一种黄杆菌JX-1及其在污水治理中的应用的制作方法

本发明涉及微生物菌种及其应用的技术领域，具体的涉及一种新的黄杆菌jx-1及其在污水治理中应用的技术领域。

背景技术：

水体污染已成为人类急需解决的问题，在人类活动的影响下，生物所需的氮、磷等营养物质大量进入湖泊缓流水体，引起水体富营养化现象，富营养化造成水体功能下降、水质恶化、浮游生物大量死亡等灾难性后果。氮素是生物生命活动所需的基本营养元素，也是引发水体富营养化的关键元素之一，氮素循环在水体营养循环中占有非常重要地位，我国水体氮污染非常严重，它不仅制约了水资源的可利用性，而且直接影响人类的生活健康与社会经济的良好发展。

氨化细菌，就是将大分子有机含氮物通过氧化、水解、还原作用释放出氨态氮的微生物，属于异养细菌，在氮素循环中是连接有机氮和无机氮的纽带。有机氮是水体的重要组分，氨化细菌在水体中通过氨化作用，分解有机氮化物产生氨氮，这在水体生态系统中起着非常重要的作用。因此，开展氨化细菌新菌株的筛选及其生物学特性的研究具有重要的理论价值和实践意义。

技术实现要素：

本发提供一种新菌种黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1及其在污水治理中的应用。本发明通过在鄱阳湖枯水期水体中分离筛选出一株黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1gdmccno.60424，利用分离出的菌种能够降解有机氮，利用该菌株氨化能力对含氮废水进行净化，对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。

本发明采用的主要技术方案：

发明根据鄱阳湖地理环境的特殊性，从鄱阳湖水体中进行氨化细菌和反硝化细菌的培养、分离和筛选，获得一批细菌，并从中分离筛选出一株编号为jx-1的黄杆菌(flavobacteriumsp.)，经16srdna序列分析、系统发育分析、微生物学特性分析和脂肪酸组成分析结果，jx-1菌株属于黄杆菌属(flavobacteriumsp.)，该菌株最适生长条件为：温度10-37℃可生长，最适生长温度为28℃，ph值5.0-11.0范围内可生长，最适ph为7.0，可在nacl浓度0-2.0％条件下生长，最适nacl浓度为1％，培养时间为24-48h，培养基为r2a培养基。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(第九版)等对菌株进行形态学、生理生化试验，确定jx-1菌株为的黄杆菌属中成员，但是具有与常见的黄杆菌属成员菌种不同的特点，具有一些新菌种的特性。

进一步，本发明通过对上述编号为jx-1的菌种进行基因测序，序列参见附后提供的seqidno:1所示，所得序列在ncbi网站进行比对，经比对分析发现，菌株jx-1的16srrna基因序列与flavobacteriumhibernumdsm12611^t的同源性最高，为98.6％，与flavobacteriumpectinovorumdsm6368^t的同源性是98％，菌株jx-1与flavobacteriumhibernumdsm12611^t和flavobacteriumpectinovorumdsm6368^t的亲缘关系最近。利用mega5.0软件通过neighbor-joining法进行聚类分析，结果经比对分析发现，菌株jx-1与flavobacteriumpectinovorumdsm6368^t菌株来源于同一分支的可信度为100％，表明该菌种作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种鉴定可知该菌株jx-1确定其为黄杆菌(flavobacteriumsp.)新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1。

该菌已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)。地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510075。保藏日期2018年7月30日，菌种保藏号为gdmccno.60424。经微生物学鉴定暂命名为黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1。

菌株黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1在r2a培养基上，菌落呈黄色，圆形或不规则形，表明光滑半透明，边缘不整齐；革兰氏染色为阴性，菌体呈杆状，菌体长度约为0.9-1.2μm，宽度约为0.3-0.5μm，不运动，无周身纤毛，无荚膜，不形成芽孢。

进一步，本发明提供的黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1gdmccno.60424具有氨化能力。

进一步，本发明提供的黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1gdmccno.60424在降解有机氮的应用。

进一步，本发明提供的黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1gdmccno.60424具有降解有机氮的能力，因此对氨化细菌利用和通过其降解有机氮来净化水体的研究和利用具有重要价值。

通过实施本发明提供上述具体技术方案，实施本发明内容，可以达到以下有益效果：

(1)本发明提供的黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1gdmccno.60424是一种典型的新菌种可在r2a培养基上生长，菌落呈金黄色，透明，表面光滑，菌体长度约为0.9-1.2μm，宽度约为0.3-0.5μm；菌株jx-1可在10-37℃生长，最适生长温度为28℃，ph值5.0-11.0范围内可生长，最适ph为7.0，可在nacl浓度0-2.0％条件下生长，最适nacl浓度为1％，培养时间为24-48h，培养基为r2a培养基，具有较高的净化水体特性，同时具有培养条件简单，繁殖快的特点，初步确定其为黄杆菌属(flavobacteriumsp.)新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1。

(2)本发明通过在鄱阳湖枯水期水体中分离筛选出一株黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1gdmccno.60424，具有一定氨化能力，利用分离出的菌种能够降解有机氮，当ph值为5、培养温度为25℃、接种量为3％的条件下，jx-1菌株具有氨化能力，有机氮去除率较高。利用该菌株氨化能力对含氮废水进行净化，对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。

附图说明

图1所示为黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1系统发育树图。

图2所示为黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1菌体形态图。

图3所示为ph值对黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1氨化性能的影响图。

图4所示为温度对黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1氨化性能的影响图。

图5所示为接种量对黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1氨化性能的影响图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。

本发明采用的样品：鄱阳湖枯水期水体。

本发明实施例中采用如下基础培养基：r2a培养基包括酵母浸出粉0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸二氢钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，琼脂15.0g，加蒸馏水至1.0l，ph值为7.2；氨化能力测试培养基包括蛋白胨5g，氯化钠0.25g，七水合硫酸亚铁0.01g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.5g，加蒸馏水至1.0l，ph值为7.2。

本发明实施例中采用如下试剂盒：dna抽提试剂盒(生工生物工程股份有限公司)。

实施例一：黄杆菌jx-1的分离、筛选及鉴定

(一)分离、纯化：

从鄱阳湖枯水期水体样品中，取10ml水样加入到90ml无菌水中混合均匀，然后进行10倍梯度稀释获得稀释液，取1ml稀释液接入含5ml氨化细菌培养基的试管中，置于28℃培养10-14d后，取出250ul培养液，与100ul纳氏试剂进行反应，如果呈现棕褐色则表明有氨存在，为阳性；吸取呈阳性反应的氨化细菌培养基试管中的培养液，梯度稀释至10^-4，取100μl稀释液均匀涂布在氨化细菌培养基平板上，28℃培养2-3天，重复3-4次纯化黄杆菌jx-1。纯化后的黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1接种于r2a斜面，28℃培养箱恒温培养2-3天后，4℃保存备用。

(二)分类、鉴定：

1、黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-116srdna序列测定与分析：

(1)pcr模板dna的提取

将黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1接种于r2a液体培养基中，28℃培养18h，获得菌体细胞，采用磁珠法细菌基因组dna抽提试剂盒提取基因组总dna。

(2)pcr扩增

引物:

primera:5’-agagtttgatcctggctcag-3’；

primerb:5’-tacggctaccttgttacgactt-3’。

pcr反应体系总体积25μl，pcr扩增条件为，94℃5min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，30个循环；72℃10min。

(3)序列测定

pcr扩增产物经电泳检测和纯化后测序，其序列如seqidno:1所示。所得序列在ncbi网站进行比对分析，经比对分析发现，菌株jx-1的16srrna基因序列与flavobacteriumhibernumdsm12611^t的同源性最高，为98.6％，与flavobacteriumpectinovorumdsm6368^t的同源性是98％，菌株jx-1与flavobacteriumhibernumdsm12611^t和flavobacteriumpectinovorumdsm6368^t的亲缘关系最近。利用mega5.0软件通过neighbor-joining法进行聚类分析，结果经比对分析发现，菌株jx-1与flavobacteriumpectinovorumdsm6368^t菌株来源于同一分支的可信度为100％，表明该菌种作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种鉴定可知该菌株jx-1确定其为黄杆菌(flavobacteriumsp.)新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1。

2、生理生化测定

将黄杆菌jx-1与其同源性最高的黄杆菌菌株(f.hibernumdsm12611^t、f.pectinovorumdsm6368^t)进行微生物学特性分析，具体结果见与表1。

表1：黄杆菌jx-1与其同源性高的黄杆菌菌株生理生化实验结果比较

注：+，阳性；-，阴性；w，弱阳性。

由表1可以看出，本发明的黄杆菌与其同源性最高的菌株f.hibernumdsm12611^t和f.pectinovorumdsm6368^t在生理生化特征、g+cmol％等方面都存在差异。本发明的菌株jx-1具有胰蛋白酶活性，硝酸盐还原为阴性，不利用d-阿拉伯糖、l-阿拉伯糖、d-木糖、d-半乳糖、d-果糖、l-鼠李糖、熊果苷、d-乳糖、d-蔗糖、菊粉、d-棉子糖。与其同源性最高的两株菌f.hibernumdsm12611^t和f.pectinovorumdsm6368^t在生理生化特征、g+cmol％以及细胞壁脂肪酸种类和含量等方面都存在差异。f.hibernumdsm12611^t和f.pectinovorumdsm6368^t都不具有胰蛋白酶活性，硝酸盐还原为阳性，能够利用d-阿拉伯糖、l-阿拉伯糖、d-木糖、d-半乳糖、d-果糖、l-鼠李糖、熊果苷、d-乳糖、d-蔗糖、菊粉、d-棉子糖。综合上述数据，可以证明菌株jx-1和f.hibernumdsm12611^t和f.pectinovorumdsm6368^t不是同一个种。

3、脂肪酸成分分析

菌株在25℃下在r2a琼脂上培养，并使用指数生长期的细胞。参考miller(1982)的方法提取菌株jx-1及其参比菌株的脂肪酸，采用气相色谱对脂肪酸进行测定，所得数据通过midi数据库(hewlett-packardco.,paloalto,california,usa)进行分析，最终得出菌株的脂肪酸成分及含量，如表2所示。菌株jx-1与参比菌株的脂肪酸各成分的含量有明显不同。

表2：黄杆菌与其参比菌株的细胞壁脂肪酸种类和含量比较

注：tr，微量。

综合16srdna序列分析、系统发育分析、微生物学特性分析、脂肪酸成分分析结果，表明菌株jx-1确为黄杆菌属的一株细菌新种，将其暂命名为(flavobacteriumsp.)jx-1。该菌于2018年7月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，菌种保藏号为gdmccno.60424。

黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1gdmccno.60424在电镜下的形态见附图2，该菌在平板上培养36小时后的菌落呈黄色，圆形或不规则形，表明光滑半透明，边缘不整齐；革兰氏染色为阴性，菌体呈杆状，菌体长度约为0.9-1.2μm，宽度约为0.3-0.5μm，不运动，无周身纤毛，无荚膜，不形成芽孢。

实施例二：黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1氨化性能测定

黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1菌株在r2a培养基中培养18h后，分别接种到100ml氨化能力测试培养基中，在不同试验条件下，150r/min恒温摇床培养40h后，培养液经6000r/min离心取上清液，采用纳氏试剂光度法测定上清液中nh4⁺-n浓度。考察ph值(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)，培养温度(25℃、30℃、35℃和40℃)以及接种量(1％、3％、5％、7％和9％)对菌株氨化性能的影响，每组试验设置3个平行组，以未接种氨化细菌的培养基作为空白对照组。除不同温度实验外，其余均25℃培养。

(1)ph值对菌株氨化性能的影响

如附图3所示，实验结果表明，ph值对黄杆菌jx-1菌株的氨化能力影响显著，当ph值为5时培养液中氨氮浓度达到43.58mg/l，随着ph值的升高培养液中氨氮浓度逐渐下降，由此可知，黄杆菌jx-1菌株在ph值偏低的环境中去除有机氮效果较好。

(2)温度对菌株氨化性能的影响

在温度对黄杆菌jx-1菌株的氨化能力影响试验结果，如附图4所示，温度对黄杆菌jx-1菌株的氨化作用影响明显，在25-30℃范围内有较好的去除有机氮能力，当温度低于35℃黄杆菌jx-1菌株的氨化能力较低。

(3)接种量对菌株氨化性能的影响

在接种量对黄杆菌jx-1菌株的氨化能力影响试验结果，如附图5所示，接种量对黄杆菌jx-1菌株的氨化作用影响明显，在接种量为1％-3％范围内有较好的去除有机氮能力，培养液中氨氮浓度不低于43.78mg/l，去除有机氮效果较好，当接种量大于5％时黄杆菌jx-1菌株的氨化能力有所下降，但接种量在1％-9％范围培养液中氨氮浓度在44.0-40.0mg/l之间，去除有机氮能力较强。

以上试验表明，本发明通过在鄱阳湖枯水期水体中分离筛选出一株黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1gdmccno.60424，具有一定的去除有机氮能力，利用分离出的菌种能够降解有机氮，当ph值为5、培养温度为25℃，接种量为3％的条件下，jx-1菌株具有氨化能力，有机氮去除率较高。

实施例三：黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1在污水中氨化性能测定

将黄杆菌(flavobacteriumsp.)jx-1菌株在r2a培养基中富集培养18h后，以3％接种到100ml污染湖水中，在ph值为5的条件下，150r/min恒温摇床25℃培养40h后，污水经6000r/min离心取上清液，采用纳氏试剂光度法测定上清液中nh4⁺-n浓度。测得污水中氨氮浓度达到41.69mg/l，可见黄杆菌jx-1菌株具有氨化能力，有机氮去除率较高。利用该菌株降解有机氮能力对含氮废水进行净化，对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110>江西省科学院微生物研究所

李娅

<120>一种黄杆菌jx-1及其在污水治理中的应用

<141>2018-12-14

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1436

<212>dna

<213>黄杆菌(flavobacteriumsp.)

<400>1

gatgaacgctagcggcaggcttaacacatgcaagtcgaggggtatatgtcttcggatata60

gagaccggcgcacgggtgcgtaacgcgtatgcaatctaccttttacagagggatagccca120

gagaaatttggattaatacctcatagcatagcagcttcgcatgaagccactattaaagtc180

acaacggtaaaagatgagcatgcgtcccattagctagttggtaaggtaacggcttaccaa240

ggctacgatgggtaggggtcctgagagggagatcccccacactggtactgagacacggac300

cagactcctacgggaggcagcagtgaggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccag360

ccatgccgcgtgcaggatgacggtcctatggattgtaaactgcttttgtacgagaagaaa420

cactacttcgtgaagtagcttgacggtatcgtaagaataaggatcggctaactccgtgcc480

agcagccgcggtaatacggaggatccaagcgttatccggaatcattgggtttaaagggtc540

cgtaggcggtttagtaagtcagtggtgaaagcccatcgctcaacggtggaacggccattg600

atactgctagacttgaattattaggaagtaactagaatatgtagtgtagcggtgaaatgc660

ttagagattacatggaataccaattgcgaaggcaggttactactaatggattgacgctga720

tggacgaaagcgtgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacga780

tggatactagctgttgggagcaatttcagtggctaagcggaagtgataagtatcccacct840

ggggagtacgttcgcaagaatgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtg900

gagcatgtggtttaattcgatgatacgcgaggaaccttaccaaggcttaaatgtagattg960

accgatttggaaacagatctttcgcaagacaatttacaaggtgctgcatggttgtcgtca1020

gctcgtgccgtgaggtgtcaggttaagtcctataacgagcgcaacccctgttgttagttg1080

ccatcgagtgatgtcgggaactctaacaagactgccagtgcaaactgtgaggaaggtggg1140

gatgacgtcaaatcatcacggcccttacgccttgggctacacacgtgctacaatggccgg1200

tacagagagcagccactgggtgaccaggagcgaatctataaagccggtcacagttcggat1260

cggagtctgcaactcgactccgtgaagctggaatcgctagtaatcggatatcagccatga1320

tccggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaagccatggaagctggggg1380

tgcctgaagttggtgaccgcaaggagctgcctagggtaaaactggtaactagggct1436