一种耐热木聚糖酶突变体及其毕赤酵母工程菌的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种耐热木聚糖酶突变体及其编码基因、毕赤酵母工程菌。
背景技术：
：木聚糖是一类广泛存在于植物体内的半纤维素，约占细胞干重的35％。木聚糖的彻底降解需要多种酶类的共同参与，起主要作用的是内切β-1,4-d-木聚糖酶(ec3.2.1.8)，简称木聚糖酶，具有重要的应用价值，被广泛应用于在化学漂白、饲料、制浆造纸、食品、生物转化、医药等行业中，有着广阔的应用前景。木聚糖酶广泛存在于微生物中，自上世纪70年代末开始开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已经有上百种来自细菌和真菌的木聚糖酶基因被克隆并在原核和真核生物中进行了同源和异源重组表达。但由于纸浆漂白、饲料制粒、食品加工等工艺均需要较高温度，因此耐热木聚糖酶的研究和开发得到了很多研究者的青睐。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种耐热性提高的木聚糖酶突变体及其毕赤酵母工程菌菌株。所述木聚糖酶突变体来自一株经紫外诱变的嗜热脂肪土芽孢杆菌(geobacillusstearothermophilus)gs-1，将木聚糖酶突变体编码基因x-2从gs-1中克隆并构建重组质粒后，在毕赤酵母gs115中进行表达，从而获得毕赤酵母工程菌菌株。在本发明中采用如下定义：1.氨基酸和dna核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认iupac命名法，用三字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。2.木聚糖酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如lys48arg，表示位置48的氨基酸由野生型的lys替换成arg，位置的编号对应于seqidno.2中野生型木聚糖酶的氨基酸序列编号；同样采用“原始碱基位置替换的碱基”来表示突变体中突变的碱基，位置的编号对应于seqidno.1中野生型木聚糖酶的核苷酸序列编号。在本发明中，x-1表示野生型木聚糖酶的编码基因，x-2表示木聚糖酶突变体的编码基因，信息如下表。所述木聚糖酶突变体的氨基酸序列如序列表seqidno.4所示；所述木聚糖酶突变体编码基因x-2的核苷酸序列为seqidno.3所示；用于表达所述木聚糖酶的表达载体为质粒ppic9，用于所述表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母gs115；所述毕赤酵母工程菌是将木聚糖酶突变编码基因x-2连接表达载体ppic9，得到重组质粒ppic9-x-2，并在毕赤酵母gs115中表达所得；本发明的实验步骤具体如下：1、通过设计引物，采用pcr方法扩增得到木聚糖酶突变体的编码基因x-2；2、将木聚糖酶突变体的编码基因x-2进行酶切，连接至表达载体ppic9，得到重组载体；3、将重组载体转化入毕赤酵母gs115中，得到新型木聚糖酶的生产菌株gs115/ppic9-x-2；4、以gs115/ppic9-x-2为生产菌株发酵生产木聚糖酶。所述木聚糖酶突变体的酶学性质如下：(1)ph:ph4-8.5酶活稳定，最适作用ph6.5。(2)温度：最适作用温度为70℃。(3)耐热性：该木聚糖酶在100℃保温10min酶活仍残留85％以上。有益效果：1、本发明公布了一种全新的木聚糖酶突变体，该突变体具有酶活高，热稳定性好的特点。该突变体摇瓶发酵液酶活可达3565u/ml，野生型酶活为524u/ml；2、本发明获得的木聚糖酶在80℃保温10min酶活残留99％，在100℃保温10min酶活仍残留85％以上。附图说明：图1菌落pcr鉴定电泳图；其中，m为marker；1为菌液进行菌落pcr产物电泳；图2蛋白表达电泳图；其中，m为marker；1为p-0发酵液上清电泳；2为p-x-2发酵液上清电泳；图3木聚糖酶最适ph曲线；图4木聚糖酶最适温度曲线；图5木聚糖酶温度稳定性曲线。具体实施方式：通过具体实施例对本发明作出更详尽的说明，仅作为举例说明，而不作为对本发明实施范围的限定。对于本领域技术人员，在本发明原理基础上还可做出的改进，这些改进也应视为本发明保护的范围。本实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》。实施例1木聚糖酶突变体基因x-2的获得实验室保存的嗜热脂肪土芽孢杆菌gs，经紫外诱变筛选得到一株具有耐热木聚糖酶活性的菌株gs-1，根据其突变基因x-2的核苷酸序列设计pcr引物，5'端加入酶切位点ecori，3'端加入酶切位点noti，通过pcr得到突变基因x-2，其核苷酸序列为seqidno.3。引物序列如下：x-2-f5'-aatgaattcatgaacagtcccctcccct-3'(seqidno.5)x-2-r5'-ttgcggccgctcagacactcactgccctc-3'(seqidno.6)实施例2重组载体ppic9-x-2的构建分别对x-2和质粒ppic9进行ecori和noti酶切，回收产物，将回收后的x-2和ppic9按比例混合，用t4连接酶在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，转化产物涂布在lb(含氨苄霉素)固体平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落至lb液体培养基，37℃培养，菌液进行菌落pcr，电泳鉴定结果如图1，测序结果显示序列正确，序列大小996bp。抽提重组质粒ppic9-x-2待用。实施例3重组质粒转化毕赤酵母1.毕赤酵母gs115感受态细胞的制备1)挑取毕赤酵母平板单菌落，接种于5ml的ypd培养基，30℃，220r/min振荡过夜；2)取0.5ml的过夜培养的菌液，接种于50ml新鲜配制的ypd培养基，30℃，220r/min振荡培养，使od600值达到1.3-1.5；3)取上述培养液于4℃，3000r/min，离心5min；4)弃上清，加入50ml冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；5)3000r/min，4℃，离心5min，弃上清，吸干管壁残余液体，加入25ml冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；6)3000r/min，4℃，离心5min，弃上清，吸干管壁残余液体，加入10ml冰上预冷的1mol/l的无菌山梨醇溶液，重悬菌体；7)3000r/min，4℃，离心5min，弃上清，吸干管壁残余液体，加入1ml冰上预冷的1mol/l的灭菌山梨醇溶液(预先加入甘油至终浓度15％)，振荡混匀。8)分装100μl/管至无菌ep管，-70℃冰箱冰冻保藏(新鲜制备的感受态细胞效果更佳)。2.线性化质粒的转化抽提得到的重组质粒ppic9-x-2用ndei进行单酶切，得到线性化质粒。取新鲜制备的(或-70℃冻存的)感受态细胞置于冰浴中。1)将100μl感受态细胞移出至一新的无菌ep管中，加入10μl线性化质粒，轻吹混匀，吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；2)转化杯置于冰浴中5-10分钟，保持低温。3)电穿孔转化电击条件：1500v，200ω，25μf，放电时间5ms左右，一次电击。4)电击后，马上在电击转化杯中加入1ml4℃预冷的1mol/l的山梨醇溶液，用移液枪吹打均匀，置于冰浴中；5)在超净工作台上无菌操作涂布md培养基(1.34％ynb；4×10-5％生物素；2％葡萄糖平板)，100-200μl/板，涂好的平板30℃倒置培养3-4天；6)在md平板上筛选得到重组菌，经菌落pcr得到目的序列，测序比对显示为目的基因x-2的核苷酸序列，即所得菌株为含有ppic9-x-2的重组菌，命名为p-x-2。同样的方法构建得到含有空质粒的重组菌，命名为p-0，含有原始基因的重组菌，命名为p-x-1。实施例4含有重组质粒ppic9-x-2的酵母菌的诱导表达bmgy培养基配方：1％酵母浸出物，2％蛋白胨，0.1mol/lph6.0磷酸盐缓冲液，1.34％ynb，4×10-5％生物素，1％甘油。bmmy培养基配方：1％酵母浸出物，2％蛋白胨，0.1mol/lph6.0磷酸盐缓冲液，1.34％ynb，4×10-5％生物素，0.5％甲醇。将重组菌p-0，p-x-1，p-x-2分别接种于装有30mlbmgy培养基的三角瓶中，30℃，220r/min培养至od600为10左右，离心收集菌体，用35ml的bmmy诱导培养基重悬菌体，并在30℃，220r/min条件下继续培养48h，发酵液离心后测定上清中的木聚糖酶酶活，结果如下表，蛋白电泳结果如图2，蛋白大小约38.5kda。菌株木聚糖酶酶活/u·ml-1p-00p-x-1524p-x-23565实施例5木聚糖酶的酶学性质采用改良的dns法测定，酶活力的定义：在温度37℃、ph5.5条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活单位(u)。(1)最适作用ph以实施例4所得p-x-2发酵液上清液为样品，以测得的木聚糖酶最高酶活为基准，在37℃条件下，分别在ph2.5-11的缓冲液中反应，测定不同ph条件下的酶活力。由图3可知，该木聚糖酶在ph范围4-8.5酶活稳定，在偏酸偏碱条件下都可反应，最适作用ph6.5。(2)最适作用温度以实施例4所得p-x-2发酵液上清液为样品，以测得的木聚糖酶最高酶活为基准，在ph5.5的缓冲液中，分别在30℃-100℃条件下测定酶活，计算相对酶活，结果如图4所示，p-x-2所产木聚糖酶最适作用温度为70℃。(3)热稳定性以实施例4所得p-x-1和p-x-2发酵液上清液为样品，以不作处理的木聚糖酶酶活为100％基准，在ph5.5缓冲液条件下，样品分别在50℃-100℃下保温处理10min，测酶活，计算剩余酶活，从图5中可以看出，80℃时，木聚糖酶突变体相对活性剩余99％左右，100℃时，酶活仍存留85％以上，与原始基因x-1构建的重组菌p-x-1所产木聚糖酶相比，热稳定性有很大提高，说明重组菌p-x-2所产木聚糖酶具有良好的耐热性，可广泛用于食品、饲料等行业。序列表<110>山东隆科特酶制剂有限公司<120>一种耐热木聚糖酶突变体及其毕赤酵母工程菌<130>1<141>2018-10-11<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>996<212>dna<213>嗜热脂肪土芽孢杆菌(geobacillusstearothermophilusgs)<400>1atgaacagctccctcccctccctccgcgatgtattcgcgaatgatttccgcatcggggcg60gcggtcaatcctgtgacgatcgagatgcaaaaacagttgttgatcgatcatgtcaacagt120attacggcagagaaccatatgaagtttgagcatcttcagccggaagaagggaaatttacc180tttcaggaagcggatcggattgttgattttgcttgttcgcaccgaatggcggttcgaggg240cacacacttgtatggcacaaccagactccggattgggtgtttcaagatggtcaaggccat300ttcgtcagtcgggatgtgttgcttgagcggatgaaatgtcacatttcaactgttgtacgg360cgatacaagggaaaaatatattgttgggatgtcatcaacgaagcggtagccgacgaagga420gacgaattgttgaggccgtcgaagtggcgacaaatcatcggggacgattttatggaacaa480gcatttctctacgcttatgaagctgacccagatgcactgcttttttacaatgactataat540gaatgttttccggaaaagagagaaaaaatttttgcacttgtcaaatcgctgcgtgataaa600ggcattccgattcatggcatcgggatgcaagcgcattggagtttgtctcgcccgtcgctt660gatgaaattcgtgcggccattgaacgatatgcgtcccttggtgttgttcttcatattacg720gaactcgatgtatccatgtttgaatttcacgatcgtcgaaccgatttggcagctccaacg780tcagaaatgatcgaacggcaggcagagcggtatgggcaaatttttgctttgtttaag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