动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液及制备方法与流程

本发明属于生物组织、细胞洗涤相关的技术领域，尤其涉及一种动物和人胰腺消化后的组织、细胞洗涤溶液及制备方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：

组织和细胞治疗将引领未来的医学革命，包括肿瘤细胞的免疫治疗、干细胞治疗、原代组织和细胞的移植治疗等。组织、细胞治疗是指将正常的或生物工程改造过的来源于自体或其他动物体的组织或细胞移植或输入患者体内，新输入的组织或细胞可以替代原受损的组织或细胞、或者具有更强的免疫杀伤功能，从而达到治疗疾病的目的。组织、细胞移植在治疗癌症、血液病、心血管病、糖尿病、老年痴呆症等方面显示出越来越高的应用价值。与大器官移植等治疗方式相比较，往往治疗效果无差异，但手术操作更简单，副作用更小。

胰岛移植是指提取和分离供体胰腺中的胰岛细胞团，并将其培养或不培养后，移植至患者体内，可补充患者缺失的胰岛素分泌细胞，协助患者维持血糖平衡。该技术目前也已在国际上多个国家纳入了医保。而在中国，胰岛移植起步较早，但技术一直落后于国外，导致临床结果不好。自2000年加拿大埃德蒙顿方案公布以来，我国的胰岛移植工作也紧跟国际行业发展步伐，目前国内也已有几家医疗机构在进行胰岛移植的临床应用。

胰岛移植包括胰岛分离和移植两个过程，其中分离的胰岛质量的好差、数量的多少，直接关系到后续移植的成败。胰岛分离的过程非常复杂，耗时较长。胰腺器官到达胰岛分离实验室后，分离胰岛的过程主要包括以下几方面：(1)胰腺器官的修剪。主要为去除胰腺表面多余的脂肪组织、被膜、结缔组织和血管等；(2)器官消化。主要为将消化酶(一般为胶原酶)通过胰管灌注至胰腺中，再剪碎后放至消化罐中，将胰腺组织中的胰岛细胞团与外分泌腺组织分离；(3)组织洗涤。将消化后的组织中的胶原酶去除，同时尽量减少对消化后组织的损伤，需在低温下用专门的洗涤液，将胰腺外分泌组织和游离的胰岛细胞团进行清洗；(4)胰岛纯化。采用cobe2991机进行连续或非连续密度梯度纯化，将组织中的胰岛细胞团进行富集和收集。纯化后的胰岛组织可直接移植，或者培养后移植。其中消化后组织的洗涤是胰岛分离过程中重要的一环，需要有一特殊的洗涤液，保证细胞尽量不水肿，并能维持组织和细胞的活性。

综上所述，现有技术存在的问题是：

目前市场还没有一种专门用于胰腺消化后组织、细胞专用的洗涤溶液，尤其是针对大动物猪、狗或人的胰腺组织消化后的胰腺组织的洗涤液。人用的胰腺组织消化后洗涤液一般由两种溶液组成，其中一种溶液为含羟乙基淀粉的生理盐水溶液，另一种溶液成分未明。两种溶液经一定的配比混合后，作为消化后胰腺组织的洗涤液，或者直接采用rpmi1640溶液、hanks溶液或者hbss溶液进行消化后组织的清洗。这些溶液的缺陷在于(1)临时配制，增加溶液被细菌污染的机会；(2)配制方法复杂，增加胰岛分离过程中时间的消耗；(3)两种溶液的保存条件不同，增加存放试剂的负担；(4)市场上现有的一些细胞洗涤试剂成分比较少，比如hbss等，不利于缓解消化后组织、细胞的损伤。

解决上述技术问题的难度和意义：

为解决上述问题，本发明设计了一种动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液，主要用于实验用小鼠、大鼠、家兔、犬、猪、猴等动物和捐献人的胰腺器官在胰腺消化后和纯化提取胰岛细胞团前，洗涤这些消化后组织。所述动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液由泛影酸钠30.0-52.0g、l-精氨酸250mg、l-门冬酰胺62.5mg、l-门冬氨酸25mg、l-胱氨酸二盐酸盐81.4375mg、l-谷氨酸25mg、甘氨酸12.5mg、l-组氨酸18.75mg、l-羟脯氨酸25mg、l-异亮氨酸62.5mg、l-亮氨酸62.5mg、l-赖氨酸盐酸盐50mg、l-甲硫氨酸18.75mg、l-苯丙氨酸18.75mg、l-脯氨酸25mg、l-丝氨酸37.5mg、l-苏氨酸25mg、l-色氨酸6.25mg、l-酪氨酸28.9875mg、l-缬氨酸25mg、对氨基苯甲酸1.25mg、硝酸钙125mg、无水硫酸镁61.05mg、磷酸氢二钠845.1625mg、氯化钾5587.5mg、氯化钠10200-20400mg、还原谷胱甘肽1.25mg、生物素0.25mg、d-泛酸钙0.3125mg、叶酸1.25mg、i-肌醇43.75mg、烟酰胺1.25mg、氯化胆碱3.75mg、盐酸吡哆醇1.25mg、核黄素0.25mg、盐酸硫胺素1.25mg、维生素b12

0.00625mg、l-谷氨酰胺375mg和羟乙基淀粉/13040.0-160.0g组成，注射用水定容至1000ml。该溶液配方以细胞培养基rpmi1640溶液配方为基础，结合血容量维持成分羟乙基淀粉/130和密度调节成分泛影酸钠构成。配方中rpmi1640的基础液中富含多种细胞营养所需的成分，提供了细胞良好的营养保证；羟乙基淀粉/130是现在临床上广泛使用的人工合成的胶体溶液，同时也是一种天然多糖，成分毒性小；其与氯化钠一起配制的羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液，是一种无色或淡黄色略带粘性的澄明液体，在临床上广泛用于静脉输注，治疗和预防血容量不足，急性等容血液稀释；也是器官保存液uw液中的主要成分之一。泛影酸钠为临床常用的含碘苯甲酸盐类造影剂，主要用于泌尿系造影，亦用于心血管、脑血管、周围血管、胆管等造影及各种注入法造影，如关节腔，子宫输卵管及瘘管等造影，毒性小；也常添加于密度梯度液中作为辅助成分，保证溶液有一定的密度，可用于后续密度梯度分离液的配制和保证细胞分离效果。该洗涤溶液配方成分有助于维持细胞的渗透压和张力，消除组织消化液中的胶原酶、细胞破碎释放的细胞因子、炎性因子等成分，并能维持细胞良好的营养环境。

综上所述，现有的胰腺消化后组织、细胞洗涤液还存在较多缺陷。本产品经过本发明人团队几年的共同努力，反复试用，逐步完善了洗涤液的配方和配制工艺，使胰腺组织消化后的胰岛组织、细胞洗涤过程变得简单，并有利于保护组织和细胞的活性，为后续胰岛细胞团的进一步纯化奠定了基础。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液及制备方法。

本发明是这样实现的，一种动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液，主要用于实验用小鼠、大鼠、家兔、犬、猪、猴等动物和捐献人的胰腺器官在胰腺消化后和纯化提取胰岛细胞团前，洗涤这些消化后组织。所述动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液由泛影酸钠30.0-52.0g、l-精氨酸250mg、l-门冬酰胺62.5mg、l-门冬氨酸25mg、l-胱氨酸二盐酸盐81.4375mg、l-谷氨酸25mg、甘氨酸12.5mg、l-组氨酸18.75mg、l-羟脯氨酸25mg、l-异亮氨酸62.5mg、l-亮氨酸62.5mg、l-赖氨酸盐酸盐50mg、l-甲硫氨酸18.75mg、l-苯丙氨酸18.75mg、l-脯氨酸25mg、l-丝氨酸37.5mg、l-苏氨酸25mg、l-色氨酸6.25mg、l-酪氨酸28.9875mg、l-缬氨酸25mg、对氨基苯甲酸1.25mg、硝酸钙125mg、无水硫酸镁61.05mg、磷酸氢二钠845.1625mg、氯化钾5587.5mg、氯化钠10200-20400mg、还原谷胱甘肽1.25mg、生物素0.25mg、d-泛酸钙0.3125mg、叶酸1.25mg、i-肌醇43.75mg、烟酰胺1.25mg、氯化胆碱3.75mg、盐酸吡哆醇1.25mg、核黄素0.25mg、盐酸硫胺素1.25mg、维生素b12

0.00625mg、l-谷氨酰胺375mg和羟乙基淀粉/13040.0-160.0g组成，注射用水定容至1000ml。

进一步，所述动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液的密度：1.026-1.032g/cm³。

本发明的另一目的在于提供一种所述动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液的制备方法，所述本发明实施例提供的动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液的制备方法包括以下步骤：

步骤一，在b级洁净区中放置一灭菌的1l玻璃瓶；

步骤二，称取羟乙基淀粉/130至1l灭菌后玻璃瓶中，加入准确称取的泛影酸钠，加入其他成分，加入注射用水定容至1000ml；用电子密度计测定密度为1.026-1.032g/cm³，如果没有，则加入泛影酸钠或rpmi1640进行密度调整；

步骤三，用渗透压测定仪测定溶液的渗透压是否为400-450mosm/kg；内毒素测定确定内毒素含量是否<0.25eu/ml；

步骤四，测定溶液的ph值是否为7.0±0.5；必要时加1m(1mol/l)naoh水溶液调节。

步骤五，在b级背景下局部a级洁净区分别用0.45μm和0.22μm微孔滤膜过滤，500ml/瓶分装；

步骤六，盖紧瓶盖，并用塑料封盖膜热封；细菌培养结果为无菌。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明用于洗涤细胞的洗涤液，配方中结合细胞营养成分、渗透压和张力维持成分、密度调节成分，相比于市场上普通的细胞洗涤溶液，可更好的维持细胞的渗透压和营养环境，有助于提高细胞的活性；可直接应用，减少临用前配制，方便操作，尤其在细胞分离过程中，需要尽量精简操作，减少细胞污染的机会；本发明制备的细胞洗涤溶液，经过多次洗涤人和动物胰腺消化后组织的试验，结果稳定可靠，洗涤完后组织或细胞可直接进行纯化，细胞纯度高。

附图说明

图1是本发明实施例提供的胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液的制备方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液由泛影酸钠30.0-52.0g、l-精氨酸250mg、l-门冬酰胺62.5mg、l-门冬氨酸25mg、l-胱氨酸二盐酸盐81.4375mg、l-谷氨酸25mg、甘氨酸12.5mg、l-组氨酸18.75mg、l-羟脯氨酸25mg、l-异亮氨酸62.5mg、l-亮氨酸62.5mg、l-赖氨酸盐酸盐50mg、l-甲硫氨酸18.75mg、l-苯丙氨酸18.75mg、l-脯氨酸25mg、l-丝氨酸37.5mg、l-苏氨酸25mg、l-色氨酸6.25mg、l-酪氨酸28.9875mg、l-缬氨酸25mg、对氨基苯甲酸1.25mg、硝酸钙125mg、无水硫酸镁61.05mg、磷酸氢二钠845.1625mg、氯化钾5587.5mg、氯化钠10200-20400mg、还原谷胱甘肽1.25mg、生物素0.25mg、d-泛酸钙0.3125mg、叶酸1.25mg、i-肌醇43.75mg、烟酰胺1.25mg、氯化胆碱3.75mg、盐酸吡哆醇1.25mg、核黄素0.25mg、盐酸硫胺素1.25mg、维生素b120.00625mg、l-谷氨酰胺375mg和羟乙基淀粉/13040.0-160.0g组成，注射用水定容至1000ml。

本发明实施例提供的动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液的密度：1.026-1.032g/cm³。

如图1所示，本发明实施例提供的动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液的制备方法包括以下步骤：

s101：在b级洁净区中放置一灭菌的1l玻璃瓶；

s102：准确称取羟乙基淀粉/130至1l灭菌后玻璃瓶中，加入准确称取的泛影酸钠，再加入其他成分，加入注射用水定容至1000ml；用电子密度计测定密度为1.026-1.032g/cm³，如果没有，则可少量加入泛影酸钠或配方调整后的rpmi1640进行密度调整；

s103：用渗透压测定仪测定溶液的渗透压是否为400-450mosm/kg；内毒素测定确定内毒素含量是否<0.25eu/ml；

s104：测定溶液的ph值是否为7.0±0.5，必要时加1m(1mol/l)naoh水溶液调节；

s105：在b级背景下局部a级洁净区分别用0.45μm和0.22μm微孔滤膜过滤，500ml/瓶分装；

s106：盖紧瓶盖，并用塑料封盖膜热封；细菌培养结果为无菌。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

实施例1

本发明实施例提供的动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液，由泛影酸钠42g、l-精氨酸250mg、l-门冬酰胺62.5mg、l-门冬氨酸25mg、l-胱氨酸二盐酸盐81.4375mg、l-谷氨酸25mg、甘氨酸12.5mg、l-组氨酸18.75mg、l-羟脯氨酸25mg、l-异亮氨酸62.5mg、l-亮氨酸62.5mg、l-赖氨酸盐酸盐50mg、l-甲硫氨酸18.75mg、l-苯丙氨酸18.75mg、l-脯氨酸25mg、l-丝氨酸37.5mg、l-苏氨酸25mg、l-色氨酸6.25mg、l-酪氨酸28.9875mg、l-缬氨酸25mg、对氨基苯甲酸1.25mg、硝酸钙125mg、无水硫酸镁61.05mg、磷酸氢二钠845.1625mg、氯化钾5587.5mg、氯化钠14250mg、还原谷胱甘肽1.25mg、生物素0.25mg、d-泛酸钙0.3125mg、叶酸1.25mg、i-肌醇43.75mg、烟酰胺1.25mg、氯化胆碱3.75mg、盐酸吡哆醇1.25mg、核黄素0.25mg、盐酸硫胺素1.25mg、维生素b120.00625mg、l-谷氨酰胺375mg和羟乙基淀粉/130100.0g组成，注射用水定容至1000ml。

本发明实施例提供的动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液的密度为1.030g/cm³。

本发明实施例提供的动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液的制备方法包括以下步骤：

步骤一，在b级洁净区中放置一灭菌的1l玻璃瓶；

步骤二，准确称取羟乙基淀粉/130100.0g至1l灭菌后玻璃瓶中，加入准确称取的泛影酸钠42g，再加入其他成分，加入注射用水定容至1000ml；用电子密度计测定密度为1.026-1.032g/cm³，如果没有，则可少量加入泛影酸钠或配方调整后的rpmi1640进行密度调整；

步骤三，用渗透压测定仪测定溶液的渗透压是否为400-450mosm/kg；内毒素测定确定内毒素含量是否<0.25eu/ml；

步骤四，测定溶液的ph值是否为7.0±0.5，必要时加1m(1mol/l)naoh水溶液调节；

步骤五，在b级背景下局部a级洁净区分别用0.45μm和0.22μm微孔滤膜过滤，500ml/瓶分装；

步骤六，盖紧瓶盖，并用塑料封盖膜热封；细菌培养结果为无菌。

采用本动物和人胰腺器官消化后组织、细胞洗涤溶液洗涤了6次人胰岛分离过程中一半的胰腺消化后的组织，以市售hank’s液清洗另一半胰腺消化后的组织为对照，后续采用cobe2991纯化机和相同的碘克沙醇密度梯度液进行连续密度梯度离心纯化胰岛细胞团，结果如下：

注：1：高胰岛纯度比例：是指纯度>70％的胰岛占全部胰岛的比例。

2：以p<0.05为两者有显著性差异，p>0.05为两者无显著性差异。

3：胰岛活性*的测定方法：使用荧光染料3，6-二乙酰氧基荧烷(fda)和碘化丙啶(pi)来评估胰岛的活性。在激发光下，发绿色荧光(活细胞)对红色荧光(死细胞)的面积百分比进行评估胰岛的活力(n＝50，每次使用0.5ml组织，加入10μlpi和10μlfda)。使用nis-elementsf软件在nikoneclipseti-s显微镜下分析样品活性。

由上结果可知，采用本发明实施例洗涤后的胰腺消化后组织，与对照组uw液洗涤所得的胰腺消化后组织相比，得到的高纯度胰岛比例显著提高、胰岛回收量也显著增加，胰岛活性结果无显著性差异，但本发明实施例得到的胰岛纯化结果好于对照组。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。