本发明涉及一种酶活提高的l-天冬酰胺酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术和酶工程领域。
背景技术：
l-天冬酰胺酶能够通过水解脱氨基反应将l-天冬酰胺催化形成l-天冬氨酸和氨。目前escherichia.coli，erwiniachrysanthemi及erwin-iacarotovora等微生物来源的l-天冬酰胺酶已经被广泛应用于治疗多种疾病，如急性淋巴白血病和淋巴肉瘤等。但是，该酶的半衰期短、酶活性低、具有副催化反应等缺陷导致在临床应用时会出现一些较严重的不适应性。
食品行业中，利用l-天冬酰胺酶处理食品，常使用“热烫法”，即将食品置于较高温度(如95℃)的水中，并加入l-天冬酰胺酶通过酶反应来降低食品中l-天冬酰胺的含量。由于l-天冬酰胺是致癌物质丙烯酰胺的主要前体物质，因此通过在食品预加工时加入l-天冬酰胺酶，可以有效降低高温加工食品中的丙烯酰胺含量(lwt-foodscienceandtechnology,2011,44(6):1473-1476；molecularnutrition&foodresearch,2009,53(12):1532-1539；extremophiles，2015,19(4))。
为了提高l-天冬酰胺酶在工业中的应用潜力，满足工业生产需求，我们需要不断寻找具有较好的热稳定性以及更高酶活的l-天冬酰胺酶，使其能在复杂的食品加工处理过程中保持较高的酶活，提高“热烫法”的应用效率。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种酶活提高的l-天冬酰胺酶突变体，所述突变体通过将出发氨基酸序列如seqidno.1所示的第22位氨基酸进行突变得到的。将以编码此突变体的基因为目的基因、以pma5-e22k为表达载体、以枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168为表达宿主构建得到的重组枯草芽孢杆菌工程菌发酵24h，可使得发酵液中l-天冬酰胺酶的酶活提高至2037.13u/mg。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种酶活提高的l-天冬酰胺酶突变体，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为seqidno.1的l-天冬酰胺酶的第22位氨基酸进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为seqidno.1的l-天冬酰胺酶的第22位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸得到的；
在本发明的一种实施方式中，所述l-天冬酰胺酶的来源为嗜热嗜压古菌(pyrococcusyayanosiich1)。
本发明提供了编码上述一种酶活提高的l-天冬酰胺酶突变体的基因。
本发明提供了携带上述基因的重组表达载体。
本发明提供了一种表达所述l-天冬酰胺酶突变体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以枯草芽孢杆菌为宿主。
本发明提供了所述基因工程菌的制备方法，所述方法是在seqidno.2所示核苷酸序列的基础上，将编码第22位的谷氨酸的密码子突变成编码赖氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主菌中即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pma5-e22k。
在本发明的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是：
(1)以seqidno.2所示核苷酸序列为模板，以f1primer(序列如seqidno.3所示)和r1primer(序列如seqidno.4所示)、f2(序列如seqidno.5所示)和r2(序列如seqidno.6所示)为引物，进行pcr，得到编码第22位谷氨酸突变成赖氨酸的l-天冬酰胺酶突变体基因序列如seqidno.7所示；
(2)将步骤(1)得到的重组基因序列，连接到pma5表达载体中，得到重组质粒pma5-e22k，重组质粒化转化到枯草芽孢杆菌宿主中，获得重组枯草芽孢杆菌基因工程菌。
本发明提供了上述一种酶活提高的l-天冬酰胺酶突变体在食品领域的应用。
有益效果：
本发明通过将出发氨基酸序列为seqidno.1的l-天冬酰胺酶的第22位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸得到了酶活提高的l-天冬酰胺酶突变体。将以编码本发明突变体的基因为目的基因、以pma5-e22k为表达载体、以枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168为表达宿主，构建得到的重组枯草芽孢杆菌工程菌发酵24h，可使得发酵液中l-天冬酰胺酶突变体的酶活提高至2037.13u/mg，较原始酶酶活(约1483.81u/mg)相比提高了约37.3％。本发明表明第22位氨基酸残基对l-天冬酰胺酶的催化作用有较大影响，对该酶催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的在食品行业中的应用潜力。
具体实施方式
本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
酶活检测方法：反应体系：100μl适当稀释酶液、800μl25mmol·l-1l-天冬酰胺溶液(用50mmol·l-1、ph8tris-hcl缓冲液溶解l-天冬酰胺)，在设定温度水浴中反应15min，加入100μl质量体积百分浓度为15％(w·v-1)的三氯乙酸溶液(tca)终止反应。对照组在酶反应前加入100μl质量体积百分浓度为15％的tca提前终止酶促反应。反应后在10000g转速下常温离心10min，收集上清液。显色反应体系为：200μl离心上清液、4.8mlddh2o、200μl奈斯勒试剂，混匀后室温静置10-15min，于450nm波长处读取吸光度。在相同条件下绘制硫酸铵标准曲线，分别吸取0、20、30、40、50、60、70和80μl的硫酸铵标准溶液(20mmol·l-1)于离心管中，再分别加入50mmol·l-1、ph7.5tris-hcl缓冲液定容至100μl，最后再在每个离心管中分别加入800μl的25mmol·l-1l-天冬酰胺溶液和100μl的tca溶液。混匀后10000g条件下离心10min，取200μl上清液加入到4.8ml去离子水中，加入200μl奈斯勒试剂，室温静置10min，于450nm波长处读取吸光度。以铵离子含量为纵坐标，以其对应的吸光度为横坐标，即可以绘出标准曲线。l-天冬酰胺酶的酶活通过测定酶促反应所生成氨的量来计算。
最适温度和最适ph：设置60、70、80、85、90、95、100℃设置7个反应温度。在不同温度下，测定纯酶的酶活，以确定最适温度；分别用0.05mol醋酸盐缓冲液(ph4-6)、pb缓冲液(ph6-7)、tris-hcl缓冲液(ph7-9)、甘氨酸-naoh缓冲液(ph9-10)与底物l-天冬酰胺配置成ph从4到10的反应缓冲体系，测定纯酶的酶活，以确定最适ph。
动力学参数测定：用ph7、50mmoltris-hcl缓冲液配制(0.05-4.0mmol·l-1)的l-天冬酰胺底物溶液，加入100μll-天冬酰胺酶纯酶液，在最适温度下与底物反应，测定酶活，利用lineweaver-burk双倒数法作图计算得到动力学参数。
酶活单位定义：在一定条件下每分钟内产生1μmol氨气所需的酶量为1个酶活单位。
蛋白浓度测定方法：bradford法。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
lb培养基(g/l)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，nacl10，ph7.0，121℃灭菌20min。
实施例1含l-天冬酰胺酶突变体的重组载体的构建
(1)e22k突变体的获得：以seqidno.2所示核苷酸序列为模板，f1primer(序列如seqidno.3所示)和r1primer(序列如seqidno.4所示)、f2(序列如seqidno.5所示)和r2(序列如seqidno.6所示)为引物，进行重叠延伸pcr即得到seqidno.7所示的重组基因。
(2)将重组基因与pma5分别用bamhi、mlui双酶切，纯化后用t4dna连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化jm109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/l)lb平板，挑取转化子，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，送生工生物工程(上海)有限公司进行测序正确后，命名为pma5-e22k。
实施例2产l-天冬酰胺酶枯草芽孢杆菌工程菌构建
将实施例1得到的重组质粒pma5-e22k化学法转化入b.subtilis168感受态细胞，具体方法如下：
(1)转化实验所需溶液如下(g/l)：
sp-a：(nh4)2so44，k2hpo428，柠檬酸钠12；sp-b：mgso4·7h2o0.4。
100×caye：casaminoacid20，酵母粉100；spi培养基：sp-a49％，sp-b49％，50％，葡萄糖2％，100×caye2％；spii培养基：spi培养基98％，50mmol/lcacl21％，250mmol/lmgcl21％。115℃湿热灭菌。
(2)将b.subtilis168的单菌落接种至2mlspi培养基中(50ml离心管)，37℃、200r/min培养过夜；
(3)取100μl培养液至5mlspi培养基中，37℃、200r/min培养至对数期(od600值为1左右)，约4～5h；
(4)取200μl培养液至2mlspii培养基中，37℃、200r/min培养90min，取出后加入20μl10mmol/legta，于37℃、200r/min继续培养10min，然后分装成500μl每管，加入5μl重组质粒pma5-e22k，混匀，37℃、200r/min培养90min，取菌液涂布抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。得到重组菌b.subtilis168/pma5-e22k。
实施例3重组菌b.subtilis168/pma5-e22k的表达及酶活测定
将实施例2构建的重组菌b.subtilis168/pma5-e22k与表达未突变的酶的对照菌株b.subtilis168/pma5-asnase分别接种于l0ml含卡那霉素的lb培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按0.5％的接种量转接于100mllb培养基中，37℃培养24h，取发酵液于4℃、10000r/min离心l0min，保留胞外上清液，细胞破碎后再收集胞内上清液，将胞内外的上清液混合后，用akta蛋白纯化仪及1mlhistraptmhp型镍柱，进行镍柱亲和层析法纯化，得到的纯酶液用于酶活测定。
结果表明，重组菌b.subtilis168/pma5-e22k表达的l-天冬酰胺酶突变体的酶活为2037.13u/mg(酶蛋白)，较原始酶酶活(约1483.81u/mg)相比提高了约37.3％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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