(5’-cggcagccatatggtgagcaagggcgagg-3’，下划线为ndei酶切位点)为上游引物，egfp-r(5’-ccgctcgagttagtggtgatggtgatggtg-3’，下划线为xhoi酶切位点)为下游引物，商品化质粒pegfp-n1为模板，pcr扩增egfp基因。pcr产物经回收后用ndei和xhoi双酶切，双酶切产物回收后连入经过同样双酶切的商品化质粒pet-24a中，得到pet-24a-egfp载体，该载体即为荧光蛋白egfp的表达载体。

实施例2.荧光蛋白表达

表达载体pet-24a-egfp转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，涂布lb平板(含卡那霉素50mg/l)，37℃恒温箱过夜培养。

从过夜培养的lb平板上挑取单个菌落到装有50mllb培养基的250ml摇瓶中，置于37℃恒温摇床，200rpm/min，培养20h作为种子液。

将培养好的种子液接种到装有100ml自诱导培养基的1000ml摇瓶中，共接种8瓶，每瓶的接种量为5％(v/v)，置于恒温摇床，200rpm/min，37℃培养3h后转为25℃培养20h。其中，自诱导培养基的配方为：乳糖2g/l；蛋白胨10g/l；酵母粉5g/l；nacl10g/l；甘油8ml/l。

收集所有培养液，离心后去上清得到菌体，可观察到菌体呈绿色。

实施例3.荧光蛋白纯化

在收集菌体的离心瓶中加入100mltris(50mmol/l，ph8.0)缓冲液，使菌体混悬，用高压均质机破碎细胞至混悬液变澄清。将破菌液置于65℃水浴摇床，100rpm/min，孵育15min。热处理后，离心(8000rpm/min，10min)，取上清，沉淀废弃。

在上清中加入2mol/lzncl2溶液至其终浓度为20mmol/l，混合均匀，可观察到大量蛋白沉淀，再次离心(8000rpm/min，10min)，取沉淀，上清废弃。

往沉淀中加入100mltris(50mmol/l，ph8.0)缓冲液，使沉淀充分混悬后离心(8000rpm/min，10min)，取上清。沉淀用100mledta(5mmol/l,ph8.0)溶液溶解，取样加入loadingbuffer制成上样样品，sds-page凝胶电泳，结果如图1所示，其中，m：proteinmarker；1：细胞破壁液上清；2：65℃热处理后的离心上清；3：tris溶出液；4：edta溶解液，箭头指示egfp条带所处位置。从图1中可以看出，泳道3中的复溶溶液即tris溶出液中荧光蛋白的含量较多且纯度较高，稍有部分的杂蛋白，泳道4表明大部分杂蛋白未随egfp溶出，而是仍保留在沉淀中。

实施例4.deae层析纯化

装有5mldeae填料的阴离子预装柱用tris(50mmol/l,ph8.0)缓冲液平衡，之后将例3中的tris溶出液上样，上样完后用tris(50mmol/l,ph8.0)缓冲液冲洗层析柱，再用含有不同浓度nacl的tris(50mmol/l,ph8.0)缓冲液梯度洗脱，其中nacl浓度依次为50mmol/l；100mmol/l；300mmol/l。收集洗下来的各组分，各加入loadingbuffer制成上样样品，sds-page凝胶电泳，结果如图2所示，其中，m：proteinmarker；1：上样液；2：流穿液；3：50mmol/lnacl洗脱；4：100mmol/lnacl洗脱；5：300mmol/lnacl洗脱，箭头指示egfp条带所处位置。从图中可以看出，泳道4中用100mmol/lnacl的tris缓冲液洗脱得到的洗脱液中荧光蛋白含量最高，纯度也很高，说明本发明提供的纯化方法实现了高效率，高纯度的纯化荧光蛋白。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。