一种β-半乳糖苷酶、其编码基因及其应用的制作方法

本发明涉及一种β-半乳糖苷酶、其编码基因及其应用，属于生物技术领域。

背景技术：

低聚半乳糖是一种功能性低聚糖，作为一种新型的食品添加剂，广泛的应用于食品行业。目前虽然已经有商品化的低聚半乳糖出售，但是价格昂贵。我国的低聚半乳糖生产未成规模，其核心技术瓶颈是缺乏高效制备低聚半乳糖的酶。因此，挖掘性能优良的工业用酶，对推动低聚半乳糖的产业化至关重要。

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，ec.3.2.1.23)，全称为β-d-半乳糖苷半乳糖水解酶，商品名为乳糖酶，往往具有催化乳糖水解和转糖苷两种功能。β-半乳糖苷酶的转糖苷功能，可以以乳糖为底物，合成低聚半乳糖。但是绝大部分β-半乳糖苷酶的转糖苷活性较低，合成低聚半乳糖的效率很低。例如，中国发明专利申请201610579268.4中的β-半乳糖苷酶的低聚半乳糖转化率仅为9.5％；中国发明专利申请201610580177.2中的β-半乳糖苷酶的低聚半乳糖转化率仅为11.5％。已知较好的合成低聚半乳糖的酶来自bacilluscirulans菌，其转化率为48.3％。

有机溶剂催化最独特的优势是促使水解酶转向合成反应。其原因是反应中添加了有机溶剂后，水活度下降，会更有利于进行合成反应。β-半乳糖苷酶是一个既有水解能力又有合成能力(转糖苷)的酶，因此，理论上在有机溶剂中实施β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖，有可能会提高合成效率。但是有机溶剂对酶有毒性，绝大部分的β-半乳糖苷酶不能耐受有机溶剂，因此也就无法实现在有机溶剂存在时高效合成低聚半乳糖。

技术实现要素：

针对上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种β-半乳糖苷酶、其编码基因及其应用。本发明提供的β-半乳糖苷酶具有有机溶剂耐受性，能够在有机溶剂中高效催化合成低聚半乳糖。

本发明β-半乳糖苷酶，其氨基酸序列如seqidno:1所示，或者与所述seqidno:1序列有92％以上的相似性或同源性的氨基酸序列。

编码所述β-半乳糖苷酶的基因，其核苷酸序列如seqidno:2所示。该序列已经经过序列优化，能在大肠杆菌中有效表达出有酶活力的β-半乳糖苷酶。含有上述β-半乳糖苷酶的基因的表达载体为pet32a；含有上述表达载体的重组表达宿主为大肠杆菌bl21(de3)。

用于表达所述β-半乳糖苷酶的重组表达质粒，所述重组表达质粒包含编码所述β-半乳糖苷酶的基因。

本发明产生所述β-半乳糖苷酶的重组菌株，所述重组菌株含有上述重组表达质粒。

本发明β-半乳糖苷酶的应用，是在有机溶剂体系中高效催化合成低聚半乳糖。具体包括如下步骤：

以乳糖为底物，以ph值6.0-7.5的磷酸盐缓冲液为溶剂配制浓度为300-500g/l的乳糖溶液，向反应体系中添加有机溶剂以及β-半乳糖苷酶，40-60℃下反应合成低聚半乳糖。

所述有机溶剂为乙二醇或丁二醇，有机溶剂的添加体积为磷酸盐缓冲液体积的10-20％，优选为20％。

所述β-半乳糖苷酶的添加比例为10u/ml。

本发明β-半乳糖苷酶高效催化合成低聚半乳糖的反应条件优选为：乳糖浓度400g/l，酶量10u/ml，磷酸盐缓冲液ph值6.5，反应温度50℃，反应时间10h。

本发明β-半乳糖苷酶在没有有机溶剂的环境中也能有效合成低聚半乳糖。

本发明β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖，低聚半乳糖的最高产物转化效率达到55.8±0.8％，是无有机溶剂时的1.7倍，因此具有很好的工业应用价值。

附图说明

图1是本发明β-半乳糖苷酶在50℃时的温度稳定性曲线。

图2是本发明β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的最适ph曲线。

图3是本发明β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的最适温度曲线。

图4是本发明β-半乳糖苷酶在无有机溶剂时合成低聚半乳糖的hplc图谱。

图5是本发明β-半乳糖苷酶在存在乙二醇时合成低聚半乳糖的hplc图谱。

具体实施方式

实施例1：β-半乳糖苷酶的基因和蛋白序列

之前的研究中实验室保存过一株黄热厌氧芽孢杆菌(anoxybacillusfavithermus)ne3，采用酚-氯仿法抽提总dna。基于genebank中公布的来源anoxybacillus属的β-半乳糖苷酶的序列，设计正向引物为cccggatccatgggggagcgaaacatg，反向引物为cccgagctctttaactccatgattcatg。通过pcr扩增，获得一条长度为1.9kb条带。将该条带测序后，获得编码该基因的蛋白质序列如seqidno:1所示。ncbi序列比对结果表明，该蛋白序列与编号为wp_032100326的β-半乳糖苷酶具有90％的序列相似性。将获得的野生型的基因序列克隆到大肠杆菌中进行重组表达，未见重组蛋白。因此，委托上海生工生物有限公司优化了核苷酸序列，人工合成了基因序列如seqidno:2所示。该序列在大肠杆菌中成功获得了有活性的表达。

实施例2：β-半乳糖苷酶的重组表达和蛋白质纯化

人工合成的β-半乳糖苷酶基因，直接克隆在表达载体pet32a中。质粒转化大肠杆菌bl21(de3)中，培养至od600为0.6-0.8，加1mm的诱导物iptg，37℃诱导表达6h。离心收集菌体，超声破碎细胞。采用镍亲和层析柱纯化重组蛋白。sds-page检测蛋白纯度。

实施例3：β-半乳糖苷酶在50℃的温度稳定性

本案例中的β-半乳糖苷酶是在50℃进行应用，因此检测了该酶50℃时的温度稳定性。β-半乳葡萄糖苷酶的水解活性和转糖苷活性测定方法不同。虽然水解活性的高低与转糖苷活性高低之间没有直接关联，但是可以用水解活性来衡量酶的稳定性。水解活性的测定以onpg为底物，一个标准反应体系包含10μl适当稀释的纯酶，30μl100mm的onpg和260μlna2hpo4-kh2po4缓冲液(50mm,ph6.5)。在55℃反应5分钟，加等体积(300ul)1mna2co3溶液终止反应。冷却后在od415测吸光值。以不加酶的样品为空白对照。温度稳定性的测定方法为，用na2hpo4-kh2po4缓冲液(50mm,ph6.5)适当稀释纯化的β-半乳糖苷酶，然后将酶孵育在50℃下，间隔一定时间取样，然后加入底物onpg等在55℃反应10min，测残留酶活。以未孵育的样品组酶活作为100％。获得的温度稳定性曲线如图1所示。该β-半乳糖苷酶在50℃的温度稳定性非常好，孵育12小时后，依然保留了93％以上的酶活。

实施例4：β-半乳糖苷酶的有机溶剂耐受性

不同的有机溶剂的毒性不同，通常认为可以用极性系数logpow值(溶剂在辛醇/水双相系统中的分配系数的对数值)表征有机溶剂的毒性。选择logpow值从3.5到-1.93的12种有机溶剂加入标准反应体系中，有机溶剂的终浓度分别为10％(v/v)、15％(v/v)和20％(v/v)。室温放置1小时后，在55℃反应10min，测残留酶活。以无添加的样品组的酶活(201.5±4.5u/mg)定义为100％。获得的β-半乳糖苷酶的有机溶剂耐受性的结果如表1所示。反应体系中含有10％有机溶剂时，β-半乳糖苷酶对这12种有机溶剂均表现出了非常优良的耐受性，即使是最差的正己醇也保持了58％以上的活性。有机溶剂的浓度提高到20％时，β-半乳糖苷酶对9种有机溶剂依然保留了一半以上酶活，尤其是丁二醇、乙二醇、甲苯、正己烷和环己烷这5种有机溶剂，β-半乳糖苷酶保持了92％以上的酶活。这些数据表明该β-半乳糖苷酶是一个优良的有机溶剂耐受酶，在有机溶剂催化中具有一定的应用价值。

表1有机溶剂对β-半乳糖苷酶酶活的影响

实施例5：β-半乳糖苷酶在无有机溶剂时合成低聚半乳糖

本案例中的β-半乳糖苷酶具有转糖苷活性，可以催化乳糖合成低聚半乳糖。测定了合成低聚半乳糖反应时的最适ph和最适反应温度。低聚半乳糖的合成量用高效液相色谱hplc检测。色谱条件为：安捷伦1260hplc色谱仪，色谱柱aminexhpx-87c(300mm×7.8mm)，蒸发光散射检测器，流动相为超纯水流速为0.6ml/min，柱温80℃。

在最适ph6.5下测定温度对低聚半乳糖合成的影响，温度范围为30到65℃。在50℃测定不同ph值对低聚半乳糖合成的影响。缓冲液为50mmna2hpo4-柠檬酸缓冲液(ph4.0到5.0)，na2hpo4-kh2po4缓冲液(ph5.0到8.0)和甘氨酸-naoh缓冲(ph8.0到10.0)。用这些不同的缓冲液配制配置400g/l的乳糖溶液。然后按照10u/ml的比例加入纯化的β-半乳糖苷酶，在转速为100rpm的恒温摇床中震荡反应10h后，沸水浴5分钟使酶失活，离心去除蛋白。上清液进行hplc检测。获得的最适ph是6.5(图2)，最适反应温度是50℃(图3)。最适反应条件下，乳糖合成低聚半乳糖的转化率为32±0.3％。hplc的检测图见图4，主要产物是半乳三塘、半乳四糖和半乳五糖。

实施例6：β-半乳糖苷酶在存在有机溶剂时合成低聚半乳糖

本案例中的β-半乳糖苷酶在存在有机溶剂时，合成低聚半乳糖的效率显著增强。综合考虑了β-半乳糖苷酶的有机溶剂耐受性和有机溶剂自身的毒性后，选择使用乙二醇或丁二醇。用na2hpo4-kh2po4缓冲液(50mm，ph6.5)配置400g/l的乳糖溶液，按照20％(v/v)的比例加入乙二醇或丁二醇，按照10u/ml的比例加入纯化的β-半乳糖苷酶。为了防止有机溶剂的挥发，反应在能严格密封的亨盖特厌氧试管中进行。试管放置于转速为100rpm的50℃恒温摇床中震荡反应10h后，沸水浴5分钟使酶失活，离心去除蛋白。上清液进行hplc检测。添加乙二醇时的低聚半乳糖的转化率最高，达到55.8±0.8％，主要产物依然是半乳三塘、半乳四糖和半乳五糖，但是可以明显看到半乳四糖和半乳五糖合成的量增多(图5)。添加丁二醇时的低聚半乳糖的转化率略低，为48.5±0.9％。由此可见，有机溶剂的添加提高1.7倍的转化率，使低聚半乳糖的酶法制备具有了很好的工业应用价值。

seqidno:1

<β-galactosidasefromanoxybacillusfavithermus>

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seqidno:2

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序列表

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