1,2,3-三氮唑类微管蛋白聚合抑制剂其合成方法和应用与流程

本发明涉及抗肿瘤药物化学领域，具体涉及一类新型1,2,3-三氮唑类化合物、它们的制备方法及其作为一类新的抗肿瘤药物先导化合物的应用。

背景技术：

微管是大多数真核生物细胞骨架的重要组分，在维持细胞形态、保持细胞内部结构的有序性中起重要作用，而且与细胞内的物质运输、细胞运动、细胞的分化发育以及细胞分裂繁殖等生命活动密切相关。微管蛋白(tubulin)的重要生理作用使得其在肿瘤领域中成为重要的靶点。秋水仙碱作为微管蛋白聚合抑制剂可抑制细胞的有丝分裂，有抗肿瘤作用，但毒性大，现已少用。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一类抗肿瘤活性强于秋水仙碱的新型1,2,3-三氮唑类化合物。

本发明的另一个目的在于提供一种简单高效，绿色环保的合成新型1,2,3-三氮唑类化合物的方法。

本发明的再一个目的在于探寻所述化合物的抗肿瘤靶点，证明化合物为微管蛋白聚合抑制剂。

本发明所述一类新型1,2,3-三氮唑类化合物具有如下通式：

具体为6a～6l所示化合物：

本发明所述新型1,2,3-三氮唑类化合物主要通过下列步骤制得：

(1)化合物(4)的制备方法：

溶剂中，将3,4,5-三甲氧基苯胺(1)，4-甲氧基苄氯在碱性条件下搅拌反应，加入氯乙酰氯反应得到化合物(4)，所用的碱性化合物是氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠、十二水磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠中的一种；所用的溶剂为乙醇、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷中之一或其中任意两种的混合物；反应在0-80℃之间进行。

(2)化合物(5)的制备方法：

溶剂中，化合物(4)和叠氮钠在碱性条件下搅拌反应，得到化合物(5)；所用的碱性化合物是氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠、十二水磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠中的一种；所用的溶剂为乙醇、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷中之一或其中任意两种的混合物；反应在60-120℃之间进行。

(3)通式(6a～6l)的制备方法：

溶剂中，化合物(5)与取代炔基化合物在五水硫酸铜及抗坏血酸钠存在下反应，所用的溶剂为丙酮、乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇、四氢呋喃、蒸馏水中之一或其中任意两种或三种的混合物；反应在25-80℃之间进行。

本发明优点：1、该类化合物体外抗癌活性试验表明对多种肿瘤细胞pc3、hepg2、mgc803等均具有一定的抑制作用，同时对微管蛋白的聚合有显著的抑制作用。尤其是化合物(6c)对pc3、hepg2、mgc803三种癌细胞的活性优于抗肿瘤药物秋水仙碱及抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶，化合物(6a，6b，6c，6g，6j)对pc3、hepg2、mgc803三种癌细胞的活性优于抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶,可作为进一步开发的候选或者先导化合物，应用于制备抗肿瘤药物。2、合成方法简单高效，绿色环保，收率高，达80％以上。

附图说明

图1为不同浓度的化合物6c对tubulin聚合抑制活性图，其中，1-空白对照，2-秋水仙碱，3-1um化合物6c，4-2um化合物6c，5-4um化合物6c。

具体实施方式

为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：

实施例1通式(6a～6l)的制备(1)制备化合物(4)：

(1)室温下，乙醇溶剂中，加入3,4,5-三甲氧基苯胺(1)、4-甲氧基苄氯、碳酸钠搅拌反应，然后加入氯乙酰氯反应得到化合物(4)；

(2)制备化合物(5)：

乙醇溶剂中，加入磷酸钾、化合物(4)和叠氮钠，60℃搅拌反应，得到化合物(5)；

(3)制备化合物(6a～6l)：将化合物(5)(1.93g，5mmol)和不同炔基化合物(6mmol)加入10ml丙酮/水(5ml/5ml)溶解，最后加入五水硫酸铜(1mmol)和抗坏血酸钠(0.5mmol)，室温搅拌过夜。tlc监测反应进程，待反应结束后，向体系中加入蒸馏水，然后用二氯乙烷萃取6次，再用饱和食盐水反萃二氯乙烷相3次，每次10ml，最后有机相用无水硫酸镁干燥，滤除硫酸镁，滤液减压蒸馏除去二氯乙烷。所得粗产品用硅胶柱柱层析分离纯化，石油醚/乙酸乙酯＝8:1洗脱，分别得化合物(6a～6l)。

化合物(6a):¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.3(s,1h),7.7(d,1h),7.7(d,1h),7.4(d,1h),7.4(t,1h),7.2(d,2h),6.9(d,2h),6.6(s,2h),6.2(s,1h),5.5(s,2h),5.2(s,2h),4.8(s,2h),3.7(s,9h),3.7(s,3h).收率81％。

化合物(6b):¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.2(s,1h),8.0(d,1h),7.7(d,1h),7.2(dd,3h),7.0(dd,1h),6.9(d,2h),6.6(s,2h),6.3(d,1h),5.3(s,2h),5.2(s,2h),4.8(s,2h),3.7(s,9h),3.7(s,3h).收率86％。

化合物(6c):¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.2(s,1h),7.7(d,1h),7.2(dd,3h),7.1(dd,1h),6.9(d,2h),6.6(s,2h),6.2(d,1h),5.30(s,2h),5.2(s,2h),4.8(s,2h),3.7(s,9h),3.7(s,3h),2.4(d,3h).收率85％。

化合物(6d):¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.1(s,1h),7.3(dd,2h),7.2(d,2h),7.1(d,2h),7.0(t,1h),6.9(d,2h),6.6(s,2h),5.2(d,4h),4.8(s,2h),3.7(s,9h),3.7(s,3h).收率83％。

化合物(6e):¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.0(d,2h),7.9(d,1h),7.6–7.3(m,2h),7.1(d,2h),6.9(d,2h),6.6(s,2h),5.1(s,2h),4.8(s,2h),4.7(s,2h),3.7(d,9h),3.7(s,3h).收率89％。

化合物(6f):¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.9(s,1h),7.2(d,2h),6.8(d,2h),6.6(s,2h),5.1(s,2h),4.8(s,2h),4.4(s,2h),4.2(t,2h),3.7(s,9h),3.7(s,3h),3.5(t,2h).收率90％。

化合物(6g):¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.1(s,1h),7.8–7.6(m,2h),7.5–7.2(m,2h),7.1(d,2h),6.9(d,2h),6.6(s,2h),5.1(s,2h),4.8(s,2h),4.7(s,2h),3.7(d,9h),3.7(s,3h).收率92％。

化合物(6h):¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.99(s,1h),7.6–7.3(m,10h),7.1(d,2h),6.9(d,2h),6.6(s,2h),5.1(s,2h),4.8(s,2h),4.9(s,2h),3.7(d,9h),3.7(s,3h).收率93％。

化合物(6i):¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.6(s,1h),8.0(s,1h),7.1(d,2h),6.9(d,2h),6.6(s,2h),5.1(s,2h),4.8(s,2h),4.7(s,2h),3.7(d,9h),3.7(s,3h).收率80％。

化合物(6j):¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.0(s,1h),7.1(d,2h),6.9(d,2h),6.6(s,2h),5.1(s,2h),4.8(s,2h),4.6(s,2h),3.9(s,3h),3.7(d,9h),3.7(s,3h).收率86％。

化合物(6k):¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.9(s,1h),7.6(dd,2h),7.4(d,1h),7.1(t,3h),7.0(t,1h),6.8(d,2h),6.6(s,2h),6.4(d,1h),5.5(s,2h),5.1(s,2h),4.8(s,2h),3.7(s,3h),3.7(s,6h),3.6(s,3h).收率80％。

化合物(6l):¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.1(t,1h),7.8(s,1h),7.7(d,2h),7.4(d,2h),7.1(d,2h),6.9(d,2h),6.6(s,2h),5.1(s,2h),4.8(s,2h),4.0(d,2h),3.7(s,9h),3.7(s,3h),2.4(s,3h).收率96％。

实施例2上述化合物的抗肿瘤活性测定：

筛选所用化合物均是由本发明合成、纯化而得；样品储备液：称取1-2mg样品置于2mlep管中，然后用dmso配制成溶液，4℃保存放置，实验时根据所需浓度利用培养基稀释。取对数生长期的细胞，消化计数后，用培养基调整细胞密度，以4000-5000个cell/孔接种至96孔板中，每孔150μl，培养24h后，弃去培养基，加入用培养基稀释好的药物(50μg/ml、100μg/ml)，每个浓度设6个复孔，另设空白对照组及阴性对照组。药物作用72h后，每孔加入20μlmtt，继续培养4h后，吸去液体，加入150ml的dmso，振荡均匀，酶标仪490nm处检测吸光度值，计算抑制率，计算公式如下：抑制率(％)＝(1-给药组吸光度值/空白组吸光度值)×100％，50μg/ml时抑制率大于50％的样品，重新设置浓度进行细筛。试验结果采用spss软件计算ic50值和相关系数。实验结果见表1。

表1化合物抑制瘤细胞株的ic50值

^a每个数值用平均值±标准偏差(mean±sd)表示，方差分析：p<0.05，5-fu：5-氟尿嘧啶,colchicine:秋水仙碱

实施例3化合物6c的tubulin聚合抑制活性测定：

将提取的微管蛋白重悬于冰冷的g-pem缓冲液中(80mmpipesph5.9,5mmmgcl2,1mmegta,1mmatp,5％(v/v)glycerol)，取100ul加至包含100ul化合物6c的96孔板内，微管蛋白终浓度为5.6g/l，药物浓度设置0um，1um，2um，4um四个梯度，样品充分混匀，分光光度计检测微管蛋白的聚合，间隔5min，总计60min，ic50值在30分钟使用graphpad软件计算得到。化合物6c的微管蛋白聚合抑制活性的ic50值为2.17μm,说明化合物6c确实能够结合微管蛋白，抑制其聚合，结果见图1。