本发明涉及微生物分子生物学检测试剂，具体涉及一种基于lamp技术的干粉化溶藻弧菌核酸快速检测试剂盒。
背景技术：
：溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)作为一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，大面积分布于海洋环境中，并且广泛寄生于大量海洋生物体内，其在侵染、增殖等过程中会产生相关毒素，破坏宿主体内正常新陈代谢，造成宿主组织、细胞等严重损伤，甚至是死亡。在水产养殖中，溶藻弧菌是引发各种鱼类、虾蟹、贝类以及甲壳类等致病、死亡的主要条件致病菌，其疫情大面积爆发直接给该养殖行业造成不可估量的经济损失。另外，人体会由于进食被溶藻弧菌污染的水产品而感染，造成急性胃肠炎、外耳炎、中耳炎、伤口创面感染，甚至是败血症等病症，严重威胁其身心健康。因此，在生产生活中，尤其是水产品相关的微生物检测中，溶藻弧菌属于日常监测、检疫的重点对象。目前，水产养殖行业一般通过广泛使用抗生素来控制溶藻弧菌疫情，这样会导致严重的菌株耐药性，其危害也会加剧。虽然当前已建立了多种溶藻弧菌检测方法，主要包括采用传统培养基法(病原微生物分离鉴定、形态学鉴定及自动化鉴定方法)、酶联免疫技术、核酸探针技术、核酸扩增(pcr)技术等，但这些方法表现出检测周期长、操作复杂、仪器昂贵以及成本高等不足，并且多局限在实验室检测，难以满足在基层现场的快速检测需求。可见，寻求一种能够快速、准确地鉴定出溶藻弧菌的方法具有重要的意义。目前国内主要以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化鉴定和血清学分型鉴定等通行方法进行食品微生物学相关检验，其初步鉴定一般需要2～3天，而最终完成鉴定报告则需10～15天。整个检测过程十分漫长，难以满足快速检测的需要。lamp技术是由notomi等人于2000年开发的一种新型的体外恒温扩增特异核酸片段的技术。该技术利用两对特殊引物和具有链置换活性的bstdna聚合酶。使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在恒温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应，与常规pcr相比，无需反复变温、电泳判读等过程，在灵敏度、特异性和检测范围等技术指标上能媲美甚至高于pcr技术，而不依赖专门的仪器可以实现现场的快速检测，其成本远低于荧光定量pcr。lamp引物设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因6个区域设计的4条特殊引物，并增加2条靶向扩增反应中形成的环状结构的环引物。在引物设计时候，应注意以下问题：在靶点的选择上为特异基因的保守序列，靶序列长度超过500bp会显著降低lamp的扩增效率，最佳靶序列长度应为150bp～180bp；引物的gc含量在40～65％；对于gc含量丰富的序列，引物区的tm值控制在60℃～65℃，at含量丰富的序列，引物区的tm值则控制在55℃～60℃；为了保持引物末端的稳定性，其末端稳定性自由能(δg)值小于-4kcal/mol；引物设计应避免出现二级结构；环引物的加入可以把原来的lamp反应缩短一半左右，但在引物设计中，其设计区域常常因为序列区间长度不够无法用软件生成，因此会出现只有1条环引物或没有环引物序列符合条件，此时通过标记设计区域进行手动设计；引物的设计满足以上条件的一般为5～10套，实际扩增效果仍然需要通过反应扩增的各种参数，如灵敏度、指数增长期的起始时间、扩增产物量等，如果只采用单一引物组，不能保证所选的引物能够进行高效扩增。在非实验室的条件下利用lamp技术进行快速检测，检测前都要配制相应的反应体系溶液，容易导致由于多次操作引起的误差，且易造成实验区间的交叉污染，检测所需的部分试剂需要冷冻储存，不适合高温长途运输，尤其是bstdna聚合酶，需要在-20℃条件下保存，不宜反复冻融，以免影响酶活，因此会增加试剂的运输成本。目前该检测方法尚未在食品安全、医药卫生等领域推广开来，且作为非标方法，目前已有的lamp产品仅仅针对检测流程，涉及到样品前处理的方法和方式均无提及，加之市场上基于lamp技术的溶藻弧菌快速检测试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有溶藻弧菌的传统致病微生物检测技术以及其相关产品制备工艺的不足，提供一种基于lamp技术可常温运输的干粉化溶藻弧菌快速检测试剂盒。本发明所采取的技术方案是：一种溶藻弧菌的lamp引物组，包括外引物f3/b3、内引物fip/bip以及环引物lf/lb，其序列如下：溶藻弧菌-f3：atgcgtcatgcactgctattatc溶藻弧菌-b3：tcgtagcggctagcgaagctag溶藻弧菌-fip：gtcgactgcgcgtgacggtgcgctccgcaatatggatcatcg溶藻弧菌-bip：tgcagctgtgcgtgcgagtgagtagagcgagcttcgctgtctc溶藻弧菌-lf：atgctgctgacgtgtctgcag溶藻弧菌-lb：gtcgagtgctgctgatcgtcgg。一种溶藻弧菌的干粉化lamp快速检测试剂盒，其lamp引物组如上所示。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，检测试剂盒包括复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色液、裂解液、封闭液和干粉化的检测试剂。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，干粉化的检测试剂冻干前的组成为：0.7～2.0mmol/ldntps、0.3～0.5u/μlbstdna聚合酶、0.1～0.8μmol/l外引物f3/b3、1.2～2.0μmol/l内引物fip/bip、0.6～1.8μmol/l环引物lf/lb、100～400μmol/lmncl2以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为无菌超纯水。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，复溶液含有：1～1.2mmol/lmgso4、5～15mmol/lkcl、10～25mmol/ltris-hcl、5～15mmol/l(nh4)2so4、0.1～0.5％tritonx-100以及0.3～2.0mol/l甜菜碱。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，显色液为10～85μmol/l钙黄绿素。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，裂解液含有：5～35mmol/ltris-hcl，ph8.3、0.5～1.5mmol/ledta以及0.2～1.3％sds。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，封闭液为无菌石蜡油。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，阳性对照为提纯的溶藻弧菌基因组dna制成的冻干粉，阴性对照为提纯的非溶藻弧菌基因组dna制成的冻干粉。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，其使用方法包括如下步骤：1)参照sn/t2754.12-2011《出口食品中致病菌环介导恒温扩增(lamp)检测方法第12部分：溶藻弧菌》，根据nmklno.156进行样品制备和增菌，接种20g食品样品于200ml3％氯化钠碱性蛋白胨水中，36±1℃进行增菌10±2h；2)取以上增菌液1～2ml经6000r/min离心，去上清；3)分别向(2)中离心得到沉淀中加入裂解液，充分悬浮，99℃热裂解10min，裂解结束后12000r/min离心15min，上清即为待检样品粗提核酸；4)取干粉化的检测试剂，加入复溶液，待干粉化的检测试剂充分溶解后，将待检测的样品核酸加入反应管中，对照管分别加入经无菌超纯水溶解的溶藻弧菌基因组dna作为阳性对照，以无菌超纯水溶解的非溶藻弧菌基因组dna为阴性对照，加入显色液，充分混匀后加入封闭液，设置63℃恒温反应；5)反应后结果判读：反应结束后，观察结果，阴性对照反应后呈淡橙色，阳性对照反应后呈荧光绿，待测样品反应管以此作为对照进行判读，若阴阳对照反应管任一结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。本发明的有益效果是：本发明的干粉化溶藻弧菌快速检测试剂盒，基于lamp技术快速检测溶藻弧菌，利用3对特殊引物和具有链置换活性的bstdna聚合酶，特异性识别靶序列上的8个独立区域，并实现在恒温条件下(60～65℃)进行链置换扩增反应，克服了传统pcr反应需要通过热变性过程获得单链模板、检测时间长、易污染以及成本高等缺点，同时该方法在温和温度条件进行，操作简便，对检测人员的技术素质要求也低，便于对大样本实现成本低廉的快速筛选。本发明的干粉化溶藻弧菌快速检测试剂盒，还具有如下优点：①该试剂的干粉化制备工艺加入复合冻干保护剂，大大增加试剂稳定性，试剂的保质期时间可以延长到2年，且便于常温运输，节约运输成本；②该干粉化试剂已将反应体系中部分组分试剂按相应比例组合，经复溶液溶解即用，减少溶液配置步骤，使用更加便捷、准确，更适于基层现场检测；③该反应过程在恒温条件下即可进行，无需特殊配套试剂以及仪器，大大降低了检测成本；④反应所需模板量少，灵敏度高，最低检验限可低至18cfu/test；⑤利用靶基因序列的3对特殊引物，特异性地识别靶序列上的8个独立区域，整个反应在30～45min内完成，高效而快速；⑥反应前加入由钙黄绿素配置的显色液，通过肉眼观察颜色变化或者荧光监测仪器对荧光图谱的变化对结果进行判读，判读直观方便，且避免反应后开盖造成的气溶胶污染。具体实施方式下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。引物的筛选表1、不同的引物组序列表引物序列的编号如下：表2、引物组的序列编号表对以上6组引物采取统一的优化反应体系测试，经琼脂糖凝胶电泳观察反应产物，发现引物组5仅需反应30min即可出现明显扩增条带，而引物组1、引物组2和引物组6需40min左右，引物组3和引物组4需45min左右。试剂盒的制备引物合成：按照引物组6提供的序列合成寡聚核苷酸引物，并定量配制。制备该试剂冻干粉：按照表3所示在无菌环境下混合需要冻干处理的相关组分混合液，封装于容器中，置于液氮预冻后再按照常规冷冻干燥，最后可得到干粉化的检测试剂。表3、不同实例冻干粉的组成表注：w/v为g/ml。制备复溶液，其组成如表4所示：表4、复溶液组成表组分终浓度kcl8mmol/ltris-hcl，ph8.816mmol/l(nh4)2so49mmol/lmgso46mmol/ltritonx-1000.2％甜菜碱1.2mol/l制备阳性对照干粉：向提纯的溶藻弧菌基因组dna溶液分别加入3％的海藻糖(w/v)，分装后经上述冻干程序制备阳性对照干粉。制备阴性对照干粉：向提纯的非溶藻弧菌基因组dna溶液分别加入3％的海藻糖(w/v)，分装后经上述冻干程序制备阴性对照干粉。配制显色液：配置终浓度为60μmol/l钙黄绿素由0.3mmol/l钙黄绿素和7.2mmol/lmncl2等体积混合得到，钙黄绿素的终浓度为15μmol/l，mncl2的终浓度为360μmol/l，置于容器中。封闭液：液体石蜡油无菌分装，置于容器；配制裂解液：含有10～20mmol/ltris-hcl，ph8.3、1mmol/ledta、0.3～1％sds，置于容器中。稳定性试验：根据上述试剂冻干粉制备操作获取9例不同组分的试剂冻干粉，并相应地组装成9种不同的试剂盒，存放于2～8℃环境中，每隔3个月对该9种试剂盒产品进行灵敏度试验，结果见表5。表5、不同实例检测试剂的稳定性数据采用例9复合冻干保护剂进行反应试剂的冻干，经过液氮预冻和冷冻干燥后，试剂冻干粉能保持较高的稳定性，最长的保质期时间为21～24个月，远高于同类型产品的12个月保质期，在保存12个月后，其检验限略有下降，均在70cfu/test以上，部分检测试剂出现了失活的情况。除含5％海藻糖的复合保护剂有吸潮现象外，其余复合保护剂冻干成粉状制剂后在各自保质期范围内均保持良好形态，没有塌陷和镂空现象。最低检验限和灵敏度的比较(1)用无菌接种环分别挑取溶藻弧菌atcc33787的纯菌菌落，用无菌生理盐水进行梯度稀释(稀释倍数分别为100，101，102，103，104，105，106，107，108)，并分别取各个稀释菌液100μl螺旋接种到tsa平板进行培养和计数。(2)分别取以上稀释菌液100μl，6000r/min离心5min，弃上清，加入10μl裂解液充分悬浮菌体沉淀，99℃加热裂解菌体10min，菌体裂解液12000r/min离心15min，取上清即为粗提的菌体模板基因。(3)以上粗提dna作为模板进行pcr和lamp反应，溶藻弧菌pcr引物为：pf-5’-agctgactagcgcgcgccata-3’(seqidno.37)，pr-5’-gctagctagctagcccgcgtag-3’(seqidno.38)。(4)扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，72℃充分延伸10min，35个循环。(5)以上粗提dna为模板进行lamp反应，取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μl，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各个稀释菌液对应的粗提dna模板2.5μl，无菌超纯水2.5μl，充分混匀后加入20μl/管封闭液，紧盖，设置62℃恒温反应50min；(6)以上pcr与lamp扩增产物用琼脂糖凝胶电泳来判读，平板菌落计数确定最低检验限。结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示溶藻弧菌pcr的最低检验限在106倍数稀释处，lamp最低检验限制在107倍数稀释处。并参照gb4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》，测定对应的菌落计数，结果显示溶藻弧菌在107倍数稀释处为18cfu，显示lamp检测的灵敏度远高于pcr。纯菌的检测(1)样品处理用于纯菌的筛选鉴定中，用接种环挑取各菌的单菌落半环，转移到含有30μl裂解液的无菌pcr管中，充分混匀后水浴或者金属浴99℃热裂解10min；裂解结束后转到离心机中12000r/min离心10min，取上清即为样品粗提基因组dna，选用的菌株见表6。表6、选用的菌株表(2)恒温扩增反应取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μl，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各类菌粗提的dna模板2.5μl。另取2管分别做阴性对照和阳性对照，分别加入对应的对照试剂2.5μl，后分别向所有各管中加入显色液2.5μl，充分混匀后加入20μl封闭液，紧盖，经biometraprofessionalpcr仪设置63℃恒温反应50min。(3)反应后判读反应结束后，对比反应前后颜色变化，若呈现荧光绿则为阳性，淡橙色则为阴性，若阴阳性对照任一结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测，整个观察过程不得打开反应管盖。检测结果见表7。表7、纯菌检测结果结果显示，经本发明检测，以上所选的溶藻弧菌和非溶藻弧菌的核酸快速检测中，溶藻弧菌的标准菌株和分离株在各自的检测体系中出现明显荧光绿；而非溶藻弧菌属各菌反应前后均未出现明显颜色变化，仍为淡橙色。可见本发明具有极好的特异性，能有效检出溶藻弧菌。常规食品中溶藻弧菌的快速检测(1)参照sn/t2754.12-2011《出口食品中致病菌环介导恒温扩增(lamp)检测方法第12部分：溶藻弧菌》，根据nmklno.156进行样品制备和增菌，接种20g食品样品于200ml3％氯化钠碱性蛋白胨水中，36±1℃进行增菌10±2h；吸增菌液1ml到1.5ml规格的无菌离心管中，6000r/min离心5min，弃上清；加入30μl裂解液，充分悬浮菌体，轻弹管壁消除气泡，99℃加热10min，12000r/min离心15min，上清即为粗提的dna；(2)恒温扩增反应，取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μl，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各样品粗提的dna模板2.5μl；另取2管分别做阴性对照和阳性对照，分别加入对应的对照试剂2.5μl，后分别向所有各管中加入显色液2.5μl，充分混匀后加入20μl封闭液，紧盖，设置biometraprofessionalpcr仪至63℃恒温反应50min；(3)反应结束后，观察反应管中溶液由检测前的淡橙色变为荧光绿色，与阳性对照管变化相同，表示有溶藻弧菌检出，如颜色无变化，表示无检出。sequencelisting<110>广东环凯生物科技有限公司广东环凯微生物科技有限公司<120>溶藻弧菌干粉化lamp快速检测试剂盒<130><160>38<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>人工引物<400>1atggcgatgcatgcccggagcta23<210>2<211>25<212>dna<213>人工引物<400>2gtcagtgtaggtcagcgtatgggtc25<210>3<211>42<212>dna<213>人工引物<400>3aggcagtcgtgcatgtgcacgtgcagcgtgcagtcgatcgtc42<210>4<211>41<212>dna<213>人工引物<400>4gacgatgcgtgcgcgccgtgagctgtgcagccagtgcgcgg41<210>5<211>22<212>dna<213>人工引物<400>5ggaccgtgcgggtgcagtgacg22<210>6<211>23<212>dna<213>人工引物<400>6gctgcatgcagtcagtgcatcgg23<210>7<211>23<212>dna<213>人工引物<400>7gatggatgcgtgcagtgcgcggc23<210>8<211>21<212>dna<213>人工引物<400>8gactgcagtgggcgccggagc21<210>9<211>41<212>dna<213>人工引物<400>9ctgagtgcgatgcgtgcacgtgccagtgggggccgatgtcg41<210>10<211>41<212>dna<213>人工引物<400>10gtgcgatgcgtgcaagtgcgtgcagtgccgtgcgatggtgc41<210>11<211>22<212>dna<213>人工引物<400>11tgcgatgtgcagtgcccgtgac22<210>12<211>23<212>dna<213>人工引物<400>12atgcgtgcatgcgcgcatgcacg23<210>13<211>23<212>dna<213>人工引物<400>13catgtgatgcggtgcaatgtgtc23<210>14<211>21<212>dna<213>人工引物<400>14gactgcgatggcgcgtgcgat21<210>15<211>42<212>dna<213>人工引物<400>15tgacgcgccgtgcatgcgtgacgcgtgaccgtgcgaatgcgc42<210>16<211>40<212>dna<213>人工引物<400>16gcagtgcagtggcgcgcccggtgacgtggcgaatgtgcga40<210>17<211>21<212>dna<213>人工引物<400>17gtgccagccgtgacgcgtagc21<210>18<211>22<212>dna<213>人工引物<400>18agtcgtgcgtgcgtagcgatgg22<210>19<211>22<212>dna<213>人工引物<400>19atgcgtgcgcgtgacgtgcgat22<210>20<211>23<212>dna<213>人工引物<400>20gctgacgtgcgatgcgtgacgcg23<210>21<211>42<212>dna<213>人工引物<400>21tgcgatgcgtgcggcgatgcgtgacgtgcacgtgcgtgcggt42<210>22<211>40<212>dna<213>人工引物<400>22cgtgcagtgcggtgcgacgtgcgagtgcggcgactgcgtg40<210>23<211>21<212>dna<213>人工引物<400>23acgtgcgatgcgtgcgtgacg21<210>24<211>22<212>dna<213>人工引物<400>24catgcgtggtcagtgcgatgcc22<210>25<211>23<212>dna<213>人工引物<400>25atgcgtcatgcactgctattatc23<210>26<211>22<212>dna<213>人工引物<400>26tcgtagcggctagcgaagctag22<210>27<211>42<212>dna<213>人工引物<400>27gtcgactgcgcgtgacggtgcgctccgcaatatggatcatcg42<210>28<211>43<212>dna<213>人工引物<400>28tgcagctgtgcgtgcgagtgagtagagcgagcttcgctgtctc43<210>29<211>21<212>dna<213>人工引物<400>29atgctgctgacgtgtctgcag21<210>30<211>22<212>dna<213>人工引物<400>30gtcgagtgctgctgatcgtcgg22<210>31<211>21<212>dna<213>人工引物<400>31cgtgacgtgccgtgcgacgtg21<210>32<211>22<212>dna<213>人工引物<400>32tgcgtgacgtgcgatgcgcatg22<210>33<211>42<212>dna<213>人工引物<400>33gtgcgatgcgtacgtgccgtgcgcgagcgtgacgtgcgtgca42<210>34<211>41<212>dna<213>人工引物<400>34tgcgtgcgacgtgcgatgcgtgcgtggtgcgcgcgcgtgca41<210>35<211>18<212>dna<213>人工引物<400>35gtgcgacgcgcgcgtggg18<210>36<211>20<212>dna<213>人工引物<400>36gactgcgatggcgcatgcgc20<210>37<211>21<212>dna<213>人工引物<400>37agctgactagcgcgcgccata21<210>38<211>22<212>dna<213>人工引物<400>38gctagctagctagcccgcgtag22当前第1页12