一种用于人类BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒与流程

本发明涉及生物技术的基因突变检测领域，更具体涉及一种用于人类brca1和brca2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒。
背景技术：
：乳腺癌的高发病率已经严重威胁女性健康，是女性最常见的癌症之一。乳腺癌可分为散发性和遗传性两大类，目前认为大多数遗传性乳腺癌是由于基因突变引起的，其中brca1和brca2是迄今为止已发现的最直接的乳腺癌易感基因。研究表明，携带brca1和brca2基因突变的人群，乳腺癌患病风险和复发风险均高于普通人群，其中携带brca1和brca2基因致病性突变的女性一生中发生乳腺癌的风险最高可达87％。不仅如此，brca1/2基因还是卵巢癌易感基因，据统计brca1基因突变携带者一生患卵巢癌的风险是15％～45％，brca2基因突变携带者患卵巢癌的风险是10％～20％。brca1编码区已经发现的突变有几百种，而brca2编码区的突变多达上千种。鉴于brca1/2基因突变带来的危害，欧洲肿瘤协会(emso)指南(2011)、美国国立综合癌症网络(nccn)指南(2014)以及《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2013版)》，已将brca1和brca2基因检测列入其中。brca1基因定位于人类17号染色体长臂12-21区，长约80kb，包含24个外显子，其基因产物是1863个氨基酸所构成的磷酸化蛋白质。brca2基因位于13号染色体长臂12-13区，长约70kb，包含27个外显子，所编码的蛋白含有3418个氨基酸。brca1/2基因都是肿瘤抑制基因，参与细胞周期的调控、基因转录的调控、dna损伤的修复及凋亡等重要的细胞活动，在维持基因组稳定性中起很重要的作用。一旦brca1/2基因发生突变，致使其无法正常编码合成蛋白产物或合成的蛋白产物功能缺失，其抑癌作用将会受到影响，极大的增加癌症发生的风险。此外，brca基因的突变还与胰腺癌、恶性黑色素瘤和男性前列腺癌有关；筛选brca基因的突变越来越受到研究者的关注。目前医院对于乳腺癌的诊断主要靠检查双侧乳腺、乳腺x线摄影(乳腺钼靶照相)、乳腺磁共振检查(mri)等，这样诊断发现的乳腺癌一般已到晚期，很难治愈。通过对brca1/2基因的检测，寻找其致病突变位点，筛检出乳腺癌、卵巢癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群，利于该类疾病的早期诊断治疗和风险评估。而此前美国国家癌症研究所发布的《brca1andbrca2:cancerriskandgenetictesting》指南也指出：先对家族中罹患乳腺癌或卵巢癌的患者进行基因检测，如果发现该患者带有有害的brca1或brca2基因突变，那么家族中的其它成员可再进行基因检测，观察是否也有存在有害突变，此种做法有很高的临床价值。目前，普遍应用的brca1/2基因突变检测方法主要有以下几种：荧光定量pcr技术，该技术灵敏度高、特异性强、自动化程度高，但是会存在样品污染、假阳性高的情况，并且每次只能检测一种类型的突变，无法完全覆盖brca1/2基因全编码区，而brca1/2基因检测难度较大，没有热点变异，变异遍布于2个基因的全长。限制小片段长度多态性分析法(rflp法)用于检测酶切位点改变的基因，可直接判断基因型，但是不能用于没有产生新酶切位点的基因检测；此外，rflp实验操作繁琐，检测周期长，成本高，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，同样容易污染，难以满足临床检测要求。sanger测序法，从检测灵敏度上讲，sanger测序法一般只能检测20％以上突变率的变异，对brca1/2基因全部编码序列检测来说，周期较长，成本昂贵，操作复杂，检测通量比较低，很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，很难满足实际应用的需要。因此，临床上迫切需要开发一种相对快捷、操作简便、检测周期短、针对性强、检测结果准确可靠的brca1/2基因突变检测方法。而新一代高通量测序(ngs)技术具有很高的敏感性和特异性，随着该技术的成熟及测序成本的持续降低，使用ngs技术进行brca1/2基因突变检测是未来市场的趋势。技术实现要素：本发明目的在于提供了一种基于多重pcr和高通量测序技术的用于检测与人类遗传易感性相关的brca1和brca2基因全编码序列突变位点的引物、方法和试剂盒，旨在解决现有技术中成本高、步骤多，灵敏度低、周期长和易污染等问题。在本发明的一方面，提供一种检测brca1和brca2基因突变的引物，其中通用引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示；用于扩增brca1基因全编码序列突变位点的特异性引物序列如seqidno.3～52所示；用于扩增brca2基因全编码序列突变位点的特异性引物序列如seqidno.53～134所示。本发明的另一方面提供一种brca1和brca2基因突变位点检测试剂盒，主要成分如下：本发明的另一方面提供一种brca1和brca2基因突变位点检测的多重pcr体系：本发明再一方面，提供一种brca1和brca2基因突变位点检测方法，包括以下步骤：a.抽提血液、口腔拭子等受试样品dna。b.多重pcr法扩增待测样本基因组的目标区域：1)准备无菌、无核酸酶的200μlpcr管，置于冰上。2)配制多重pcr体系，轻轻吹打混匀，离心后将管子置于冰上。3)将管子置于pcr仪中，按以下程序运行：c.使用磁珠纯化文库。d.对得到的文库进行高通量测序并分析brca1和brca2基因突变信息。本发明的有益效果在于：本发明基于高通量测序平台，采用了特异性引物和多重pcr技术，可以快速、准确的实现brca1和brca2基因突变的检测。本发明：(1)提供一种新的引物设计，按100％扩增覆盖brca1和brca2基因编码区设计，在大幅降低引物二聚体形成的同时，扩增子中容纳更长的真实序列，从根本上提高了引物特异性，提高扩增效率；(2)使用新型多重pcr技术，控制特异性引物只在最初靶标捕获的两个循环中发挥作用，之后会自动切换到由通用引物引导的以相同效率进行的文库扩增，获得均一性非常高的文库；(3)操作简单，5分钟人工操作，即可一步完成brca1和brca2基因的靶向文库制备工作，节约成本，临床应用范围广；(4)全程无额外开管处理过程，避免由人工带入的污染风险。附图说明为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：图1.3％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物示意图。箭头标注处是目标条带区域。50m：50bpdnaladder(thermo)；t1：tube1文库构建pcr产物；t2：tube2文库构建pcr产物。图2.agilent2100bioanalyzer对文库进行质检示意图。方框处标注为目标文库区域。图3.sample7中chr17:41243776cct>csanger突变验证标示图。图4.sample10中chr17:41223094t>csanger突变验证标示图。图5.sample11中chr17:41223094t>csanger突变验证标示图。图6.sample12中chr17:41223094t>csanger突变验证标示图。具体实施方式下面结合实施例进一步说明
发明内容，但不应理解为对该发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1通过检测已知突变类型及频率的标准品进行本试剂盒的性能验证。a.标准品dna定量使用novagenhumangenomicdna(merck，货号69237)作为标准品dna模板，使用荧光定量仪及相应定量试剂(invitrogen)进行定量，浓度是100ng/ul。b.多重pcr法扩增样本基因组的目标区域。1).准备无菌、无核酸酶的200μlpcr管，置于冰上；按下表配制pcr反应体系，小心避免交叉污染。组分体积2×pcr混合液6.25μl特异性引物2.0μl通用引物r50.5μl通用引物r70.5μldna模板，50ngxμl无核酸酶水3.25-xμl总体积12.5μl2).轻轻吹打混匀，离心，将管子置于冰上。3).将管子置于pcr仪中，按以下反应程序运行：c.使用磁珠纯化文库1).向pcr产物中补加nuclease-free水至50μl后转移至一个新的无核酸酶的离心管，加入50μl经过充分混匀的beads(室温)，吹打混匀；2).室温孵育5min后，将离心管置于磁力架上5min，小心吸弃上清；3).保持离心管在磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，放置30s，吸弃上清，重复乙醇清洗步骤1次；4).两次乙醇清洗后，室温放置5min，确保乙醇完全去除(注：为防止吸弃beads，在第一次弃乙醇时，可调整移液枪到95μl，富余5μl，第二次正常加入乙醇以及弃去乙醇，最后用小枪头，吸弃残余的5μl乙醇；)5).将离心管从磁力架取下并加入50μl10mmtris-hcl(ph8.0)，轻轻吹打重悬磁珠。室温放置5min后将离心管置于磁力架上室温5min直到溶液澄清。转移上清至一个新的无核酸酶管，勿扰动磁珠。6).转移上清至一个新的无核酸酶管并加入50μl经过充分混匀的beads(室温)，吹打混匀；7).重复第2-4步。用15μl10mmtris-hcl(ph8.0)，轻轻吹打重悬磁珠。室温放置5min后将离心管置于磁力架上室温5min直到溶液澄清。转移上清到新的200μlpcr管中。8).特异性纯化后的文库使用agilent2100仪器进行定量和质检，并对所得高通量文库进行illuminamiseq平台150bp双端测序，数据量要求2g碱基对。d.结果分析1).数据分析将测序下机后的数据进行数据质量分析，并去除无效数据，比对人类基因组(hg19)，使reads对应到相应的基因组位置，通过软件比对，得到突变类型及频率信息。2).sanger验证结果选择三个位点进行sanger验证。结果如表1所示。表1.突变类型及频率信息结果显示，采用本试剂盒构建文库并ngs测序的检测结果与传统金标准sanger测序结果一致。说明本试剂盒的特异性和准确性很高。实施例2检测20例乳腺肿瘤患者brca1/2基因突变。a.患者全血基因组dna提取使用血液基因组dna提取试剂盒(天根，货号dp318-02)对患者外周血样本进行基因组dna提取，操作如提取试剂盒说明书所述。使用荧光定量仪及相应定量试剂(invitrogen)进行定量。定量结果如表2所示。表2.样本定量结果b.多重pcr法扩增样本基因组的目标区域。1).准备无菌、无核酸酶的200μlpcr管，置于冰上；按下表配制pcr反应体系，小心避免交叉污染。组分体积2×pcr混合液6.25μl特异性引物2.0μl通用引物r50.5μl通用引物r70.5μldna模板，50ngxμl无核酸酶水3.25-xμl总体积12.5μl2).轻轻吹打混匀，离心，将管子置于冰上。3).将管子置于pcr仪中，按以下反应程序运行：c.使用磁珠纯化文库1).向pcr产物中补加nuclease-free水至50μl后转移至一个新的无核酸酶的离心管，加入50μl经过充分混匀的beads(室温)，吹打混匀；2).室温孵育5min后，将离心管置于磁力架上5min，小心吸弃上清；3).保持离心管在磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，放置30s，吸弃上清，重复乙醇清洗步骤1次；4).两次乙醇清洗后，室温放置5min，确保乙醇完全去除(注：为防止吸弃beads，在第一次弃乙醇时，可调整移液枪到95μl，富余5μl，第二次正常加入乙醇以及弃去乙醇，最后用小枪头，吸弃残余的5μl乙醇；)5).将离心管从磁力架取下并加入50μl10mmtris-hcl(ph8.0)，轻轻吹打重悬磁珠。室温放置5min后将离心管置于磁力架上室温5min直到溶液澄清。转移上清至一个新的无核酸酶管，勿扰动磁珠。6).转移上清至一个新的无核酸酶管并加入50μl经过充分混匀的beads(室温)，吹打混匀；7).重复第2-4步。用15μl10mmtris-hcl(ph8.0)，轻轻吹打重悬磁珠。室温放置5min后将离心管置于磁力架上室温5min直到溶液澄清。转移上清到新的200μlpcr管中。8).特异性纯化后的文库使用agilent2100仪器进行定量和质检，并对所得高通量文库进行illuminamiseq平台150bp双端测序，数据量要求2g碱基对。d.结果分析1).数据分析将测序下机后的数据进行数据质量分析，并去除无效数据，比对人类基因组(hg19)，使reads对应到相应的基因组位置，通过软件比对得到变异类型及频率信息。表6.患者文库扩增子覆盖深度信息uniformity(0.2×meancoverage)*：指高于所有扩增子平均值20％的阈值的扩增子占总扩增子的比例。比例越高，说明多重pcr体系越均一，试剂盒性能越好。percentreadsontarget(mapped/mappable)*：指所得数据中可以比对到扩增子序列的数据占总测序数据的比例。比例越高，说明文库质量越高。如表6所示，该试剂盒的多重pcr体系均一性高，所扩增出来的文库质量同样很高。2).sanger验证结果表7.患者外周血样本突变信息表8.患者外周血样本突变信息从表7、表8中选择sample7,sample10,sample11,sample12等4个样本的2个位点进行sanger验证。图3为sample7突变验证——chr17:41243776cct>c，参考序列:gaggagaatttattatcattgaagaatagcttaaatgactgc，测序序列一：gaggagaatttattatcatt，测序序列二：ggagaatttattatcatt，与参考序列相比缺少ag，也就是少了ct；图4为sample10验证：chr17:41223094位置无t>c突变；图5为sample11验证：chr17:41223094位置t>c突变50％；图6为sample12验证：chr17:41223094位置t>c突变100％。ngs检测与sanger验证对照结果如表9所示。表9.ngs检测与sanger验证对照结果从表9可知，使用两个平台对同一病人样本进行检测所得的突变频率具有极高的符合性。该结果证明本试剂盒的性能的准确性及稳定性。序列表<110>杭州链康医学检验实验室有限公司<120>一种用于人类brca1和brca2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒<130>2018<160>131<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>65<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgggtttttagcaagcagtgtaaccgggaactctcgtctaatagattgcattttggtctt60ctgtt65<210>2<211>72<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gttaaaactaaggtgggatgtgtaaccgggaactctcgtctaatagattgctctttgaat60attattggagtt72<210>3<211>65<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tcttataatcagctggctgtgtaaccgggaactctcgtctaatagattgggatgaaagag60aacat65<210>4<211>64<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcaaactgaaaaacctctgtgtaaccgggaactctcgtctaatagattgttttcactgtg60cgaa64<210>5<211>72<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tcccagtatagaggagacttgtgtaaccgggaactctcgtctaatagattttagcataaa60aatcagattcat72<210>6<211>71<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6actaagtcataaaaataaaccaggtagtgtaaccgggaactctcgtctaatagattggga60tttgctttgtt71<210>7<211>71<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7tccttaatgatcagggcagtgtaaccgggaactctcgtctaatagattttcttgtaaata60cacatttgcta71<210>8<211>65<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gactttctcaaaggcttgtgtaaccgggaactctcgtctaatagattgtttttgcattct60agtga65<210>9<211>76<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gttcaactaaacagaggacgtgtaaccgggaactctcgtctaatagattgtgattttaaa60ctataatttttgcaga76<210>10<211>71<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ttgactttccaatgtgggtgtaaccgggaactctcgtctaatagattttctacataaact60gtttctatgag71<210>11<211>67<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ttcatttaaagtaaatagctgcagtgtaaccgggaactctcgtctaatagatttcagcgt60ttgcttc67<210>12<211>62<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12acggtacaacttccttgtgtaaccgggaactctcgtctaatagattactagcaagactag60ga62<210>13<211>65<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gccctttgagagtgggtgtaaccgggaactctcgtctaatagatttttcttttgttctct60gtgtc65<210>14<211>69<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14gccactggagaagttcgtgtaaccgggaactctcgtctaatagattaaatatttcagaaa60aagacctat69<210>15<211>66<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15gcatcttgaatctcatacaggtgtaaccgggaactctcgtctaatagattttctgtgagc60aaacag66<210>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