本发明涉及生物及食品工程领域，具体涉及一种毕赤酵母β-葡萄糖苷酶制剂的制备方法。
背景技术：
β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，ec3.2.1.21，简称bg)是一种水解酶，它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分。目前β-葡萄糖苷酶广泛的应用食品、饲料和医学领域等，具有很好的发展前景。在食品方面，β-葡萄糖苷酶可以水解水果中的风味前体糖苷，释放出挥发性糖苷配基，可增强葡萄酒等果酒、果汁的香气；它还可以水解大豆异黄酮，生产高活性的大豆异黄酮苷元产品；还可以把苦杏仁苷，从而减弱苦味。使其在科学研究和工业应用中发挥重要作用，对于人类的生产和生活具有重大意义。β-葡萄糖苷酶来源也十分广泛，既可以存在于植物、微生物中，又可以存在于动物体中，便于获得。随着科学技术的不断发展，这类酶己被定向改造，获得具有更适合工业大规模生产特性的菌株，不仅降低了工业生产的成本，同时提高了生产效率。目前微生物物来源的β-葡萄糖苷酶的研究内容较多。目前市场上β-葡萄糖苷酶虽然较多，但是所用的生产菌株的种类较少，采用现有的生产β-葡萄糖苷酶的菌株的β-葡萄糖苷酶的产量不大,且生产的蛋白酶的酶活不高。所以开发高效转化纤维素类可再生资源的微生物技术，利用微生物发酵食品生产中急需的食品添加剂等，具有极其重要的意义和光明的发展前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种毕赤酵母β-葡萄糖苷酶制剂的制备方法，制备出了酶活较高的毕赤酵母β-葡萄糖苷酶制剂，同时提高β-葡萄糖苷酶制剂的产量。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案是：一种毕赤酵母β-葡萄糖苷酶制剂的制备方法的具体步骤如下：a、采用紫外光结合激光复合诱变毕赤酵母菌：(a)、从毕赤酵母菌的固体平板上挑取克鲁维毕赤酵母菌单菌落,将其接种于酵母浸出粉陈葡萄糖培养基中进行培养发酵并得到发酵液：将50ml酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，在30℃下，以150-300转/分钟的转速下培养40-48小时；将发酵液以4000-5000r/min的转速离心10min后弃去上清液，用无菌水稀释得到浓度200个/ml的菌液；吸取10ml菌液至无菌平板并置于紫外灯照射,等距离放置,且距紫外灯30厘米处,照射10-30分钟,得到第一诱变菌株。再进行he-ne激光复合诱变(632.8nm，11.5mw)，进行激光扩束(将凸透镜置激光输出端口)照射，距离30cm照射10min都得到第二诱变菌株。在筛选培养基中筛选产酶菌种，在28-37℃下培养72小时后得到诱变菌株；(b)、产酶菌株复筛：将初筛诱变菌株接种于种子培养基,在温度为30℃及200转/分钟的搅拌下发酵36-40小时；(c)、高产酶菌株的获得：将菌液接种于筛选培养基中30℃培养72小时，喷洒碳酸钠进行显色反应，选取黄色透明圈明显且黄色圈较大的菌株作高产糖苷酶的实验菌株；(d)、将克鲁维毕赤酵母菌株活化后接种于发酵培养基，在温度为37℃及200转/分钟的搅拌、0.2m3/h通风的条件下发酵36-48小时，即得到克鲁维毕赤酵母菌液；b、克鲁维毕赤酵母酶制剂的制备：(a)、发酵液的后处理用超滤膜的克鲁维毕赤酵母菌发酵液进行超滤浓缩8-10倍,得到浓缩发酵液；分别采用乙醇分级沉淀和硫酸铵盐析沉淀相结合的方法对浓缩发酵液分离纯化。首先进行β-葡萄糖苷酶将浓缩发酵液进行乙醇分级沉淀试验，将浓缩发酵液在5℃、10000-15000r/min的转速下离心20min后得到第一上清液；在第一上清液加入饱和度为55％的乙醇，在5℃放置16小时后,在5℃、10000-15000r/min的转速下离心20min后得到第二上清液。然后进行硫酸铵盐析分级沉淀实验,将向第二上清液中加入硫酸铵至饱和后在5℃放置16小时后,在5℃、10000-15000r/min的转速下离心20min后得到第三上清液；再向第三上清液中继续加入硫酸铵至饱和,将混合物在5℃放置24小时后,在5℃、10000-15000r/min的转速下离心20分钟后得到沉淀，然后收集所有沉淀,将沉淀溶于0.2mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中,充分透析,即得到提纯后的克鲁维毕赤酵母β-葡萄糖苷酶；(b)、真空冷冻干燥:用截留分子量为15000的超滤膜对克鲁维毕赤酵母菌进行超滤浓缩8-10倍，得到浓缩β-葡萄糖苷酶，向浓缩β-葡萄糖苷酶物中加入无机盐至无机盐浓度到达1-1.5％，然后加入淀粉和豆粉,充分揉和；然后将混合物浓缩物置于真空度-50pa，在-18--20℃温度下冷冻干燥10-15小时；然后在-32--35℃温度下继续冷冻干燥20-25小时即可冻干，进行粉碎、过筛得到克鲁维毕赤酵母β-葡萄糖苷酶。
所述的种子培养基的成分为蛋白胨8％、酵母浸膏3％、硫酸镁0.3％、葡萄糖15％、硫酸铵0.4％、硫酸镁1％、磷酸氢二钾2％。
所述的无机盐为氯化钙。
所述的筛选培养基的成分为蛋白胨4％、酵母浸膏2％、琼脂1.5％，对硝基苯基-葡萄糖苷酶1.5％、葡萄糖2％，氯化钾0.5％、四水硫酸亚铁0.1％、七水硫酸镁0.5％。
所述的过筛为过100目筛。
采用上述技术方案后，本发明有益效果为：1.本发明所述的毕赤酵母菌种经诱变选育产酶能力较高，制得克鲁维毕赤酵母β-葡萄糖苷酶制剂具有较高的酶活力。2.本发明实施例制备的假丝酵母蛋白酶制剂以玉米粉、淀粉、豆粉和麸皮中的一种或几种为主要辅料,生产成本低，克鲁维毕赤酵母β-葡萄糖苷酶制剂在制备过程采用乙醇醇沉、离心、盐析、超滤、冷冻干燥等步骤,产品杂质含量低，符合食品添加剂标准的要求。
具体实施方式
实施例1
本具体实施方式采用的技术方案是：一种毕赤酵母β-葡萄糖苷酶制剂的制备方法的具体步骤如下：a、采用紫外光结合激光复合诱变毕赤酵母菌：(a)、从毕赤酵母菌的固体平板上挑取克鲁维毕赤酵母菌单菌落,将其接种于酵母浸出粉陈葡萄糖培养基中进行培养发酵并得到发酵液：将50ml酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，在30℃下，以150转/分钟的转速下培养40小时；将发酵液以4000r/min的转速离心10min后弃去上清液，用无菌水稀释得到浓度200个/ml的菌液；吸取10ml菌液至无菌平板并置于紫外灯照射,等距离放置,且距紫外灯30厘米处,照射10分钟,得到第一诱变菌株。再进行he-ne激光复合诱变(632.8nm，11.5mw)，进行激光扩束(将凸透镜置激光输出端口)照射，距离30cm照射10min都得到第二诱变菌株。在筛选培养基中筛选产酶菌种，在28-37℃下培养72小时后得到诱变菌株；(b)、产酶菌株复筛：将初筛诱变菌株接种于种子培养基,在温度为30℃及200转/分钟的搅拌下发酵36小时；(c)、高产酶菌株的获得：将菌液接种于筛选培养基中30℃培养72小时，喷洒碳酸钠进行显色反应，选取黄色透明圈明显且黄色圈较大的菌株作高产糖苷酶的实验菌株；(d)、将克鲁维毕赤酵母菌株活化后接种于发酵培养基，在温度为37℃及200转/分钟的搅拌、0.2m3/h通风的条件下发酵36小时，即得到克鲁维毕赤酵母菌液；b、克鲁维毕赤酵母酶制剂的制备：(a)、发酵液的后处理用超滤膜的克鲁维毕赤酵母菌发酵液进行超滤浓缩10倍,得到浓缩发酵液；分别采用乙醇分级沉淀和硫酸铵盐析沉淀相结合的方法对浓缩发酵液分离纯化。首先进行β-葡萄糖苷酶将浓缩发酵液进行乙醇分级沉淀试验，将浓缩发酵液在5℃、10000r/min的转速下离心20min后得到第一上清液；在第一上清液加入饱和度为55％的乙醇，在5℃放置16小时后,在5℃、10000r/min的转速下离心20min后得到第二上清液。然后进行硫酸铵盐析分级沉淀实验,将向第二上清液中加入硫酸铵至饱和后在5℃放置16小时后,在5℃、10000r/min的转速下离心20min后得到第三上清液；再向第三上清液中继续加入硫酸铵至饱和,将混合物在5℃放置24小时后,在5℃、10000r/min的转速下离心20分钟后得到沉淀，然后收集所有沉淀,将沉淀溶于0.2mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中,充分透析,即得到提纯后的克鲁维毕赤酵母β-葡萄糖苷酶；(b2)、真空冷冻干燥:用截留分子量为15000的超滤膜对克鲁维毕赤酵母菌进行超滤浓缩10倍，得到浓缩β-葡萄糖苷酶，向浓缩β-葡萄糖苷酶物中加入无机盐至无机盐浓度到达1.5％，然后加入淀粉和豆粉,充分揉和；然后将混合物浓缩物置于真空度-50pa，在-18--20℃温度下冷冻干燥10-15小时；然后在-32--35℃温度下继续冷冻干燥20-25小时即可冻干，进行粉碎、过筛得到克鲁维毕赤酵母β-葡萄糖苷酶。
所述的种子培养基的成分为蛋白胨8％、酵母浸膏3％、硫酸镁0.3％、葡萄糖15％、硫酸铵0.4％、硫酸镁1％、磷酸氢二钾2％。
所述的无机盐为氯化钙。
所述的筛选培养基的成分为蛋白胨4％、酵母浸膏2％、琼脂1.5％，对硝基苯基-葡萄糖苷酶1.5％、葡萄糖2％，氯化钾0.5％、四水硫酸亚铁0.1％、七水硫酸镁0.5％。
所述的过筛为过100目筛。
测定实施例1制备的毕赤酵母β-葡萄糖苷酶制剂的酶活力3225u/g干基，酶活力回收率到达52.23％、6个月内的酶活保存率到达80％,实施例1制备的克鲁维毕赤酵母β-葡萄糖苷酶具有较高的酶活力,酶活力回收率较好。
实施例2
与实施例1不同的是其具体步骤如下：a、采用紫外光结合激光复合诱变毕赤酵母菌：(a)、从毕赤酵母菌的固体平板上挑取克鲁维毕赤酵母菌单菌落,将其接种于酵母浸出粉陈葡萄糖培养基中进行培养发酵并得到发酵液：将50ml酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，在30℃下，以300转/分钟的转速下培养48小时；将发酵液以5000r/min的转速离心10min后弃去上清液，用无菌水稀释得到浓度200个/ml的菌液；吸取10ml菌液至无菌平板并置于紫外灯照射,等距离放置,且距紫外灯30厘米处,照射30分钟,得到第一诱变菌株。再进行he-ne激光复合诱变(632.8nm，11.5mw)，进行激光扩束(将凸透镜置激光输出端口)照射，距离30cm照射10min都得到第二诱变菌株。在筛选培养基(蛋白胨4％、酵母浸膏2％、琼脂1.5％，对硝基苯基-葡萄糖苷酶1.5％、葡萄糖2％，氯化钾0.5％、四水硫酸亚铁0.1％、七水硫酸镁0.5％)中筛选产酶菌种，在28-37℃下培养72小时后得到诱变菌株；(b)、产酶菌株复筛：将初筛诱变菌株接种于种子培养基,在温度为30℃及200转/分钟的搅拌下发酵40小时；(c)、高产酶菌株的获得：将菌液接种于筛选培养基中30℃培养72小时，喷洒碳酸钠进行显色反应，选取黄色透明圈明显且黄色圈较大的菌株作高产糖苷酶的实验菌株；(d)、将克鲁维毕赤酵母菌株活化后接种于发酵培养基，在温度为37℃及200转/分钟的搅拌、0.2m3/h通风的条件下发酵36-48小时，即得到克鲁维毕赤酵母菌液；b、克鲁维毕赤酵母酶制剂的制备：(a)、发酵液的后处理用超滤膜的克鲁维毕赤酵母菌发酵液进行超滤浓缩8倍,得到浓缩发酵液；分别采用乙醇分级沉淀和硫酸铵盐析沉淀相结合的方法对浓缩发酵液分离纯化。首先进行β-葡萄糖苷酶将浓缩发酵液进行乙醇分级沉淀试验，将浓缩发酵液在5℃、15000r/min的转速下离心20min后得到第一上清液；在第一上清液加入饱和度为55％的乙醇，在5℃放置16小时后,在5℃、15000r/min的转速下离心20min后得到第二上清液。然后进行硫酸铵盐析分级沉淀实验,将向第二上清液中加入硫酸铵至饱和后在5℃放置16小时后,在5℃、15000r/min的转速下离心20min后得到第三上清液；再向第三上清液中继续加入硫酸铵至饱和,将混合物在5℃放置24小时后,在5℃、15000r/min的转速下离心20分钟后得到沉淀，然后收集所有沉淀,将沉淀溶于0.2mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中,充分透析,即得到提纯后的克鲁维毕赤酵母β-葡萄糖苷酶；(b)、真空冷冻干燥:用截留分子量为15000的超滤膜对克鲁维毕赤酵母菌进行超滤浓缩8倍，得到浓缩β-葡萄糖苷酶，向浓缩β-葡萄糖苷酶物中加入无机盐至无机盐浓度到达1％，然后加入淀粉和豆粉,充分揉和；然后将混合物浓缩物置于真空度-50pa，在-18--20℃温度下冷冻干燥10-15小时；然后在-32--35℃温度下继续冷冻干燥20-25小时即可冻干，进行粉碎、过筛得到克鲁维毕赤酵母β-葡萄糖苷酶。
测定实施例2制备的毕赤酵母β-葡萄糖苷酶制剂的酶活力3052u/g干基，酶活力回收率到达50.41％、6个月内的酶活保存率到达80％,实施例2制备的克鲁维毕赤酵母β-葡萄糖苷酶具有较高的酶活力,酶活力回收率较好。
采用上述技术方案后，本发明有益效果为：1.本发明所述的毕赤酵母菌种经诱变选育产酶能力较高，制得克鲁维毕赤酵母β-葡萄糖苷酶制剂具有较高的酶活力。2.本发明实施例制备的假丝酵母蛋白酶制剂以玉米粉、淀粉、豆粉和麸皮中的一种或几种为主要辅料,生产成本低，克鲁维毕赤酵母β-葡萄糖苷酶制剂在制备过程采用乙醇醇沉、离心、盐析、超滤、冷冻干燥等步骤,产品杂质含量低，符合食品添加剂标准的要求。
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。