本发明涉及一种体外高效扩增培养细胞毒性t淋巴细胞的方法，属于细胞培养技术领域。
背景技术：
肝病与肿瘤，在我国均属于高发疾病，据保守估计，中国乙肝病毒感染者约9000万，其中仅慢性患者就有2800万；丙肝病毒感染者760万(慢性患者456万)。而每年死于肝炎导致的肝硬化和原发性肝癌者有33万，恶性肿瘤对人类的威胁日益突出，已经成为我国城乡居民的第一位死因。城市中，我国常见癌症死亡率前5位的依次是肺、肝、胃、食管和大肠；农村中依次是胃、肝、食管、肺和大肠。肿瘤特异性免疫治疗的研究持续发展过程中，其中细胞毒性t淋巴细胞因对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用而被研究者们发现。细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte，ctl)，亦叫tc细胞(cytotoxictcell)，是白细胞的亚群，为一种特异t细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。helmich等人的研究表明，ctl无论在体外，还是在体内正常生理状态下，都能够对表达与其tcr匹配的抗原的肿瘤有明显的杀伤效果。ctl来自骨髓淋巴样造血干细胞，有骨髓迁移至胸腺完成其成熟过程，成为初始ctl。初始ctl进入外周淋巴组织，识别有抗原呈递细胞(apc)提呈的抗原肽mhc-i类分子复合物，活化为ctl前体细胞(pctl)。pctl经细胞表面分子如白细胞分化抗原28(cd28)、cd2、极迟抗原4(vla4)、淋巴细胞功能相关抗原1(lfa1)等apc表达的共刺激分子如b7-1(cd80)、细胞间粘附分子1(icam-1)、血管细胞粘附分子(vacm-1)等结合，促使其进一步分化成效应ctl。
效应ctl分泌穿孔素(pfp)与颗粒酶，pfp贮存于cd8+t细胞胞浆颗粒中，是cd8+t细胞杀伤靶细胞的主要毒性蛋白。cd8+t细胞与靶细胞上特异的mhc-i和抗原的复合物识别后，或受到il-2等刺激的情况下，细胞激活，发生脱颗粒(含有穿孔素、颗粒酶等)，释放穿孔素。穿孔素在细胞膜上形成不同孔径的跨膜孔道，从而导致靶细胞膜去极化。na+、h2o经过通道进入胞内，一些电解质和大分子物质流出胞外，改变细胞膜渗透压，最终引起靶细胞渗透性死亡。穿孔素还可以通过颗粒酶促进靶细胞凋亡而杀伤靶细胞。颗粒酶是外源性的丝氨酸蛋白酶，来自细胞毒淋巴细胞(ctls)和自然杀伤细胞(nk)释放的细胞浆颗粒。这些颗粒含有颗粒酶原及其它蛋白酶原，包括穿孔蛋白。由于ctl细胞与靶细胞结合(经靶细胞表面的ctl受体和mhc分子的抗原结合)，颗粒的内容物释放，颗粒酶进入了靶细胞，穿孔蛋白进入了靶细胞通过在细胞膜的聚合形成了靶细胞膜的小孔，使细胞膜穿孔，最后穿孔蛋白使颗粒酶的膜穿孔引起颗粒酶的释放。在细胞浆内，颗粒酶b能通过三种不同的途径激起细胞的死亡，首先激起caspases的链锁反应，引起靶细胞dna降解活动，然后裂解。ctl通过fas/fas-l诱导凋亡在生理病理性的细胞死亡以及ctl快速杀伤靶细胞的效应途径中同样占有重要作用。tnf-α、inf-γ和lt等途径介导的直接细胞毒作用和分泌细胞因子间接地特异性杀伤靶细胞。fas及其配体fas-l是近年来研究得最为深入的有关细胞凋亡的膜表面分子，它们在凋亡中作用机制的阐明，对深入了解细胞凋亡的机理及相关转化研究起产生了深远的影响。
技术实现要素：
本发明的目的在于体外高效扩增培养细胞毒性t淋巴细胞的方法，用于乙肝、丙肝和肿瘤的辅助治疗。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种体外高效扩增培养细胞毒性t淋巴细胞的方法具体步骤为：
步骤一：配置培养基，每1mlx-vivo15无血清培养基内含il-21000iu，包被培养瓶，用50g/mlcd3预处理t225cm2带有空气滤膜的细胞培养瓶，4℃包被过夜后，备用；
步骤二：取样，取100ml静脉血，其中活率≥90％，用于制备单个核细胞，取等量淋巴细胞分离液，小心转移静脉血至分离液之上，轻柔操作避免打破交界液面，采用离心机进行离心，在1800×rpm离心15min，小心吸取中间白膜层，即单个核细胞层，转移至新离心管中；
步骤三：单个核细胞用生理盐水浸泡，采用离心机进行离心在1800×rpm，离心10min，充分漂洗3遍；
步骤四：将分离获得的单个核细胞用一定体积的x-vivo15无血清培养基培养，无血清培养基培养中内含il-2，终浓度1000iu/ml，按1-2.0×106个/ml的浓度接种于包被过的t225cm2细胞培养瓶中，细胞培养瓶中内含cd3，终浓度50g/ml，放置在37℃下，在5％±0.5％co2的饱和湿度的培养箱内培养；
步骤五：第4天向t225cm2细胞培养瓶中补入步骤二中等体积x-vivo15无血清培养基，无血清培养基内含il-2，终浓度1000iu/ml，做好标记，放入co2培养箱中继续培养；
步骤六：第6天，观察培养基颜色并计数，向t225cm2细胞培养瓶中补入150ml37℃预热的x-vivo15无血清培养基，无血清培养基内含il-2，终浓度1000iu/ml，混匀，放入co2培养箱中继续培养；
步骤七：第7天扩增培养，培养瓶内细胞处于1.0×106个/ml左右时最适宜进行扩增操作，数量过低应将培养瓶放回培养箱，继续培养，取出细胞培养瓶，表面消毒，放入生物安全柜中，用移液器轻轻吹打细胞，混匀，均分至5个t225cm2细胞培养瓶中，每瓶补足37℃预热的x-vivo15无血清培养基，无血清培养基内含il-2，终浓度1000iu/ml，至200ml，混匀，放入co2培养箱中培养；
步骤八：第13天向5个细胞培养瓶中补入37℃预热的x-vivo15无血清培养基，无血清培养基内含il-2，终浓度1000iu/ml，至200ml，混匀，放入co2培养箱中培养；
步骤九：第20天收获细胞，收集5瓶细胞培养物，在室温下，采用离心机在1500rpm下，离心10min；
步骤十：计数，取少量细胞，稀释至200倍，可收获细胞数量约为3-4×109个；
步骤十一：利用流式细胞术检测cd3+、cd3+cd4+、cd3+cd8+、cd4+cd25+细胞比例，此类细胞为细胞毒性t淋巴细胞，利用无血清冻存液冻存该细胞于液氮中。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：它能克服现有技术的弊端，具有取材容易、对机体损伤小、少量外周血可获取大量的具有高活性的细胞毒性t细胞、适宜大规模培养、利用自身静脉血的淋巴细胞，在体外通过靶细胞抗原和淋巴因子的诱导，分化扩增成具有强大杀伤力的ctl细胞，达到清除病毒和杀伤肿瘤细胞的作用。该疗法主要应用于乙肝、丙肝、肿瘤的辅助治疗。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
配置培养基：每1mlx-vivo15无血清培养基内含il-21000iu。
包被培养瓶：用50g/mlcd3预处理t225cm2带有空气滤膜的细胞培养瓶，4℃包被过夜后，备用。
取样，取100ml静脉血，其中活率≥90％，用于制备单个核细胞，取等量淋巴细胞分离液，小心转移静脉血至分离液之上，轻柔操作避免打破交界液面，采用离心机进行离心，在1800×rpm离心15min，小心吸取中间白膜层，即单个核细胞层，转移至新离心管中；
细胞培养具体步骤如下：
步骤一：单个核细胞用生理盐水浸泡，采用离心机进行离心在1800×rpm，离心10min，充分漂洗3遍；
步骤二：将分离获得的单个核细胞用一定体积的x-vivo15无血清培养基培养，无血清培养基培养中内含il-2，终浓度1000iu/ml，按1-2.0×106个/ml的浓度接种于包被过的t225cm2细胞培养瓶中，细胞培养瓶中内含cd3，终浓度50g/ml，放置在37℃下，在5％±0.5％co2的饱和湿度的培养箱内培养；
步骤三：第4天向t225cm2细胞培养瓶中补入步骤二中等体积x-vivo15无血清培养基，无血清培养基内含il-2，终浓度1000iu/ml，做好标记，放入co2培养箱中继续培养；
步骤四：第6天，观察培养基颜色并计数，向t225cm2细胞培养瓶中补入150ml37℃预热的x-vivo15无血清培养基，无血清培养基内含il-2，终浓度1000iu/ml，混匀，放入co2培养箱中继续培养；
步骤五：第7天扩增培养，培养瓶内细胞处于1.0×106个/ml左右时最适宜进行扩增操作，数量过低应将培养瓶放回培养箱，继续培养，取出细胞培养瓶，表面消毒，放入生物安全柜中，用移液器轻轻吹打细胞，混匀，均分至5个t225cm2细胞培养瓶中，每瓶补足37℃预热的x-vivo15无血清培养基，无血清培养基内含il-2，终浓度1000iu/ml，至200ml，混匀，放入co2培养箱中培养；
步骤六：第13天向5个细胞培养瓶中补入37℃预热的x-vivo15无血清培养基，无血清培养基内含il-2，终浓度1000iu/ml，至200ml，混匀，放入co2培养箱中培养；
步骤七：第20天收获细胞，收集5瓶细胞培养物，室温，1500rpm，离心10min；
步骤八：计数，取少量细胞，稀释至200倍，可收获细胞数量约为3-4×109个。
步骤九：利用流式细胞术检测cd3+、cd3+cd4+、cd3+cd8+、cd4+cd25+、cd56+细胞比例，此类细胞为细胞毒性t淋巴细胞。
利用无血清冻存液冻存细胞于液氮中。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。