一种双环RGD肽合成方法与流程

本发明涉及多肽合成技术领域，具体涉及一种双环rgd肽合成方法。

背景技术：

rgd肽是指含有由arg-gly-asp三个氨基酸组成的序列多肽，有直链肽和环肽之分。它们是许多细胞外基质蛋白(如vn、fn、fgn、胶原等)等最小识别短肽序列。研究发现，rgd序列肽具有广泛的生物活性，可用于心血管疾病、骨质疏松和炎症等疾病的治疗，还可以预防和治疗由细胞粘附异常而导致的肿瘤，尤其是发展性肿瘤的转移；另一方面，rgd序列肽又可作为兴奋剂，促进损伤的器官与组织的再生、伤口的愈合等等，rgd序列肽作为某些整合素的受体，其选择性部分依赖于rgd的构象以及rgd周围的氨基酸残基。为此，近几年，许多科技工作者合成了一系列rgd三肽、四肽、五肽等，还合成了rgd环肽、双线肽、rgd模拟肽等等，而双环rgd肽得到更多的关注和应用，在标记dota，nota，dtpa等螯合物之后鳌合(99mtc，111in，64cu，and68ga)等放射性金属元素可在细胞体内肿瘤示踪doi.10.1021/bc900167c。

双环rgd肽，泛指带有rgd三个基本氨基酸的的五元环二肽，其主要有e(rgdfk)2，e(rgdyk)2，e(rgdyc)2，e(rgdfc)2，e(rgdyc)等等。其作用机理大同小异。目前合成的双环rgd肽，报道采用的是通过boc-glu(osu)-osu活化e谷氨酸的两个cooh的办法，然后在液体中缩合rgd单环肽的作法。该双环rgd肽的合成工艺存在路线长，纯化步骤多，操作复杂等缺陷，亟待进一步改进。

技术实现要素：

本发明实施例的目的在于提供一种双环rgd肽合成方法，用以解决现有液相合成双环rgd肽的过程步骤多、工艺复杂、成本高的缺陷。

为实现上述目的，本发明实施例提供一种双环rgd肽合成方法，其包括：通过谷氨酸将在树脂上合成的两个rgd单环肽连接形成双环rgd肽的过程。

优选的，所述双环rgd肽的结构式为e[c(rgdxk)]2，其中，x为氨基酸。

优选的，所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨。

优选的，所述rgd单环肽的合成过程包括：

将fmoc-asp-oallyl连接在树脂上，依次加入fmoc-gly-oh，fmoc-arg(pdf)-oh，fmoc-lys(dde)-oh，以及x通过脱保护基fmoc及多肽缩合反应，获得直链肽，其中，x为任意氨基酸；

所述直链肽中的天冬氨酸与苯丙氨酸通过脱保护基oallyl及多肽缩合反应，获得rgd单环肽。

优选的，所述脱保护基oallyl反应在pd(0)催化剂作用下进行。

优选的，在所述rgd单环肽中逐滴加入fmoc-glu-oh，rgd单环肽的赖氨酸与fmoc-glu-oh通过脱保护基dde与多肽缩合反应，获得双环rgd肽。

优选的，所述多肽缩合反应是在hbtu，hobt，diea作用下进行。

优选的，所述fmoc-glu-oh的加入摩尔量小于所述天冬氨酸加入摩尔量的0.5倍。

优选的，所述树脂为树脂为二氯树脂或wang树脂。

本发明实施例还体用一种双环肽螯合物的合成方法，利用上述方法制备的双环rgd肽的谷氨酸通过脱去保护基和缩合反应连接dota、nota或dtpa的过程。

本发明实施例具有如下优点：

本发明通过直接在固相树脂上进行双环肽的合成，简化了中间体的纯化步骤，简化了操作的复杂性，让后续标记更直接和简单，更方便在e的末端氨基上进行dota，nota，dtpa螯合剂标记。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的双环rgd多肽e(rgdyk)2的液相色谱图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

本发明实施例中，氨基酸是指甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨二十种氨基酸。

本发明实施例中，fmoc表示9-芴甲氧羰基。

本发明实施例中，hbtu表示苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐。

本发明实施例中，hobt表示1-羟基苯并三唑。

本发明实施例中，diea(avv-diisopropylethylamine)有机弱碱，催化作用。

本发明实施例中，oallyl为丙烯醇。

本发明实施例中，pbf为2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulphonyl2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基团。

本发明实施例中，ddel-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl

n'-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)

本发明实施例中，pd(o)即为pd(o)cat或pd(pph3)4/pph3。

实施例1双环rgd肽e[c(rgdxk)]2的合成

树脂上直链rgd肽的合成，取树脂1g，本发明实施例中，如果采用的树脂二氯树脂，可采用甲醇封端；如果采用的树脂是wang树脂，可采用醋酸酐封端等等相应树脂封端方法封端，其中，树脂的氮载量0.8-1.5mmol/g，加入二氯甲烷溶胀5min，然后，加入相对于树脂氮载量1.5倍以上的特殊保护的氨基酸fmoc-asp-oallyl，相对于树脂氮载量3倍以上的缩合剂hbtu，hobt缩合，将第一个天冬氨酸氨基酸接在树脂上。

采用固相多肽合成多肽技术，通过脱保护基及多肽缩合反应依次缩合fmoc-gly-oh，fmoc-arg(pdf)-oh,fmoc-lys(dde)-oh,x等5个氨基酸形成直链肽。

树脂上rgd单环肽的合成，脱去rgd单环肽天冬氨酸的主链羧基保护基团oallyl，在pd(0)催化剂作用下，裸露出羧基，脱去苯丙氨酸的氨基保护基fmoc，加入三倍过量的hbtu，hobt，diea缩合，天冬氨酸和苯丙氨酸多肽缩合反应，使得5个氨基酸成环，形成rgd单环肽。rgd单环肽的反应过程如下：

双环rgd肽的合成，去掉赖氨酸的侧连保护基团dde，在2％水合肼dmf溶液作用下，裸露出侧连nh2，加入dmf溶液、3倍过量缩合剂hbtu，hobt后，逐滴加入fmoc-glu-oh。其中，逐滴加入的谷氨酸的摩尔量不超过加入的天冬氨酸的摩尔数的1/2。发明实施例中，通过谷氨酸的两端羧基接挂在树脂上全保护的双环rgd肽e[c(rgdxk)]2。双环rgd肽e[c(rgdxk)]2反应过程如下：

本发明实施例的双环rgd肽e[c(rgdxk)]2，x为任意氨基酸，较佳的，x为半胱氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸。双环rgd肽e[c(rgdxk)]2可应用于后续要继续标记鳌合物比如dota，nota，dtpa等等，可以通过脱去谷氨酸的保护基fmoc，后继续标记。

实施例2双环肽螯合物nota-e[c(rgdfk)]2的合成路线

取树脂1g，氮载量1.0mmol/g，加入二氯甲烷溶胀5min，然后加入相对于树脂氮载量1.5倍以上的特殊保护的氨基酸fmoc-asp-oallyl，加入相对于树脂氮载量3倍以上的缩合剂hbtu，hobt进行多肽缩合反应，将第一个氨基酸天冬氨酸接在多肽树脂上，并对树脂进行封端。

按照固相多肽合成技术，通过脱保护基及多肽缩合反应依次缩合其它氨酸如fmco-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-lys(dde)-oh、fmoc-d-phe-oh氨基酸。用pd(o)催化脱去主链天冬氨酸羧基保护基oallyl。脱去苯丙氨酸fmoc保护基，进行多肽缩合反应形成rgd单环肽。

利用2％水合肼dmf溶液脱去赖氨酸侧链保护基，裸露侧链氨基。洗净树脂后加入脱肽反应缩合剂hbtu，hobt，diea数滴。将0.5mmolfmoc-glu-oh逐滴加入到上述含有rgd单环肽树脂溶液中，反应0.5-1h,树脂洗净后醋酸酐封掉没有反应的氨基，获得双环rgd多肽e[c(rgdfk)]2。

脱去glu的氨基保护基fmoc，加入nota螯合剂，通过hbtu，hobt缩合。将nota接在双环rgd肽上，切割液切割得到所需要的产品，产率约20-30％。本发明实施例的方法最终的目标产品全部在树脂上完成，不需要做任何中间体的纯化，检测简单，操作易控制，比传统合成方法大大节省时间和原料成本。

实施例3双环肽螯合物dota-peg3-e[c(rgdyk)]2的合成路线

取树脂1g，氮载量1.0mmol/g，加入二氯甲烷溶胀5min，后加入相对于树脂氮载量1.5倍以上特殊保护的氨基酸fmoc-asp-oallyl缩合剂相对于树脂氮载量3倍以上的缩合剂hbtu，hobt进行多肽缩合反应，将第一个天冬氨酸接在多肽树脂上，树脂封端。

按照固相多肽合成技术，通过脱保护基及多肽缩合反应依次缩合其它氨酸如fmco-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-lys(dde)-oh、fmoc-tyr-oh氨基酸。用pd(o)催化去掉主链天冬氨酸羧基保护剂oallyl保护基团。脱去酪氨酸fmoc保护基团进行缩合形成rgd单环肽。

利用2％水合肼dmf溶液，脱去lys侧链保护基，裸露侧链氨基，洗净树脂后加入多肽反应缩合剂hbtu，hobt，diea数滴。将fmoc-glu-oh0.5mmol逐滴加入到含有fmoc保护基的树脂溶液中反应0.5-1h，树脂洗净后醋酸酐封掉没有反应的氨基，获得双环rgd多肽e(rgdyk)2。

e(rgdyk)2的结构式如下：

本发明实施例的双环rgd多肽e(rgdyk)2，结合图1所示，液相色谱表征如下：

表1e(rgdyk)2纯度分析表

total3643878.407100

脱掉glu的氨基保护基团，然后缩合fmoc-peg3-oh特殊小分子，后脱掉fmoc基团，加入dota螯合剂，通过hbtu，hobt缩合。将dota螯合剂接在双环rgd肽，切割液切割得到所需要的产品，产率约20-30％。此方法最终的目标产品全部在树脂上完成，不需要做任何中间体的纯化，检测简单，操作易控制。而且可以在后续的合成中不断进行添加特殊化合物，延长修饰的可能性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。