具有修饰的磷脂酶结构域的腺相关病毒(AAV)的制作方法

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本公开通常涉及具有带有修饰的磷脂酶结构域的病毒衣壳蛋白的腺相关病毒(aav)，以及使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中产生所述腺相关病毒(aav)的方法。

背景技术：

腺相关病毒(aav)是最有希望用于人类基因治疗的病毒载体之一。aav含有大约4.7kb的ssdna基因组，其表达两个orf；一个编码病毒外壳蛋白vp1、vp2和vp3以及装配相关蛋白或装配激活蛋白(aap)，且第二个编码四种病毒复制酶组分；orf由两个反向末端重复序列(itr)侧接。itr由病毒rep蛋白识别，其中它们在新生病毒衣壳中的基因组复制及新合成基因组的装载中起关键作用。可使用载体制备重组aav颗粒，其中目的基因(goi)在两个itr之间克隆，并且病毒cap和rep蛋白以反式提供。

重组aav颗粒保留了有效感染分裂以及未分裂的人类细胞的能力。病毒颗粒被认为进入细胞核，其中基因组作为附加体存留，并继续数月至数年长期表达重组载体中存在的任何转基因。重要的是，尽管aav感染很常见，但通常不认为该病毒与任何疾病相关联。此外，有许多aav血清型，通常称为血清型1-12，它们在组织嗜性方面不同。鉴于这些优点，正在针对许多人类疾病的基因治疗临床试验中对重组腺相关病毒(raav)进行评价。

重组aav的产生系统有两种主要类型：(1)使用哺乳动物细胞系(例如，hek293细胞、cos细胞、hela细胞、kb细胞)的常规产生系统；和(2)新近使用昆虫细胞的产生系统。

哺乳动物产生系统通常涉及三重转染，其中三种质粒被转染到哺乳动物细胞系中，这些质粒编码i)aavrep和外壳蛋白，ii)来源于腺病毒的辅助功能(helperfunction)，和iii)由itr侧接的目的基因。aavrep和itr序列通常来源于aav2血清型以及cap序列，尽管来自其它血清型的序列也可被取代以产生假型病毒颗粒，病毒衣壳蛋白的选择反映所需的组织嗜性。

哺乳动物的产生系统有若干缺点。治疗用途最重要的缺点是与贴壁哺乳动物细胞的大规模转染相关的难点，以及随之而来的aav产生系统的扩展性差。此外，在哺乳动物细胞培养物中产生的用于临床用途的载体有被哺乳动物宿主细胞中存在的不良且有可能是致病的物质污染的风险。

作为哺乳动物的产生系统的替代方案，昆虫细胞可用于使用杆状病毒载体来产生aav。杆状病毒感染昆虫细胞，它们在昆虫细胞中以附加体方式进行复制，并且通过使用源于杆状病毒的启动子可以在感染细胞中驱动极高水平的转基因表达。通常昆虫细胞被两种重组杆状病毒共感染，一种表达aavcap和rep蛋白，并且第二种含有由itr侧接的goi，不需要病毒辅助功能。

使用昆虫细胞来产生aav的主要优点是扩展性，因为昆虫细胞已经适应于在没有诸如胎牛血清的补充剂的悬浮培养物中生长。然而，昆虫细胞产生系统也有若干缺点，包括难以获得三种aav衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)的正确化学计量，杆状病毒表达载体的传代不稳定，并且最明显的是与在常规哺乳动物细胞中产生的相应aav相比，所得aav的功能性低。

在昆虫细胞中产生的aav的功能性因aav血清型而异。例如，urabe等人(2006)j.virol.80(4):1874-1885报道了在昆虫细胞内的杆状病毒系统中产生的aav5颗粒相比于在相同系统中产生的aav2具有的活性差。从那时起人们已经认识到，当由昆虫细胞中的杆状病毒表达系统产生时，aav2保留磷脂酶结构域(pla)在其病毒衣壳蛋白的亚基1(vp1)中的活性，从而使病毒能够逃离核内体室并到达细胞质。urabe等人通过构建嵌合aav2/5vp1蛋白质部分地解决了这一问题，其中aav5vp1的至少49个氨基酸的n-末端部分被aav2vp1的相应部分置换，以便提高病毒粒子的功能性。然而，考虑到在人类基因治疗中使用aav，本领域中仍然需要在昆虫细胞中(由不同于aav2的血清型)产生重组aav的替代和/或改进方法，其中aav能够在细胞内化后逃离核内体。

要理解的是，本文中包括的对公开文献、行为、材料、装置、制品等的任何讨论仅仅是为了提供本发明的背景目的。这不被视为承认任何或所有这些事项是与本发明相关的领域中的公知常识，因为其在本申请的任何权利要求的优先权日之前就存在。

技术实现要素：

本公开基于发明人的意外发现，通过在磷脂酶结构域及侧接区内的特定位点进行氨基酸取代可以恢复或提高来自由昆虫细胞中的杆状病毒表达系统产生的不同于血清型2的血清型的aav的核内体逃离活性。具体地，发明人首次表明，有可能恢复或提高两种代表性aav血清型(血清型8和9)的核内体逃离活性，方式是通过将在多达六个残基位置处的氨基酸用来自aav血清型2的相应位置处的氨基酸取代。在这方面，本发明人已表明不必将整个pla结构域与aav2的pla结构域进行交换来产生嵌合aav，也不必产生表达包含野生型vp1/pla序列和aav2的序列(例如，aav2/wtvp1)的镶嵌衣壳的aav，这是迄今用来提高在昆虫细胞中产生的aav的功能性的策略。本发明人提供了一种新颖方法，通过该方法可恢复或提高在昆虫细胞中产生的重组非血清型2aav的核内体逃离活性，而不必置换相应aav的野生型病毒衣壳蛋白内的整个结构域和/或亚基序列。

因此，本公开提供包含编码腺相关病毒(aav)病毒衣壳蛋白的多核苷酸序列的核酸分子，其中所述病毒衣壳蛋白包含修饰的亚基1(vp1)序列，所述序列包含位置1处的丝氨酸、位置26处的谷氨酸、位置40处的精氨酸、位置43处的天冬氨酸、位置44处的丝氨酸和位置64处的赖氨酸，其中所述氨基酸位置是相对于seqidno:1中给出的序列定义的，其中在位置1、26、40、43、44和64中的任何一处或多处的所述氨基酸相对于相应的野生型序列被修饰，且其中除了在所述任何一个或多个位置1、26、40、43、44和64处的氨基酸以外，没有另外的氨基酸相对于相应的野生型序列被修饰。

在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型1。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型3。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型4。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型5。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型6。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型7。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型8。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型9。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型10。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型11。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型12。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型13。

在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白选自：

(i)来自aav1的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:15中给出的序列

(ii)来自aav3的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:16中给出的序列；

(iii)来自aav4的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:17中给出的序列；

(iv)来自aav5的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:18中给出的序列；

(v)来自aav6的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:19中给出的序列；

(vi)来自aav7的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:20中给出的序列；

(vii)来自aav8的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:21中给出的序列；

(viii)来自aav9的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:22中给出的序列；

(ix)来自aav10的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:23中给出的序列；

(x)来自aav11的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:24中给出的序列；

(xi)来自aav12的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:25中给出的序列；和

(xii)来自aav13的病毒衣壳蛋白，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:26中给出的序列。

在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav1，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:15中给出的序列。

在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav3，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:16中给出的序列。

在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav4，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:17中给出的序列。

在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav5，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:18中给出的序列。

在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav6，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:19中给出的序列。

在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav7，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:20中给出的序列。

在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav8，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:21中给出的序列。

在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav9，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:22中给出的序列。

在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav10，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:23中给出的序列。

在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav11，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:24中给出的序列。

在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav12，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:25中给出的序列。

在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav13，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:26中给出的序列。

在每个前述实例中，所述病毒衣壳蛋白可包含来自与所述修饰的vp1相同的aav血清型的亚基2(vp2)和亚基3(vp3)序列。

在一个实例中，编码所述aav病毒衣壳蛋白的所述核苷酸序列与用于在昆虫细胞中表达的启动子可操作地连接。在一个实例中，所述启动子是多面体启动子。在另一实例中，所述启动子是p10启动子。

所述核酸分子还可包含编码至少一种选自rep78和rep68的大aav复制(rep)蛋白及至少一种选自rep52和rep40的小aavrep蛋白的多核苷酸序列。在一个实例中，所述核酸分子包含编码rep78和rep52的多核苷酸序列。在一个实例中，所述核酸分子包含编码rep78和rep40的多核苷酸序列。在一个实例中，所述核酸分子包含编码rep68和rep52的多核苷酸序列。在一个实例中，所述核酸分子包含编码rep68和rep40的多核苷酸序列。在一个实例中，所述核酸分子包含编码rep78、rep68、rep52和rep40的多核苷酸序列。在每个前述实例中，所述rep蛋白可来自与所述病毒衣壳蛋白相同的aav血清型。可选地，所述rep蛋白可来自与所述病毒衣壳蛋白的aav血清型不同的aav血清型，例如rep蛋白可来自aav血清型2。

编码所述rep蛋白的所述多核苷酸序列可与用于在昆虫细胞中表达所述rep蛋白的启动子可操作地连接。在一个实例中，编码所述rep蛋白的多核苷酸序列与多面体启动子可操作地连接。在一个实例中，编码所述rep蛋白的多核苷酸序列与p10启动子可操作地连接。

在每个前述实例中，所述核酸分子可包含编码装配激活蛋白(aap)的多核苷酸。例如，所述aap可由与编码所述病毒衣壳蛋白的开放阅读框架不同的开放阅读框架编码。

本公开还提供包含如本文所述的核酸分子的杆状病毒载体。

本公开还提供多种杆状病毒载体，其包含：

(i)第一杆状病毒载体，其包含如本文所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码如本文所述的aav病毒衣壳蛋白和rep蛋白；和

(ii)第二杆状病毒载体，其包含编码由aav反向末端重复(itr)序列侧接的目的蛋白质或rna的多核苷酸。

在一个实例中，所述aavitr序列来自与所述病毒衣壳蛋白相同的血清型。在另一实例中，所述aavitr序列来自不同于所述病毒衣壳蛋白的血清型的血清型。在一个特定的实例中，所述aavitr序列来自aav血清型2。

本公开还提供多种杆状病毒载体，包含：

(i)第一杆状病毒载体，其包含如本文所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码如本文所述的aav病毒衣壳蛋白；

(ii)第二杆状病毒载体，其包含编码至少一种选自rep78和rep68的大aav复制(rep)蛋白及至少一种选自rep52和rep40的小aavrep蛋白的多核苷酸序列；和

(iii)第三杆状病毒载体，其包含编码由aav反向末端重复(itr)序列侧接的目的蛋白质或rna的多核苷酸。

在一个实例中，所述第二杆状病毒载体包含编码rep78和rep52的多核苷酸序列。在一个实例中，所述第二杆状病毒载体包含编码rep78和rep40的多核苷酸序列。在一个实例中，所述第二杆状病毒载体包含编码rep68和rep52的多核苷酸序列。在一个实例中，所述第二杆状病毒载体包含编码rep68和rep40的多核苷酸序列。在一个实例中，所述第二杆状病毒载体包含编码rep78、rep68、rep52和rep40的多核苷酸序列。在每个前述实例中，所述rep蛋白可来自与由所述第一杆状病毒载体中的所述核酸分子编码的病毒衣壳蛋白相同的aav血清型。可选地，所述rep蛋白可来自与由所述第一杆状病毒载体中的所述核酸分子编码的病毒衣壳蛋白的aav血清型不同的aav血清型，例如所述rep蛋白可来自aav血清型2。

在每个前述实例中，编码所述第二杆状病毒载体内的所述rep蛋白的多核苷酸序列可与用于在昆虫细胞中表达所述rep蛋白的启动子可操作地连接。在一个实例中，编码所述第二杆状病毒载体内的所述rep蛋白的多核苷酸序列与多面体启动子可操作地连接。在一个实例中，编码所述第二杆状病毒载体内的所述rep蛋白的多核苷酸序列与p10启动子可操作地连接。

在一个实例中，所述第三杆状病毒载体包含来自与由所述第一杆状病毒载体中的所述核酸分子编码的病毒衣壳蛋白相同的血清型的aavitr序列。在另一实例中，所述第三杆状病毒载体包含来自不同于由所述第一杆状病毒载体中的所述核酸分子编码的病毒衣壳蛋白的血清型的血清型的aavitr序列。在一个特定的实例中，所述aavitr序列来自aav血清型2。

杆状病毒载体中的至少一者包含编码用于aav的装配激活蛋白(aap)的多核苷酸。在一个实例中，所述aap可由所述第一杆状病毒载体内包含的多核苷酸序列编码。在一个实例中，所述aap可由所述第二杆状病毒载体内包含的多核苷酸序列编码。在另一实例中，所述aap可由所述第三杆状病毒载体内包含的多核苷酸序列编码。

本公开还提供包含如本文所述的核酸的昆虫细胞。

本公开还提供包含如本文所述的杆状病毒载体或多种杆状病毒载体的昆虫细胞。

在一个实例中，编码所述aav病毒衣壳蛋白的多核苷酸序列和/或编码所述rep蛋白的多核苷酸序列由附加体复制的重组杆状病毒基因组表达。

可选地或者另外地，编码由aav反向末端重复(itr)序列侧接的目的蛋白质或rna的多核苷酸由附加体复制的重组杆状病毒基因组表达。

本公开还提供在昆虫细胞中产生腺相关病毒(aav)的方法，包括：

(i)在培养基中在足以使细胞产生aav的条件下培养如本文所述的昆虫细胞；并任选地

(ii)从所述培养基和/或细胞中回收所述aav。

本公开还提供在昆虫细胞中产生腺相关病毒(aav)的方法，包括：

(i)用以下对昆虫细胞进行共感染：第一杆状病毒，其基因组包含本文所述的核酸分子，所述核酸分子编码如本文所述的aav病毒衣壳蛋白和rep蛋白；和第二杆状病毒，其基因组包含编码由aav反向末端重复(itr)序列(例如来自aav血清型2的itr序列)侧接的目的蛋白质或rna的多核苷酸；

(ii)在培养基中在足以使细胞产生aav的条件下培养在(i)中用所述杆状病毒感染的所述昆虫细胞；并任选地

(iii)从所述培养基和/或细胞中回收所述aav。

在一个实例中，产生所述aav的方法包括从所述培养基和/或细胞中回收所述aav。在另一实例中，产生所述aav的方法包括从所述培养基和/或细胞中回收所述aav，然后纯化所述aav。在一个实例中，从所述细胞中回收所述aav。在一个实例中，从所述培养基中回收所述aav。在一个实例中，从所述细胞和培养基中回收所述aav。

所述第一和第二杆状病毒中的至少一者的基因组将包含编码用于aav的装配激活蛋白(aap)的多核苷酸。在一个实例中，所述aap可由所述第一杆状病毒的基因组内包含的多核苷酸序列编码。在一个实例中，所述aap可由所述第二杆状病毒的基因组内包含的多核苷酸序列编码。

本公开还提供在昆虫细胞中产生腺相关病毒(aav)的方法，包括：

(i)用以下对昆虫细胞进行共感染：第一杆状病毒，其基因组包含如本文所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码如本文所述的aav病毒衣壳蛋白；第二杆状病毒，其基因组包含编码至少一种选自rep78和rep68的大aav复制(rep)蛋白和至少一种选自rep52和rep40的小aavrep蛋白的多核苷酸序列；和第三杆状病毒，其基因组包含编码由aav反向末端重复(itr)序列侧接的目的蛋白质或rna的多核苷酸；

(ii)在培养基中在足以使细胞产生aav的条件下培养在(i)中用所述杆状病毒感染的所述昆虫细胞；并任选地

(iii)从所述培养基和/或细胞中回收所述aav。

在一个实例中，用来感染所述昆虫细胞的所述第二杆状病毒载体包含编码rep78和rep52的多核苷酸序列。在一个实例中，用来感染所述昆虫细胞的所述第二杆状病毒载体包含编码rep78和rep40的多核苷酸序列。在一个实例中，用来感染所述昆虫细胞的所述第二杆状病毒载体包含编码rep68和rep52的多核苷酸序列。在一个实例中，用来感染所述昆虫细胞的所述第二杆状病毒载体包含编码rep68和rep40的多核苷酸序列。在一个实例中，用来感染所述昆虫细胞的所述第二杆状病毒载体包含编码rep78、rep68、rep52和rep40的多核苷酸序列。在每个前述实例中，所述rep蛋白可来自与由所述第一杆状病毒载体中的所述核酸分子编码的病毒衣壳蛋白相同的aav血清型。可选地，所述rep蛋白可来自与由所述第一杆状病毒载体中的所述核酸分子编码的病毒衣壳蛋白的aav血清型不同的aav血清型，例如所述rep蛋白可来自aav血清型2。

在每个前述实例中，编码所述第二杆状病毒载体内的所述rep蛋白的多核苷酸序列可与用于在昆虫细胞中表达所述rep蛋白的启动子可操作地连接。在一个实例中，编码所述第二杆状病毒载体内的所述rep蛋白的多核苷酸序列与多面体启动子可操作地连接。在一个实例中，编码所述第二杆状病毒载体内的所述rep蛋白的多核苷酸序列与p10启动子可操作地连接。

在一个实例中，感染所述昆虫细胞的所述第三杆状病毒载体包含来自与由所述第一杆状病毒载体中的所述核酸分子编码的病毒衣壳蛋白相同的血清型的aavitr序列。在另一实例中，感染所述昆虫细胞的所述第三杆状病毒载体包含来自不同于由所述第一杆状病毒载体中的所述核酸分子编码的病毒衣壳蛋白的血清型的血清型的aavitr序列。在一个特定的实例中，所述aavitr序列来自aav血清型2。

在一个实例中，由所述第二杆状病毒载体的基因组编码的所述rep蛋白和由所述第三杆状病毒载体的基因组编码的所述itr序列来自aav血清型2。

所述第一、第二和第三杆状病毒中的至少一者的基因组将包含编码用于aav的装配激活蛋白(aap)的多核苷酸。在一个实例中，所述aap可由所述第一杆状病毒的基因组内包含的多核苷酸序列编码。在一个实例中，所述aap可由所述第二杆状病毒的基因组内包含的多核苷酸序列编码。在一个实例中，所述aap可由所述第三杆状病毒的基因组内包含的多核苷酸序列编码。

在一个实例中，产生所述aav的方法包括从所述培养基和/或细胞中回收所述aav。在另一实例中，产生所述aav的方法包括从所述培养基和/或细胞中回收所述aav，然后纯化所述aav。在一个实例中，从所述细胞中回收所述aav。在一个实例中，从所述培养基中回收所述aav。在一个实例中，从所述细胞和培养基中回收所述aav。

本公开还提供通过本文所述的方法产生的腺相关病毒(aav)。

还提供了包含病毒衣壳蛋白的腺相关病毒(aav)，所述病毒衣壳蛋白包含修饰的亚基1(vp1)序列，其包含位置1处的丝氨酸、位置26处的谷氨酸、位置40处的精氨酸、位置43处的天冬氨酸、位置44处的丝氨酸和位置64处的赖氨酸，其中所述氨基酸位置是相对于seqidno:1中给出的序列定义的，其中在位置1、26、40、43、44和64中的任何一处或多处的所述氨基酸相对于相应的野生型序列被修饰，且其中除了在所述任何一个或多个位置1、26、40、43、44和64处的氨基酸以外，没有另外的氨基酸相对于相应的野生型序列被修饰。

在一个实例中，在位置1、26、40、43、44和64中的任何两处或更多处的所述氨基酸相对于如本文所述的相应野生型序列被修饰。在一个实例中，在位置1、26、40、43、44和64中的任何三处或更多处的所述氨基酸相对于如本文所述的相应野生型序列被修饰。在一个实例中，在位置1、26、40、43、44和64中的任何四处或更多处的所述氨基酸相对于如本文所述的相应野生型序列被修饰。在一个实例中，在位置1、26、40、43、44和64中的任何五处或更多处的所述氨基酸相对于如本文所述的相应野生型序列被修饰。在一个实例中，在位置1、26、40、43、44和64中的每一处的所述氨基酸相对于如本文所述的相应野生型序列被修饰。

本文已经描述了包含修饰的vp1序列的病毒衣壳蛋白，并且除另有特别说明外，其任何实例应被视为在细节上作必要的修改后适用于本公开的aav。

在一个实例中，所述aav选自：

(i)aav血清型1，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:15中给出的序列；

(ii)aav血清型3，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:16中给出的序列；

(iii)aav血清型4，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:17中给出的序列；

(iv)aav血清型5，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:18中给出的序列；

(v)aav血清型6，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:19中给出的序列；

(vi)aav血清型7，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:20中给出的序列；

(vii)aav血清型8，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:21中给出的序列；

(viii)aav血清型9，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:22中给出的序列；

(ix)aav血清型10，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:23中给出的序列；

(x)aav血清型11，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:24中给出的序列；

(xi)aav血清型12，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:25中给出的序列；和

(xii)aav血清型13，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:26中给出的序列。

在一个实例中，所述aav为aav血清型1，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:15中给出的序列。

在一个实例中，所述aav为aav血清型3，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:16中给出的序列。

在一个实例中，所述aav为aav血清型4，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:17中给出的序列。

在一个实例中，所述aav为aav血清型5，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:18中给出的序列。

在一个实例中，所述aav为aav血清型6，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:19中给出的序列。

在一个实例中，所述aav为aav血清型7，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:20中给出的序列。

在一个实例中，所述aav为aav血清型8，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:21中给出的序列。

(在一个实例中，所述aav为aav血清型9，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:22中给出的序列。

在一个实例中，所述aav为aav血清型10，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:23中给出的序列。

在一个实例中，所述aav为aav血清型11，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:24中给出的序列。

在一个实例中，所述aav为aav血清型12，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:25中给出的序列。

在一个实例中，所述aav为aav血清型13，其中所述修饰的vp1序列包含seqidno:26中给出的序列。

本公开还提供提高来自在昆虫细胞中产生的不同于血清型2的血清型的腺相关病毒(aav)的功能性的方法，包括通过仅取代在位置1、26、40、43、44和64处的一个或多个氨基酸来相对于相应的野生型序列修饰所述aav的病毒衣壳蛋白内的vp1序列，其中相对于seqidno:1中给出的序列来确定残基位置，使得所述病毒衣壳蛋白包含位置1处的丝氨酸、位置26处的谷氨酸、位置40处的精氨酸、位置43处的天冬氨酸、位置44处的丝氨酸和位置64处的赖氨酸，且其中相对于未被修饰过并且在昆虫细胞中产生的相应野生型aav，所述aav的功能性提高。所述aav的功能性提高优选归因于在内化后所述aav逃离细胞的核内体室的能力提高，即核内体逃离活性提高。本文已经描述了包含修饰的vp1序列的aav病毒衣壳蛋白，并且除另有特别说明外，其任何实例应被视为在细节上作必要的修改后适用于如本文所述的其产生方法。

在一个实例中，所述方法包括相对于如本文所述的相应野生型序列修饰在位置1、26、40、43、44和64处的任何两个或更多个氨基酸。在一个实例中，所述方法包括相对于如本文所述的相应野生型序列修饰在位置1、26、40、43、44和64处的任何三个或更多个氨基酸。在一个实例中，所述方法包括相对于如本文所述的相应野生型序列修饰在位置1、26、40、43、44和64处的任何四个或更多个氨基酸。在一个实例中，所述方法包括相对于如本文所述的相应野生型序列修饰在位置1、26、40、43、44和64处的任何五个或更多个氨基酸。在一个实例中，所述方法包括相对于如本文所述的相应野生型序列修饰在位置1、26、40、43、44和64处的所述氨基酸。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得：

(i)当所述aav属于血清型1时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:15中给出的序列的vp1序列；

(ii)当所述aav属于血清型3时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:16中给出的序列的vp1序列；

(iii)当所述aav属于血清型4时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:17中给出的序列的vp1序列；

(iv)当所述aav属于血清型5时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:18中给出的序列的vp1序列；

(v)当所述aav属于血清型6时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:19中给出的序列的vp1序列；

(vi)当所述aav属于血清型7时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:20中给出的序列的vp1序列；

(vii)当所述aav属于血清型8时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:21中给出的序列的vp1序列；

(viii)当所述aav属于血清型9时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:22中给出的序列的vp1序列；

(ix)当所述aav属于血清型10时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:23中给出的序列的vp1序列；

(x)当所述aav属于血清型11时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:24中给出的序列的vp1序列；

(xi)当所述aav属于血清型12时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:25中给出的序列的vp1序列；且

(xii)当所述aav属于血清型13时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:26中给出的序列的vp1序列。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav1的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:15中给出的序列的vp1序列。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav3的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:16中给出的序列的vp1序列。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav4的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:17中给出的序列的vp1序列。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav5的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:18中给出的序列的vp1序列。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav6的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:19中给出的序列的vp1序列。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav7的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:20中给出的序列的vp1序列。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav8的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:21中给出的序列的vp1序列。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav9的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:22中给出的序列的vp1序列。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav10的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:23中给出的序列的vp1序列。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav11的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:24中给出的序列的vp1序列。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav12的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:25中给出的序列的vp1序列。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav13的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:26中给出的序列的vp1序列。

附图说明

图1是定名为bacaav8-rep-vpmod的dna构建体的载体图。此dna构建体被设计用于在昆虫细胞中表达aavrep蛋白和修饰的aav8衣壳两者。载体主链是杆状病毒载体poet1主链(oxfordexpressiontechnologies)，并且用于在昆虫细胞中制备含有修饰的aav8衣壳蛋白的aav。

图2是定名为aav8-vpmod的dna构建体的载体图。此dna构建体含有aav8衣壳基因的修饰型式，其用于制备aav8-rep-vpmod(图4)和bacaav8-rep-vpmod(图1)。

图3是定名为wtaav8-rep/cap的dna构建体的载体图。此dna构建体被设计用于在昆虫细胞中表达aavrep蛋白和wtaav8衣壳，并且用于制备含有wtaav8衣壳蛋白的aav。

图4是定名为aav8-rep-vpmod的dna构建体的载体图。此dna构建体被设计用于在昆虫细胞中表达aavrep蛋白和修饰的aav8衣壳，并且用于制备bacaav8-rep-vpmod(图1)。

图5是定名为bacaav9-rep-vpmod的dna构建体的载体图。此dna构建体被设计用于在昆虫细胞中表达aavrep蛋白和修饰的aav9衣壳。载体主链是杆状病毒载体poet1主链(oxfordexpressiontechnologies)，并且用于制备含有修饰的aav9衣壳蛋白的aav。

图6是定名为aav9-vpmod的dna构建体的载体图。此dna构建体含有aav9衣壳基因的修饰型式，其用于制备bacaav9-rep-vpmod(图5)。

图7是定名为aav9-rep-vpmod的dna构建体的载体图。此dna构建体被设计用于在昆虫细胞中表达aavrep蛋白和修饰的aav9衣壳。

图8是定名为aav2-goi的dna构建体的载体图。此dna构建体被设计用于表达由aavitr侧接的两个shmir，并且用于制备bacaav2-goi(图9)。

图9是定名为bacaav2-goi的dna构建体的载体图。此dna构建体被设计用于在杆状病毒载体poet1主链(oxfordexpressiontechnologies)中表达由aavitr(aav2-goi)侧接的两个shmir。此构建体用于制备含有表达编码两个shmir的goi的修饰的aav9衣壳蛋白的aav。

图10a-10c显示由用(i)在哺乳动物细胞中产生的具有未修饰的vp1的aav8(vecbio)，(ii)由在昆虫细胞中的杆状病毒产生的具有修饰的vp1的aav8(bacvpmod)，和(iii)由在昆虫细胞中的杆状病毒产生的具有未修饰的vp1的aav8(ben10)的4x10e9、8x10e9和1.6x10e10个aav载体基因组感染的jhu67细胞中每个细胞表达的shmir拷贝的总数。与在昆虫细胞中产生的具有野生型衣壳的aav相比，在哺乳动物细胞中产生的具有野生型衣壳的aav表达高水平的shmir，而在前者中的表达几乎检测不到。与使用未修饰的野生型衣壳在昆虫中产生的aav相比，在昆虫细胞中产生的具有含修饰的vp1的衣壳的aav显示出表达显著增加，并且因此功能性显著增加。

图11显示由表达aav内化受体(aav-r)并且用(i)在哺乳动物细胞中产生的具有未修饰的vp1的aav9和(ii)由在昆虫细胞中的杆状病毒产生的具有修饰的vp1的aav9以4x10e9、8x10e9和1.6x10e10个aav载体基因组感染的c2c12细胞表达的shmir拷贝的总数。两种重组病毒产生同等水平的shmir，表明具有同等的功能性。

序列表的说明

seqidno:1：aav血清型的修饰共有vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:2：aav血清型1的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:3：aav血清型2的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:4：aav血清型3的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:5：aav血清型4的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:6：aav血清型5的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:7：aav血清型6的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:8：aav血清型7的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:9：aav血清型8的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:10：aav血清型9的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:11：aav血清型10的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:12：aav血清型11的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:13：aav血清型12的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:14：aav血清型13的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:15：aav血清型1的修饰的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:16：aav血清型3的修饰的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:17：aav血清型4的修饰的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:18：aav血清型5的修饰的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:19：aav血清型6的修饰的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:20：aav血清型7的修饰的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:21：aav血清型8的修饰的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:22：aav血清型9的修饰的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:23：aav血清型10的修饰的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:24：aav血清型11的修饰的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:25：aav血清型12的修饰的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:26：aav血清型13的修饰的vp1子序列，包含pla2结构域和侧接序列。

seqidno:27：aav血清型1的vp1氨基酸序列。

seqidno:28：aav血清型2的vp1氨基酸序列。

seqidno:29：aav血清型3的vp1氨基酸序列。

seqidno:30：aav血清型4的vp1氨基酸序列。

seqidno:31：aav血清型5的vp1氨基酸序列。

seqidno:32：aav血清型6的vp1氨基酸序列。

seqidno:33：aav血清型7的vp1氨基酸序列。

seqidno:34：aav血清型8的vp1氨基酸序列。

seqidno:35：aav血清型9的vp1氨基酸序列。

seqidno:36：aav血清型10的vp1氨基酸序列。

seqidno:37：aav血清型11的vp1氨基酸序列。

seqidno:38：aav血清型12的vp1氨基酸序列。

seqidno:39：aav血清型13的vp1氨基酸序列。

具体实施方式

概述

在整个本说明书中，除另有特别说明或上下文另有要求外，提到单个步骤、特征、物质组成、步骤组或特征或物质组成组应被视为涵盖一个和许多(即一个或多个)这些步骤、特征、物质组成、步骤组或特征或物质组成组。

本领域技术人员将会认识到，除了具体描述的那些之外，可以对本公开进行变动和修改。要理解的是，本公开包括所有这类变动和修改。本公开还包括在本说明书中单独或共同提到或指出的所有步骤、特征、组合物及化合物以及所述步骤或特征的任意及所有组合或任意两者或更多者。

本公开的范围不受本文描述的具体实例的限制，具体实例仅旨在举例说明的目的。在功能上等同的产品、组合物及方法显然在本公开的范围内。

除另有特别说明外，本文公开的任何实例应被视为在细节上作必要的修改后适用于本公开的任何其它实例。

除另有明确定义外，本文使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域(例如，细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学)普通技术人员通常所理解的相同的含义。

除另指出外，用在本公开中的重组dna、重组蛋白质、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。这类技术在诸如以下来源的所有文献中均有描述和解释：j.perbal,apracticalguidetomolecularcloning,johnwileyandsons(1984)；j.sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress(1989)；t.a.brown(编),essentialmolecularbiology:apracticalapproach，第1和2卷,irlpress(1991)；d.m.glover和b.d.hames(编),dnacloning:apracticalapproach,第1-4卷,irlpress(1995和1996)和f.m.ausubel等人(编),currentprotocolsinmolecularbiology,greenepub.associatesandwiley-interscience(1988,包括目前为止的所有更新)；edharlow和davidlane(编)antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,(1988)和j.e.coligan等人(编)currentprotocolsinimmunology,johnwiley&sons(包括目前为止的所有更新)。

在整个本说明书中，除上下文另有要求外，词语“包含(comprise/comprises/comprising)”被理解为隐含意指包含所叙述的步骤或要素或整体或者步骤或要素或整体组，但不排除有任何其它步骤或要素或整体或者要素或整体组。

术语“和/或”例如“x和/或y”应被理解为意指“x和y”或者“x或y”，并且应被视为对两种含义或任一种含义提供明确的支持。

选择的定义

如本文所用，术语“腺相关病毒”或“aav”涉及细小病毒科家族内的一组病毒，其含有短的(大约4.7kb)单链dna基因组，并且依赖于辅助病毒如腺病毒的存在来进行其复制。本公开还考虑了来源于aav的载体，即基因转移载体。

如本文所用，如aav情况下所用的术语“血清型”是用于指aav的衣壳在血清学上不同于其它aav血清型的区别。血清学独特性的确定是基于抗体与一种aav之间相比于另一种aav缺乏交叉反应性。这种交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如，由于aav血清型的vp1、vp2和/或vp3序列差异)所致。

如本文在aav情况下所用，术语“病毒衣壳蛋白”、“衣壳蛋白”、“衣壳多肽”或类似术语涉及aav的具有自装配以产生aav颗粒的蛋白质外壳的活性的多肽，也称为外壳蛋白或vp蛋白。其由三种亚基vp1、vp2和vp3组成，它们通常由单一核酸分子表达，并且在一起相互作用形成二十面体对称的衣壳。aav的衣壳结构在bernardn.fields等人的virology，第2卷第69和70章(第4版，lippincott-ravenpublishers)中有描述。

如本文所用，术语“可操作地连接的”或“可操作的连接”(或类似的术语)是指多核苷酸元件按功能关系的连接。当核酸或多核苷酸序列被置于与另一核酸序列处于功能关系时，其是“可操作地连接的”。比如，转录调控序列例如启动子、增强子或本领域中公知的其它表达控制元件如果影响编码序列的转录，则其与该编码序列将是可操作地连接的。

如本文所用，术语“启动子”通常是指参与dna依赖性rna聚合酶及其它蛋白质(反式作用转录因子)的识别和结合以启动和控制一个或多个编码序列的转录的dna序列，并且通常相对于转录的方向位于编码序列的上游。

如本文所用，复数或单数形式的术语“反向末端重复序列”或“itr”是指位于载体的一端的序列，其与位于所述载体的相反端的互补序列组合使用时可形成发夹结构。反向末端重复序列对参与aavdna的拯救、宿主基因组中的复制和包装。aavdna的有效衣壳化和完全装配的aav颗粒的产生也需要itr。

如在本公开的包含修饰的衣壳蛋白或vp1序列的aav情况下使用的术语“功能性提高”或类似的术语应被理解为意指包含修饰的衣壳蛋白或vp1序列的aav相对于未经修饰且在昆虫细胞中产生的相同血清型的野生型aav具有提高的核内体逃离活性。如本文所用，术语“核内体逃离活性(endosomalescapeactivity，endosomeescapeactivity)”或类似术语应被理解为表示在细胞内化后aav从核内体室逃离的能力。在aav功能性的情况下将要理解的是，在细胞内化后不能从核内体逃离的aav不是功能性的，特别是在基因治疗的情况下。

用于产生修饰的aav的dna构建体

本公开通常涉及具有修饰的病毒衣壳蛋白、特别是包含修饰的vp1序列和相关的磷脂酶a2(pla2)结构域的aav，当在昆虫细胞中产生时，其(相对于相应的野生型aav)具有提高或恢复的功能性。本公开还涉及这类修饰的aav的产生及其作为用于在诸如基因治疗的情况下在哺乳动物细胞中引入和/或表达外源核酸的载体的用途。

aav通常感染人(例如，血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)或灵长类动物(例如，血清型1和4)。所有已知的aav血清型的基因组结构都非常相似。aav的基因组是线型的单链dna分子，其长度通常小于约5,000个核苷酸(nt)。反向末端重复序列(itr)侧接用于非结构复制(rep)蛋白和结构(vp)蛋白的独特编码核苷酸序列。vp蛋白(vp1、vp2和vp3)形成衣壳。aav衣壳装配需要表达装配激活蛋白(aap)，其由位于vp2和vp3orf的编码序列内的衣壳基因的框内开放阅读框架编码(sonntag等人，(2010)pnas,107(22):10220-10225)。末端145nt是自互补的，并且被组织成使得形成t形发夹的能量上稳定的分子内双链体可以被形成，即反向末端重复序列(itr)。这些发夹结构充当病毒dna复制的起点，用作细胞dna聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中感染野生型aav(wtaav)后，rep基因(即rep78和rep52)分别由p5启动子和p19启动子表达。rep78蛋白具有复制病毒基因组的功能，而rep52蛋白将新生基因组动员到病毒颗粒中。reporf中的剪接事件导致四种rep蛋白(即rep78、rep68、rep52和rep40)的表达。然而，已经显示在哺乳动物细胞中编码rep78和rep52蛋白的未剪接的mrna足以用于aav载体产生。而且在昆虫细胞中，rep78和rep52蛋白足以用于aav载体产生。三种衣壳蛋白vp1、vp2和vp3由来自p40启动子的单一vp阅读框架表达。

对aav((特别是在昆虫细胞中产生的那些)的功能性特别重要的是vp1亚基，其含有保守的磷脂酶a2(pla2)基序，已显示该基序的活性是在病毒基因组转移到宿主细胞核中之后核内体离开所需的。虽然已显示血清型2的aav当在昆虫细胞中表达时保留pla2活性并因此保留其功能性，但其它血清型的aav具有有缺陷的pla2活性，尽管此结构域在细小病毒科当中一般都是保守的。这种有缺陷的pla2活性已经限制了在昆虫细胞中产生除血清型2以外的功能性aav的能力。已经采取了多种方法来解决这一问题，效果各不相同，包括构建嵌合aav2/5vp1蛋白，其中aavvp1序列或其含有pla2基序的n-末端部分被aav2vp1的相应序列置换(结构域交换)。还报道了基于aav2vp1的镶嵌体的产生，导致aav表达野生型和血清型2vp1序列两者。虽然已报道当在昆虫细胞中表达时这些方法在不同程度上提高了功能性，但杆状病毒系统在昆虫细胞中产生用于临床环境的aav载体仍受限制。在本公开中描述了涉及对aavvp1序列进行位点特异性修饰的新方法，当在昆虫细胞中由杆状病毒系统表达时，该方法已显示出提高后续来自除aav2以外的血清型的aav的功能性。功能性提高是由病毒粒子逃离核内体室的能力赋予的。

因此，本公开提供了包含编码腺相关病毒(aav)病毒衣壳蛋白的多核苷酸序列的核酸分子，其中所述病毒衣壳蛋白包含修饰的亚基1(vp1)序列，所述序列包含位置1处的丝氨酸、位置26处的谷氨酸、位置40处的精氨酸、位置43处的天冬氨酸、位置44处的丝氨酸和位置64处的赖氨酸，其中所述氨基酸位置是相对于seqidno:1中给出的序列定义的，其中在位置1、26、40、43、44和64中的任何一处或多处的所述氨基酸相对于相应的野生型序列被修饰，且其中除了在所述任何一个或多个位置1、26、40、43、44和64处的氨基酸以外，没有另外的氨基酸相对于相应的野生型序列被修饰。

在一个实例中，在seqidno:1中给出的序列的位置1、26、40、43、44和64中的任何两个、三个、四个、五个或六个位置处的所述氨基酸相对于如本文所述的相应野生型序列被修饰。

编码aav衣壳蛋白的多核苷酸序列可来自除血清型2以外的(例如，血清型1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)通常感染人的任何一种aav。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型1。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型3。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型4。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型5。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型6。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型7。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型8。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型9。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型10。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型11。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型12。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav血清型13。

编码aav衣壳蛋白的多核苷酸序列可编码包含seqidno:15-26的任一者中给出的序列的修饰的vp1。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav1，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:15中给出的序列。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav3，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:16中给出的序列。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav4，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:17中给出的序列。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav5，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:18中给出的序列。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav6，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:19中给出的序列。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav7，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:20中给出的序列。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav8，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:21中给出的序列。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav9，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:22中给出的序列。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav10，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:23中给出的序列。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav11，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:24中给出的序列。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav12，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:25中给出的序列。在一个实例中，所述病毒衣壳蛋白来自aav13，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:26中给出的序列。

在每个前述实例中，所述病毒衣壳蛋白可包含来自与所述修饰的vp1相同的aav血清型的亚基2(vp2)和亚基3(vp3)序列。优选所述vp1、vp1和vp3由相同的orf表达。

编码如本文所述的aav病毒衣壳蛋白的核苷酸序列可与适合在昆虫细胞中表达衣壳蛋白的启动子可操作地连接。用于在昆虫细胞中表达的合适启动子是本领域中已知的，并且可预期在本文中使用。在这方面，先前已经在例如以下文献中描述了用于分子工程和在昆虫细胞中表达多肽的方法：summers和smith,amanualofmethodsforbaculovirusvectorsandinsectcultureprocedures,texasagriculturalexperimentalstationbull.no.7555,collegestation,tex.(1986)；luckow.,inprokop等人，cloningandexpressionofheterologousgenesininsectcellswithbaculovirusvectors'recombinantdnatechnologyandapplications,97-152(1991)；king,l.a和r.d.possee,thebaculovirusexpressionsystem,chapmanandhall,unitedkingdom(1992)；o'reilly,d.r.,l.k.miller,v.aluckow,baculovirusexpressionvectors:alaboratorymanual,newyork(1992)；w.h.freeman和richardson,c.d.,baculovirusexpressionprotocols,methodsinmolecularbiology，第39卷(1992)；美国专利第4,745,051号；us2003148506；wo2003/074714；kotinrm(2011)hum.mol.genet.,20(r1):r2-r6；aucoin等人，(2006)biotechnol.bioeng.95(6):1081-1092；和vanoers等人，(2015)j.gen.virol.96:6-23。本领域中已知的启动子及其它这类调控元件显然可以被预期用于本公开的核酸。在一个特定的实例中，所述启动子是多面体启动子或p10启动子。

如本文所述，aav衣壳装配需要表达非结构蛋白质，即装配激活蛋白(aap)。因此，在每个前述实例中，如本文所述的核酸分子可包含编码aap的多核苷酸。

如本文所述，aav基因组包含rep基因(即rep78和rep52)，由其编码的蛋白质在病毒基因组的复制中起作用。reporf中的剪接事件导致四种rep蛋白(即rep78、rep68、rep52和rep40)的表达。然而，已经显示在昆虫细胞中编码rep78和rep52蛋白的未剪接的mrna足以用于aav载体产生。因此，在一个实例中，本公开的核酸分子还包含编码至少一种选自rep78和rep68的大aav复制rep蛋白和至少一种选自rep52和rep40的小aavrep蛋白的多核苷酸序列。在一个实例中，本文所述的核酸分子包含编码rep78和rep52的多核苷酸序列。在一个实例中，本文所述的核酸分子包含编码rep78和rep40的多核苷酸序列。在一个实例中，本文所述的核酸分子包含编码来自与所述病毒衣壳蛋白相同的aav血清型的rep68和rep52的多核苷酸序列。在一个实例中，本文所述的核酸分子包含编码rep68和rep40的多核苷酸序列。在一个实例中，本文所述的核酸分子包含编码rep78、rep68、rep52和rep40的多核苷酸序列。在每个前述实例中，相应的小和大rep蛋白可来自与所述病毒衣壳蛋白相同的aav血清型。可选地，相应的小和大rep蛋白可来自不同于所述病毒衣壳蛋白的aav血清型的aav血清型，例如所述rep蛋白可来自aav血清型2。

编码rep蛋白的多核苷酸序列可与适合在昆虫细胞中表达rep蛋白的启动子可操作地连接。用于在昆虫细胞中表达的合适启动子是本领域中已知的，并且可预期在本文中使用。在一个特定的实例中，所述启动子可以是多面体启动子或p10启动子。编码相应的rep蛋白的核苷酸序列可与相同的启动子可操作地连接。可选地，编码rep蛋白的每个序列可与其自身的启动子可操作地连接。

可经由电脑模拟设计编码所述修饰的vp1序列的核酸，例如基于野生型aav序列或来源于野生型aav序列的天然存在的变体aav序列，并且可采用本领域中已知的方法来合成包含所述核酸序列的dna构建体。可选地或者另外地，可通过应用诸如在例如sambrook和russell(2001)“molecularcloning:alaboratorymanual(第3版)”，coldspringharborlaboratory,coldspringharborlaboratorypress,newyork中所述的熟知的遗传工程技术来实现相对于如本文所述的相应野生型vp1序列(或来源于那些野生型aav序列的天然存在的变体aav序列)对所述vp1序列进行修饰。对vp编码序列的各种进一步的修饰是本领域技术人员已知的，其可增加vp和病毒粒子的产量，或者具有其它所需效果，如嗜性改变或降低病毒粒子的抗原性。这些修饰在本公开的范围内。

可用于本公开的aav序列(例如用于如本文所述在昆虫细胞中产生具有修饰的vp1序列的aav)可来源于任何aav血清型的基因组。一般地，aav血清型具有在氨基酸及核酸水平上有显著同源性的基因组序列，提供相同的一组遗传功能，产生在物理上和功能性上相似的病毒粒子，并且通过实际上相同的机制进行复制和装配(具体不包括本文所述的pla2结构域的活性)。用于在设计和产生本公开的修饰的aav中使用的aav的合适的核酸和蛋白质序列是可公开获得的。在chen等人，(2013)j.vir.87(11):6391-6405中描述了已知感染人(并且在本文中可预期)的野生型aav的vp1序列。人或猿腺相关病毒(aav)血清型是在本公开的情况下使用的aav核苷酸序列的优选来源，并且更优选通常感染人的aav血清型(例如，血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13)。aav血清型1-13的衣壳多肽序列是本领域中已知的，例如aav1(基因库登录号：aad27757.1，gi:4689097)、aav2(基因库登录号：aac03780.1，gp.2906023)、aav3(基因库登录号：aac55049.1，gi:1408469)、aav4(基因库登录号：aac58045.1，gl2337940)、aav5(基因库登录号：aad13756.1，gi-4249658)、aav10(基因库登录号：aat46337.1，gl48728343)、aav11(基因库登录号：aat46339.1，gi:48728346)、aav12(基因库登录号：αβi16639.1，gi:112379656)或aav13(基因库登录号：abz10812.1、gi:167047087)。血清型1-13的aav衣壳蛋白的多肽序列也在本文的seqidno:27-39中给出。此外，来自血清型1-13的aav的完整基因组是本领域中已知的，例如aav1(ncbi参考序列nc_002077.1)、aav2(基因库登录号：j01901.1)、aav3(基因库登录号：af028705.1)、aav4(ncbi参考序列：nc_001829.1)、aav5(ncbi参考序列：nc_006152.1)、aav6(基因库：af028704.1)、aav7(ncbi参考序列：nc_006260.1)、aav8(ncbi参考序列：nc_006261.1)、aav9(基因库登录号：ay530579.1)、aav10(基因库登录号：ay631965.1)、aav11(基因库登录号：ay631966.1)或aav12(基因库登录号：dq813647.1)，

本公开还提供包含由本公开的核酸编码的修饰的vp1序列的aav衣壳蛋白。

用于产生修饰的aav的杆状病毒载体

本公开还提供在昆虫细胞相容性载体即杆状病毒载体中的本公开的核酸分子。特别地，本公开提供杆状病毒载体，其包含编码具有如本文所述的修饰的vp1序列的aav病毒衣壳蛋白的核酸分子。

本公开还提供多种杆状病毒载体，其包含：

(i)第一杆状病毒载体，其包含编码具有如本文所述的修饰的vp1序列的aav病毒衣壳蛋白的核酸分子；和

(ii)第二杆状病毒载体，其包含编码由aav反向末端重复(itr)序列侧接的目的蛋白质或rna的多核苷酸。

在一个实例中，所述aavitr序列来自与由所述第一杆状病毒载体内的核酸分子编码的病毒衣壳蛋白相同的血清型。在另一实例中，所述aavitr序列来自另一种aav血清型，例如aav2。

通常，编码目的蛋白质或rna(包括侧接itr)的多核苷酸的长度为5,000个核苷酸(nt)或更短。然而，也可预期编码超大dna的多核苷酸，即长度超过5,000nt。超大dna在本文中被理解为超过5kbp的最大aav包装限制的dna。因此，能够产生通常由大于5.0kb的基因组编码的重组蛋白质或rna的aav载体的产生也是可能的。

编码用于在哺乳动物细胞中表达的目的蛋白质或rna的多核苷酸将位于杆状病毒载体内，使得其将被复制并结合到在昆虫细胞中复制的aav基因组中。可结合任意核苷酸序列以便后来在用根据本公开产生的aav转染的哺乳动物细胞中表达，只要构建体保持在aav病毒粒子的包装能力以内即可。所述多核苷酸序列可例如编码目的蛋白质，或者其可表达rnai剂，即能够发生rna干扰的rna分子，举例如shrna(短发夹rna)或短发夹微rna(shmir)。在一个实例中，编码目的蛋白质或rna的多核苷酸编码多种目的蛋白质、多种rnai剂或者一种或多种目的蛋白质和一种或多种rnai剂。用于在哺乳动物细胞中表达的目的蛋白质可以是治疗性基因产物。治疗性基因产物可以是多肽或rna分子(如本文所述的shrna或shmir)，或者是当在靶细胞中表达时提供所需治疗效果的其它基因产物，所述治疗效果举例如消除非所需活性，例如消除感染细胞，或者弥补遗传缺陷，例如导致酶活性不足。可选地或者另外地，由所述多核苷酸编码的目的蛋白质可用作评估细胞转化和表达的标记蛋白。用于此目的的合适标记蛋白有例如荧光蛋白gfp或萤火虫荧光素酶。sambrook和russel(2001)“molecularcloning:alaboratorymanual(第3版)”coldspringharborlaboratory,coldspringharborlaboratorypress,newyork中提供了用于获得这些标记基因的来源及其使用方法。

根据其中所述第一杆状病毒载体不编码aavrep蛋白的实例，所述多种杆状病毒载体进一步包含：

(iii)第三杆状病毒载体，其包含编码至少一种选自rep78和rep68的大aavrep蛋白和至少一种选自rep52和rep40的小aavrep蛋白的多核苷酸序列。

例如，所述第三杆状病毒载体可包含编码rep78和rep52的多核苷酸序列。例如，所述第三杆状病毒载体可包含编码rep78和rep40的多核苷酸序列。例如，所述第三杆状病毒载体可包含编码rep68和rep52的多核苷酸序列。例如，所述第三杆状病毒载体可包含编码rep68和rep40的多核苷酸序列。例如，所述第三杆状病毒载体可包含编码rep78、rep68、rep52和rep40的多核苷酸序列。在描述所述第三杆状病毒载体的每个前述实例中，相应的小和大rep蛋白可来自与由所述第一杆状病毒载体编码的病毒衣壳蛋白相同的aav血清型。可选地，相应的小和大rep蛋白可来自不同于由所述第一杆状病毒载体编码的病毒衣壳蛋白的aav血清型的aav血清型，例如所述rep蛋白可来自aav血清型2。在这方面，rep序列在大多数血清型当中是特别保守的，并且已报道rep序列在昆虫细胞中有效地交叉互补。

在描述多种杆状病毒载体的每个前述实例中，编码所述第三杆状病毒载体内的所述rep蛋白的多核苷酸序列可与用于在昆虫细胞中表达所述rep蛋白的启动子可操作地连接。已经描述了用于在昆虫细胞中表达蛋白质的合适的启动子，并且除另有特别说明外应被视为在细节上作必要的修改后适用于本公开的描述杆状病毒载体的实例。

多种杆状病毒载体中的至少一种将包含编码aav衣壳装配所需的装配激活蛋白(aap)的多核苷酸。在一个实例中，编码所述衣壳蛋白的杆状病毒载体包含编码aap的多核苷酸。在可选的实例中，编码所述rep蛋白的杆状病毒和/或编码所述目的蛋白质或rna的杆状病毒包含编码aap的多核苷酸。

杆状病毒载体及其产生和使用方法是本领域中已知的，并且在上面关于昆虫细胞的分子工程引用的参考文献中有描述。

昆虫细胞

本文还提供了一种昆虫细胞，其包含本公开的编码具有如本文所述的修饰的vp1序列的aav病毒衣壳蛋白的核酸分子。

所述昆虫细胞还将优选包含(i)编码至少一种选自rep78和rep68的大aavrep蛋白和至少一种选自rep52和rep40的小aavrep蛋白的多核苷酸序列，和(ii)编码由aavitr序列侧接的目的蛋白质或rna的多核苷酸。本文例如已在本公开的杆状病毒载体的情况下描述了大和小rep蛋白的特定组合以及合适的itr，并且除另有特别说明外应被视为在细节上作必要的修改后适用于本公开的描述昆虫细胞的实例。同样，本文例如已在本公开的杆状病毒载体的情况下描述了编码用于结合到由昆虫细胞产生的aav的基因组中的目的蛋白质或rna的多核苷酸，并且除另有特别说明外应被视为在细节上作必要的修改后适用于本公开的描述昆虫细胞的实例。

优选地，将(i)本公开的编码具有如本文所述的修饰的vp1序列的aav病毒衣壳蛋白的核酸分子，(ii)编码rep蛋白的多核苷酸，和(iii)编码由aavitr序列侧接的目的蛋白质或rna的多核苷酸中的每一者引入到杆状病毒载体中，并且用于感染昆虫细胞。优选地，(i)至(iii)中的至少一者还将包含编码用于aav衣壳装配的装配激活蛋白(aap)的多核苷酸。因此，本文所述的昆虫细胞应包含实现有感染性且稳定的aav病毒粒子的表达和装配所必需的组分。在一个实例中，所述昆虫细胞可包含附加体复制的重组杆状病毒。

本公开还提供包含如本文所述的能够产生有感染性且稳定的aav病毒粒子的杆状病毒载体或多种杆状病毒载体的昆虫细胞。在一个实例中，所述昆虫细胞已经用如本文所述的杆状病毒载体或多种杆状病毒载体转化或转染。根据其中已经用本公开的杆状病毒载体或多种杆状病毒载体转化或转染昆虫细胞的实例，将由附加体复制的重组杆状病毒基因组表达(i)本公开的编码具有如本文所述的修饰的vp1序列的aav病毒衣壳蛋白的核酸分子，(ii)编码rep蛋白的多核苷酸，和(iii)编码由aavitr序列侧接的目的蛋白质或rna的多核苷酸中的每一者。

根据本公开可使用允许杆状病毒复制并且可在培养物中保持的任何昆虫细胞。例如，所用的细胞系可来自草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)、果蝇细胞系或蚊虫细胞系，例如白纹伊蚊(aedesalbopictus)来源的细胞系。优选的昆虫细胞或细胞系是来自对杆状病毒感染敏感的昆虫物种的细胞，包括例如果蝇施耐德2(s2)细胞、se301、seizd2109、seucrl、sf9、sf900+、sf21、bti-tn-5bl-4、mg-i、5tn368、hzaml、ha2302和hz2e5。

产生修饰的aav的方法

本公开还提供产生包含具有修饰的vp1序列的衣壳蛋白的aav的方法，其中编码如本文所述的修饰的vp1序列的核酸在昆虫细胞内表达，并且aav在其中装配。在一个实例中，本公开提供在昆虫细胞中产生aav的方法，包括：

(i)在培养基中在足以使细胞产生aav的条件下培养如本文所述的昆虫细胞；并任选地

(ii)从所述培养基和/或细胞中回收所述aav。

在另一实例中，本公开提供在昆虫细胞中产生aav的方法，包括：

(i)用以下对昆虫细胞进行共感染：第一杆状病毒载体，其基因组包含本公开的编码具有本文所述的修饰的vp1序列的aav病毒衣壳蛋白的核酸分子，并且包含编码至少一种选自rep78和rep68的大aav复制(rep)蛋白和至少一种选自rep52和rep40的小aavrep蛋白的多核苷酸序列；和第二杆状病毒载体，其基因组包含编码由如本文所述的aav反向末端重复(itr)序列侧接的目的蛋白质或rna的多核苷酸；

(ii)在培养基中在足以使细胞产生aav的条件下培养在(i)中用所述杆状病毒载体感染的所述昆虫细胞；并任选地

(iii)从所述培养基和/或细胞中回收所述aav。

在另一实例中，本公开提供在昆虫细胞中产生aav的方法，包括：

(i)用以下对昆虫细胞进行共感染：第一杆状病毒载体，其基因组包含本公开的编码具有如本文所述的修饰的vp1序列的aav病毒衣壳蛋白的核酸分子；第二杆状病毒载体，其基因组包含编码至少一种选自rep78和rep68的大aav复制(rep)蛋白和至少一种选自rep52和rep40的小aavrep蛋白的多核苷酸序列；和第三杆状病毒载体，其基因组包含编码由aavitr序列侧接的目的蛋白质或rna的多核苷酸；

(ii)在培养基中在足以使细胞产生aav的条件下培养在(i)中用所述杆状病毒载体感染的所述昆虫细胞；并任选地

(iii)从所述培养基或细胞中回收所述aav。

在每个前述实例中，所述rep蛋白可来自与所述病毒衣壳蛋白相同的aav血清型。可选地，所述rep蛋白可来自与所述病毒衣壳蛋白的aav血清型不同的aav血清型，例如，所述rep蛋白可来自aav血清型2。

类似地，在每个前述实例中，所述itr序列可来自与所述病毒衣壳蛋白相同的aav血清型。可选地，所述itr序列可来自与所述病毒衣壳蛋白的aav血清型不同的aav血清型，例如，itr序列可来自aav血清型2。

多种杆状病毒载体中的至少一种还将包含编码用于aav衣壳装配的装配激活蛋白(aap)的多核苷酸。在一个实例中，编码所述衣壳蛋白的杆状病毒载体包含编码aap的多核苷酸。在可选的实例中，编码所述rep蛋白的杆状病毒和/或编码所述目的蛋白质或rna的杆状病毒包含编码aap的多核苷酸。

根据其中所述方法包括用本文所述的杆状病毒载体感染昆虫细胞的实例，可采用在本领域中已知的任何常规方法。用于在昆虫细胞中产生病毒如aav的合适培养基及条件是本领域中已知的，并且是本文中可预期的。例如，在例如以下文献中描述了用于分子工程和在昆虫细胞中表达aav和多肽的方法：summers和smith,amanualofmethodsforbaculovirusvectorsandinsectcultureprocedures,texasagriculturalexperimentalstationbull.no.7555,collegestation,tex.(1986)；luckow.,inprokop等人，cloningandexpressionofheterologousgenesininsectcellswithbaculovirusvectors'recombinantdnatechnologyandapplications,97-152(1991)；king,l.a和r.d.possee,thebaculovirusexpressionsystem,chapmanandhall,unitedkingdom(1992)；o'reilly,d.r.,l.k.miller,v.aluckow,baculovirusexpressionvectors:alaboratorymanual,newyork(1992)；w.h.freeman和richardson,c.d.,baculovirusexpressionprotocols,methodsinmolecularbiology,第39卷(1992)；美国专利第4,745,051号；us2003148506；wo2003/074714；kotinrm(2011)hum.mol.genet.,20(r1):r2-r6；aucoin等人，(2006)biotechnol.bioeng.95(6):1081-1092；和vanoers等人，(2015)j.gen.virol.96:6-23。

本文例如已在本公开的杆状病毒载体的情况下描述了合适的大和小rep蛋白、itr序列和目的蛋白质或rna，并且除另有特别说明外应被视为在细节上作必要的修改后适用于本公开的描述产生aav的方法的实例。在一个实例中，本文所述的方法包括用本公开的多种杆状病毒载体共转染所述昆虫细胞。

在描述产生aav的方法的每个前述实例中，编码所述杆状病毒载体内的所述rep蛋白的多核苷酸序列可与用于在昆虫细胞中表达所述rep蛋白的启动子(及任选其它调控元件)可操作地连接。同样，编码由aavitr序列侧接的目的蛋白质或rna的多核苷酸序列可与用于在昆虫细胞中表达的启动子(及任选其它调控元件)可操作地连接。用于在昆虫细胞中表达的合适启动子是本领域中已知的，且已在本文中进行了描述，并且除另有特别说明外应被视为在细节上作必要的修改后适用于本公开的描述产生aav的方法的实例。在一个实例中，所述启动子是多面体启动子或p10启动子。

在一个实例中，产生所述aav的方法包括从所述培养基和/或细胞中回收所述aav的步骤。在另一实例中，产生所述aav的方法包括从所述培养基和/或细胞中回收所述aav并然后纯化所述aav的步骤。在一个实例中，从所述细胞中回收所述aav。在一个实例中，从所述培养基中回收所述aav。在一个实例中，从所述细胞和培养基中回收所述aav。从培养基和/或细胞中回收和纯化aav的合适方法是本领域中已知的，并且可预期在本文中采用。例如，所述方法可包括基于碘克沙醇的密度梯度纯化，接着进行氯化铯(cscl)梯度离心。例如，所述方法可包括使用抗aav抗体(优选固定化抗体)对aav进行亲和纯化。抗aav抗体可以是单克隆抗体。特别合适的抗体是单链骆驼科抗体或其片段，例如可得自骆驼或美洲驼(参见例如muyldermans等人，(2001)biotechnol.74:277-302)。用于aav的亲和纯化的抗体优选特异性结合aav衣壳蛋白上的表位，如存在于一种以上aav血清型的衣壳蛋白上的表位(以便能够从不同的血清型中纯化aav)。

先前已经描述了重组aav的构建和纯化。参见例如美国专利第5,173,414、5,139,941、5,863,541和5,869,305、6,057,152、6,376,237号；rabinowitz等人，(2002)j.virol.76:791-801；和bowles等人，(2003)j.virol.77:423-432。已经描述的这类方法可预期在本文中使用。

本公开还提供通过本文所述的方法产生的包含具有修饰的vp1序列的病毒衣壳蛋白的aav。

本公开还提供提高来自不同于在昆虫细胞中产生的血清型2的血清型的aav的功能性的方法，所述方法包括通过如下方式相对于相应的野生型序列修饰aav病毒衣壳蛋白的vp1序列，即取代在位置1、26、40、43、44和64处的一个或多个氨基酸，使得所述病毒衣壳蛋白包含位置1处的丝氨酸、位置26处的谷氨酸、位置40处的精氨酸、位置43处的天冬氨酸、位置44处的丝氨酸和/或位置64处的赖氨酸中的一者或多者，其中所述残基位置是相对于seqidno:1中给出的序列确定的，其中除了在位置1、26、40、43、44和/或64处的氨基酸以外，没有另外的氨基酸相对于相应的野生型序列被修饰，且其中所述aav当在昆虫细胞中产生时相对于当在昆虫细胞中产生时未被修饰过的相应野生型aav具有提高的功能性。所述aav的功能性提高将归因于在细胞内化后所述aav逃离核内体室的能力。本文已经描述了包含修饰的vp1序列的aav病毒衣壳蛋白，并且除另有特别说明外，其任何实例应被视为在细节上作必要的修改后适用于如本文所述的提高aav的功能性的方法。

在一个实例中，提高aav的功能性的方法包括相对于如本文所述的相应野生型序列修饰在所述vp1序列的位置1、26、40、43、44和64处的任何两个或更多个所述氨基酸，使得所述病毒衣壳蛋白包含位置1处的丝氨酸、位置26处的谷氨酸、位置40处的精氨酸、位置43处的天冬氨酸、位置44处的丝氨酸和/或位置64处的赖氨酸中的两者或更多者，其中所述残基位置是相对于seqidno:1中给出的序列确定的。在一个实例中，提高所述aav的功能性的方法包括相对于如本文所述的相应野生型序列修饰在所述vp1序列的位置1、26、40、43、44和64处的任何三个或更多个所述氨基酸，使得所述病毒衣壳蛋白包含位置1处的丝氨酸、位置26处的谷氨酸、位置40处的精氨酸、位置43处的天冬氨酸、位置44处的丝氨酸和/或位置64处的赖氨酸中的三者或更多者，其中所述残基位置是相对于seqidno:1中给出的序列确定的。在一个实例中，提高所述aav的功能性的方法包括相对于如本文所述的相应野生型序列修饰在所述vp1序列的位置1、26、40、43、44和64处的任何四个或更多个所述氨基酸，使得所述病毒衣壳蛋白包含位置1处的丝氨酸、位置26处的谷氨酸、位置40处的精氨酸、位置43处的天冬氨酸、位置44处的丝氨酸和/或位置64处的赖氨酸中的四者或更多者，其中所述残基位置是相对于seqidno:1中给出的序列确定的。在一个实例中，提高所述aav的功能性的方法包括相对于如本文所述的相应野生型序列修饰在所述vp1序列的位置1、26、40、43、44和64处的任何五个或更多个所述氨基酸，使得所述病毒衣壳蛋白包含位置1处的丝氨酸、位置26处的谷氨酸、位置40处的精氨酸、位置43处的天冬氨酸、位置44处的丝氨酸和/或位置64处的赖氨酸中的五者或更多者，其中所述残基位置是相对于seqidno:1中给出的序列确定的。在一个实例中，提高所述aav的功能性的方法包括相对于如本文所述的相应野生型序列修饰在所述vp1序列的位置1、26、40、43、44和64处的每个所述氨基酸，使得所述病毒衣壳蛋白包含位置1处的丝氨酸、位置26处的谷氨酸、位置40处的精氨酸、位置43处的天冬氨酸、位置44处的丝氨酸和位置64处的赖氨酸，其中所述残基位置是相对于seqidno:1中给出的序列确定的。

本公开的方法可提供具有病毒衣壳蛋白的aav，所述病毒衣壳蛋白具有包含seqidno:15-26的任一者中给出的序列的vp1序列。所述aav可来自通常感染人的任何血清型(例如，血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得：

(i)当所述aav属于血清型1时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:15中给出的序列的vp1序列；

(ii)当所述aav属于血清型3时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:16中给出的序列的vp1序列；

(iii)当所述aav属于血清型4时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:17中给出的序列的vp1序列；

(iv)当所述aav属于血清型5时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:18中给出的序列的vp1序列；

(v)当所述aav属于血清型6时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:19中给出的序列的vp1序列；

(vi)当所述aav属于血清型7时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:20中给出的序列的vp1序列；

(vii)当所述aav属于血清型8时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:21中给出的序列的vp1序列；

(viii)当所述aav属于血清型9时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:22中给出的序列的vp1序列；

(ix)当所述aav属于血清型10时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:23中给出的序列的vp1序列；

(x)当所述aav属于血清型11时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:24中给出的序列的vp1序列；

(xi)当所述aav属于血清型12时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:25中给出的序列的vp1序列；且

(xii)当所述aav属于血清型13时，所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:26中给出的序列的vp1序列。

在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav1的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:15中给出的序列的vp1序列。在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav3的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:16中给出的序列的vp1序列。在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav4的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:17中给出的序列的vp1序列。在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav5的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:18中给出的序列的vp1序列。在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav6的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:19中给出的序列的vp1序列。在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav7的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:20中给出的序列的vp1序列。在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav8的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:21中给出的序列的vp1序列。在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav9的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:22中给出的序列的vp1序列。在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav10的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:23中给出的序列的vp1序列。在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav11的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:24中给出的序列的vp1序列。在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav12的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:25中给出的序列的vp1序列。在一个实例中，所述方法包括相对于相应的野生型序列修饰aav13的病毒衣壳蛋白的vp1序列，使得所述病毒衣壳蛋白包含含seqidno:26中给出的序列的vp1序列。

如本文所述提高aav的功能性的方法可进一步包括相对于相应的野生型aav分析修饰的aav的功能性。也就是说，所述方法可进一步包括用如本文所述和/或通过本文所述的方法产生的修饰的或野生型aav感染哺乳动物细胞，并且确定功能性水平。例如，可通过测定在用所述aav感染后目的蛋白质或rna在所述哺乳动物细胞中的表达水平来确定所述aav的功能性。用于确定病毒粒子的功能性的功能性测定法是本领域中已知的，并且可预期在本文中采用，举例如在girod等人，(2002)j.gen.virol.,83:973-978；lock等人，(2010)hum.genether.21(10):1273-1285中所述。用于测定病毒感染性和/或功能性的合适的测定法包括但不限于：(1)通过a20酶联免疫吸附测定法测定衣壳滴度；(2)通过定量聚合酶链反应(qpcr)测定载体基因组滴度；和(3)通过用qpcr读数的中值组织培养感染剂量(tcid50)及(4)通过用报告基因(例如，绿色荧光蛋白[gfp])测定转导确定感染滴度。

如本文所述提高aav的功能性的方法可包括提供编码如本文所述的修饰的aavvp1序列的核酸或包含如本文所述的该核酸的杆状病毒载体。可选地或者另外地，如本文所述提高aav的功能性的方法可包括产生包含具有如本文所述的修饰的vp1序列的衣壳蛋白的aav。

具有修饰的vp1的aav

本公开还提供包含具有修饰的vp1序列的病毒衣壳蛋白的aav，所述修饰的vp1序列包含位置1处的丝氨酸、位置26处的谷氨酸、位置40处的精氨酸、位置43处的天冬氨酸、位置44处的丝氨酸和位置64处的赖氨酸，其中所述氨基酸位置是相对于seqidno:1中给出的序列定义的，其中在位置1、26、40、43、44和64中的任何一处或多处的所述氨基酸相对于相应的野生型序列被修饰，且其中除了在所述任何一个或多个位置1、26、40、43、44和64处的氨基酸以外，没有另外的氨基酸相对于相应的野生型序列被修饰。

在一个实例中，本文所述的aav包含具有修饰的vp1序列的病毒衣壳蛋白，其中在seqidno:1中给出的序列的位置1、26、40、43、44和64中的任意两个、三个、四个、五个或六个位置处的所述氨基酸相对于如本文所述的相应野生型序列被修饰。

在一个实例中，本文所述的aav包含具有修饰的vp1序列的病毒衣壳蛋白，其中在seqidno:1中给出的序列的位置1、26、40、43、44和64中的任意两个或更多个位置处的所述氨基酸相对于如本文所述的相应野生型序列被修饰。

在一个实例中，本文所述的aav包含具有修饰的vp1序列的病毒衣壳蛋白，其中在seqidno:1中给出的序列的位置1、26、40、43、44和64中的任意三个或更多个位置处的所述氨基酸相对于如本文所述的相应野生型序列被修饰。

在一个实例中，本文所述的aav包含具有修饰的vp1序列的病毒衣壳蛋白，其中在seqidno:1中给出的序列的位置1、26、40、43、44和64中的任意四个或更多个位置处的所述氨基酸相对于如本文所述的相应野生型序列被修饰。

在一个实例中，本文所述的aav包含具有修饰的vp1序列的病毒衣壳蛋白，其中在seqidno:1中给出的序列的位置1、26、40、43、44和64中的任意五个或更多个位置处的所述氨基酸相对于如本文所述的相应野生型序列被修饰。

在一个实例中，本文所述的aav包含具有修饰的vp1序列的病毒衣壳蛋白，其中在seqidno:1中给出的序列的位置1、26、40、43、44和64中的每一位置处的所述氨基酸相对于如本文所述的相应野生型序列被修饰。

本文已经描述了包含修饰的vp1序列的病毒衣壳蛋白，并且除另有特别说明外，其任何实例应被视为在细节上作必要的修改后适用于本公开的包含所述修饰的vp1序列的aav。

本文所述的aav可以是除血清型2以外的(例如，血清型1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)通常感染人的任何一种aav。在一个实例中，所述aav属于血清型1。在一个实例中，所述aav属于血清型3。在一个实例中，所述aav属于血清型4。在一个实例中，所述aav属于血清型5。在一个实例中，所述aav属于血清型6。在一个实例中，所述aav属于血清型7。在一个实例中，所述aav属于血清型8。在一个实例中，所述aav属于血清型9。在一个实例中，所述aav属于血清型10。在一个实例中，所述aav属于血清型11。在一个实例中，所述aav属于血清型12。在一个实例中，所述aav属于血清型13。

本文所述的aav可包含具有修饰的vp1的衣壳蛋白，所述修饰的vp1包含seqidno:15-26的任一者中给出的序列。在一个实例中，所述aav属于血清型1，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:15中给出的序列。在一个实例中，所述aav属于血清型3，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:16中给出的序列。在一个实例中，所述aav属于血清型4，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:17中给出的序列。在一个实例中，所述aav属于血清型5，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:18中给出的序列。在一个实例中，所述aav属于血清型6，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:19中给出的序列。在一个实例中，所述aav属于血清型7，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:20中给出的序列。在一个实例中，所述aav属于血清型8，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:21中给出的序列。在一个实例中，所述aav属于血清型9，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:22中给出的序列。在一个实例中，所述aav属于血清型10，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:23中给出的序列。在一个实例中，所述aav属于血清型11，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:24中给出的序列。在一个实例中，所述aav属于血清型12，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:25中给出的序列。在一个实例中，所述aav属于血清型13，且所述修饰的vp1序列包含seqidno:26中给出的序列。

在每个前述实例中，本文所述的aav包含病毒衣壳蛋白，所述病毒衣壳蛋白包含来自与所述修饰的vp1相同的aav血清型的亚基2(vp2)和亚基3(vp3)序列。优选所述vp1、vp1和vp3由相同的orf表达。

如本文所述，aav基因组包含复制(rep)基因，其是由病毒编码的蛋白质，其在病毒基因组的复制中起作用。因此，在一个实例中，本文所述的aav包含至少一种选自rep78和rep68的大aavrep蛋白和至少一种选自rep52和rep40的小aavrep蛋白。在一个实例中，本文所述的aav包含rep78和rep52。在一个实例中，本文所述的aav包含rep78和rep40。在一个实例中，本文所述的aav包含rep68和rep52。在一个实例中，本文所述的aav包含rep68和rep40。在一个实例中，在一个实例中，本文所述的aav包含rep78、rep68、rep52和rep40。在每个前述实例中，相应的小和大rep蛋白可来自与所述病毒衣壳蛋白相同的aav血清型。可选地，相应的小和大rep蛋白可来自不同于所述病毒衣壳蛋白的aav血清型的aav血清型，例如所述rep蛋白可来自aav2。

本公开的aav还可包含编码由aav反向末端重复(itr)序列侧接的目的蛋白质或rna的多核苷酸。

在一个实例中，所述aavitr序列来自与所述病毒衣壳蛋白相同的血清型。在另一实例中，所述aavitr序列来自与所述病毒衣壳蛋白的血清型不同的血清型。在一个特定的实例中，所述itr序列来自aav血清型2。

如上文所述，编码目的蛋白质或rna的多核苷酸(包括侧接itr)的长度通常为5,000个核苷酸(nt)或更短。然而，也可预期编码超大dna的多核苷酸，即长度超过5,000nt。超大dna在本文中被理解为超过5kbp的最大aav包装限制的dna。因此，能够表达通常由大于5.0kb的基因组编码的蛋白质或rna的本公开的aav也是可能的。

本公开的aav将优选包含结合到其基因组中的编码用于在哺乳动物细胞中表达目的蛋白质或rna的多核苷酸。可结合任意核苷酸序列以便后来在用根据本公开产生的aav转染的哺乳动物细胞中表达，只要构建体保持在aav病毒粒子的包装能力以内即可。本文已经描述了编码目的蛋白质或rna的合适的多核苷酸，并且除另有特别说明外应被视为在细节上作必要的修改后适用于本公开的aav。在一个实例中，aav基因组包含编码如本文所述的目的治疗性蛋白的多核苷酸序列。在一个实例中，aav基因组包含编码如本文所述的rnai剂的多核苷酸序列。在一个实例中，如本文所述，aav基因组包含编码例如用以评估细胞转化和表达的标记蛋白的多核苷酸序列。在一个实例中，aav基因组包含多个多核苷酸序列，如所描述的那样，所述多个多核苷酸序列编码目的蛋白质、rnai剂和/或标记蛋白中的两者或更多者。

本文所述的包含修饰的vp1序列的aav当在昆虫细胞中产生时相对于包含相应野生型vp1序列的aav将具有提高的功能性。

在一个实例中，采用本公开的方法产生包含具有修饰的vp1序列的衣壳蛋白的aav。

试剂盒

本公开还以试剂盒的形式提供本公开的核酸分子、杆状病毒载体、多种杆状病毒载体和/或昆虫细胞。所述试剂盒可包括包含本公开的核酸分子的容器。在一个实例中，所述核酸包含在杆状病毒载体内。在一个实例中，所述试剂盒包括包含本公开的核酸分子的第一容器和包含一种或多种用于产生aav的进一步试剂的第二容器。在一个实例中，所述核酸包含在杆状病毒载体内。在一个实例中，所述试剂盒包含本公开的多种杆状病毒载体，每种用单独的容器包含。所述试剂盒可任选进一步包含例如适合产生根据本公开的aav的昆虫细胞。所述试剂盒还可进一步包括采用如本文所述的方法使用本公开的核酸分子、杆状病毒载体、多种杆状病毒载体和/或昆虫细胞产生aav的说明书。

实验实施例

实施例1-设计、产生和测试修饰的aavvp1序列

在此实施例中，发明人设计并制备了具有病毒衣壳蛋白亚基1(vp1)的aav，向该亚基中将特定的序列修饰即氨基酸取代引入到磷脂酶a2(pla2)结构域和侧接序列，以当在昆虫细胞中产生时恢复aav的磷脂酶活性和病毒功能性。进一步地，基于对包含各种代表性aav血清型的pla2结构域和侧接序列的vp1子序列进行的多序列比对，制备了包含pla2结构域和侧接序列的共有vp1子序列，包括设计用于恢复磷脂酶活性的序列修饰。此共有vp1子序列在seqidno:1中给出。

1.1修饰的aav8vp1和aav9vp1序列的设计

使用blastp比对工具对来自aav8(seqidno:34)和aav2(seqidno:28)的病毒衣壳蛋白1(vp1)蛋白质的n-末端180个氨基酸以及对来自aav9(seqidno:35)和aav2(seqidno:26)的vp1蛋白质的n-末端180个氨基酸进行成对序列比对。基于这些比对，显示来自aav8和aav9的pla2结构域和侧接序列与aav2中的相应序列高度保守。

基于这些序列比对，通过将在seqidno:34中给出的序列的位置42、67、81、84、85和105处的氨基酸用在seqidno28中给出的aav2vp1序列中的相应位置处出现的氨基酸取代来经由电脑模拟设计修饰的aav8vp1序列，即在seqidno:34的序列内的g42s、a67e、q81r、q84d、a85s和q105k。修饰的aav8vp1序列中被取代的残基位置中的两者在侧接pla2结构域的区域中(但被认为可能参与pla2结构域的折叠和/或活性)，且被修饰的残基位置中的四者位于pla2结构域本身之内。

类似地，通过将在seqidno:35中给出的序列的位置42、67、81、84和85处的氨基酸用在seqidno28中给出的aav2vp1序列中的相应位置处出现的氨基酸取代来经由电脑模拟设计修饰的aav9vp1序列，即在seqidno:35的序列内a42s、a67e、q81r、k84d和a85s。修饰的aav9vp1序列中被取代的位置之一在侧接pla2结构域的区域中(但被认为可能参与pla2结构域的折叠和/或活性)，且被修饰的残基位置中的四者位于pla2结构域本身之内。

1.2包括修饰的残基的共有aavvp1子序列的设计

基于对aav2、aav8和aav9的完整vp1序列进行的序列比对，对包含aav血清型1-13(seqidno:15-26)的pla2结构域和侧接序列的vp1子序列进行多序列比对。除了由上述成对比对确认的那些差异之外，在子序列内还确认了许多另外的不相同的残基。然而，决定不针对与相应aav2序列的同一性对这些位置进行突变，这是因为所述差异被认为是保守差异，和/或因为所述残基位置在pla2结构域之外，并且被认为不大可能影响磷脂酶活性。基于所述多序列比对，经由电脑模拟制备包含pla2结构域和侧接序列(具有上述氨基酸取代)的共有vp1子序列(seqidno:1)。

1.3表达结构和非结构aav8蛋白的杆状病毒载体的产生

制备了编码包含亚基vp1、vp2和vp3的修饰的aav8衣壳蛋白以及aav8非结构蛋白rep78和rep52的杆状病毒载体(bacaav8-rep-vpmod，图1)。

简言之，在genscript合成了编码aav8衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)且具有侧接的noti和apai限制位点的dna构建体(aav8-vpmod，图2)，所述衣壳蛋白具有包含seqidno:21中给出的序列的修饰的vp1亚基。使用编码非结构蛋白rep78、rep68、rep52和rep40以及衣壳蛋白vp1、vp2和vp3及装配激活蛋白(aap)的wtaav8-rep/cap质粒(virovek，hayward，ca)作为接受aav8-vpmoddna构建体的主链。用noti和apai消化aav8-vpmoddna构建体和wtaav8-rep/cap质粒两者，之后则将aav8-vpmoddna构建体连接到wtaav8-rep/cap质粒主链中(图3)代替wt衣壳蛋白编码序列以产生aav8-rep-vpmod(图4)。

然后将aav8-rep-vpmod中间体克隆到poet1杆状病毒转移载体(oxfordexpressiontechnologies)中。为了便于这样做，采用quickchange技术将ecorv位点插入到aav8-rep-vpmod中间体中以产生aav8-rep-vpmod-ecorv中间体。然后用noti和ecorv消化aav8-rep-vpmod-ecorv中间体和poet1，并且然后将插入物连接到poet1主链(oxfordexpressiontechnologies)中，产生最终的aav8-rep-vpmod克隆(bacaav8-rep-vpmod，图1)。

1.4表达结构和非结构aav9蛋白的杆状病毒载体的产生

制备编码包含亚基vp1、vp2和vp3的aav9衣壳蛋白以及aav9非结构蛋白rep78、rep68、rep52和rep40的杆状病毒载体(bacaav9-rep-vpmod，图5)。

简言之，在genscript合成了编码aav9衣壳蛋白且具有侧接的noti和apai限制位点的dna构建体(aav9-vpmod，图6)，所述衣壳蛋白具有由seqidno:22中给出的序列编码的修饰的aav9vp1亚基。使用编码非结构蛋白rep78、rep68、rep52和rep40以及衣壳蛋白vp1、vp2和vp3及装配激活蛋白(aap)的wtaav9-rep质粒(virovek，hayward，ca)作为接受aav9-vpmoddna构建体的主链。用noti和apai消化aav9-vpmoddna构建体和wtaav9-rep质粒两者，之后则将aav9-vpmoddna构建体连接到wtaav9-rep质粒主链中(图3)代替wt衣壳蛋白编码序列以产生aav9-rep-vpmod(图7)。

然后将aav9-rep-vpmod中间体克隆到poet1杆状病毒转移载体(oxfordexpressiontechnologies)中。为了便于这样做，采用quickchange技术将ecorv位点插入aav9-rep-vpmod中间体中以产生aav9-rep-vpmod-ecorv中间体。然后用noti和ecorv消化aav9-rep-vpmod-ecorv中间体和poet1(oxfordexpressiontechnologies)，并且然后将插入物连接到poet1主链中，产生最终的aav9-rep-vpmod克隆(bacaav9-rep-cappl，图5)。

1.5表达目的基因(goi)的杆状病毒载体的产生

制备编码由aav2反向末端重复序列(itr)侧接的目的基因(goi)的杆状病毒载体。简言之，在一个实例中，通过如下方式将编码由aav2itr侧接的靶向人pabpn1的转录物的两个shmir的dna构建体克隆到poet1杆状病毒转移载体(oxfordexpressiontechnologies)中，即用noti消化aav2-goi构建体(图8)和poet1(oxfordexpressiontechnologies)，并将aav2-goi构建体连接到poet1主链中以产生最终克隆(bacaav2-goi，图9)。还以与上述相同的方式制备第二goi，但编码靶向hbv聚合酶基因转录物的各区域的三个shmir。

1.6p0杆状病毒原种的产生

使用oxfordexpressiontechnologiesbaculocomplete系统(根据制造商的说明)产生杆状病毒p0原种。简言之，将100万个sf9细胞在转染前1小时接种在6孔板中并使其粘附于板。在1mltc100培养基中，将500ngbac-aav2-goi质粒、bacaav8-rep-cappl或bacaav9-rep-cappl与500ng快速bacdna和baculofectin转染试剂(根据制造商的方案)混合。在室温下温育30分钟后，将转染混合物添加到接种的sf9细胞。将6孔板在28℃下温育。在转染后24小时，将1mlsf9培养基添加到细胞。在转染后5天时，收集含有p0杆状病毒原种的培养基并在4℃下储存。因此，产生bacaav8-rep-cappl、bacaav9-rep-cappl和bac-aav2-goi的p0杆状病毒。

1.7p1杆状病毒原种的产生

使用500ulp0杆状病毒原种以2x10e6个细胞/ml的浓度感染100mlsf9细胞培养物。在140rpm振荡下将杆状病毒培养物在28℃下温育5天。在感染后5天时，收获含有p1的培养基并在4℃下储存

1.8p2杆状病毒原种的产生

使用500ulp1杆状病毒原种以2x10e6个细胞/ml的浓度感染100mlsf9细胞培养物。在140rpm振荡下将杆状病毒培养物在28℃下温育5天。在感染后5天时，收获含有p2的培养基并在4℃下储存

1.9滴定p2杆状病毒原种

使用oxfordexpressiontechnologiesbaculoquant试剂盒测定杆状病毒p2原种的滴度。将杆状病毒原种连续稀释，并用所提供的裂解缓冲液根据制造商的说明进行裂解。采用qpcr扩增杆状病毒包膜融合蛋白gp64的dna。使用标准曲线对p2原种进行定量并外推以确定病毒pfu/ml。

1.10用以产生aav的共感染

将细胞密度为2x10e6个细胞/ml的600mlsf9细胞用bacaav8-rep-cappl和bacaav2-goi(编码靶向hbv聚合酶基因转录物的3个shmir)以0.1的moi或用bacaav9-rep-cappl和bacaav2-goi(编码靶向人pabpn1基因转录物的2个shmir)以0.1的moi共感染。然后在115rpm振荡下将细胞培养物在28℃下温育6天。

1.11aav的纯化

在感染后六天时，自感染的培养物收集澄清的培养基。采用0.2微米过滤、接着是0.1微米过滤自aav中滤掉杆状病毒。然后将peg添加到不含杆状病毒的培养基以沉淀aav。在添加peg后24小时，将培养基以2500g旋转45分钟以沉淀aav。弃去上清液，并将沉淀的病毒悬浮在裂解缓冲液中。通过碘克沙醇梯度液进行aav的初步纯化，从中收集40-60％级分之间的5ml层。对此含有病毒的层进行缓冲液交换以移除残留的碘克沙醇，并将缓冲液交换的病毒分层到铯梯度液之上。然后对铯梯度液进行过夜离心。用注射器收集铯梯度液中含有aav的带并进行缓冲液交换，以从纯化的aav病毒原种中移除氯化铯。

1.12滴定aav

通过qpcr定量所有aav制剂的最终aav滴度。简言之，在室温下对十微升纯化的aav病毒进行15分钟的dna酶处理(dnasei，扩增级，1u/ul，invitrogen)。然后通过在65℃下温育10分钟使dna酶失活。如下进行病毒稀释：1:10；1:30；1:100；1:1,000；1:3,000；1:10,000。通过qpcr分析每一稀释液以确定每ml的病毒基因组总数。

1.13在哺乳动物细胞中制备的aav

如上所述将在哺乳动物细胞中制备的aav的功能性与在昆虫细胞中制备的aav进行比较。为了比较在哺乳动物细胞和昆虫细胞中制备的重组aav的生物活性(功能性)，在体外用各种滴度的病毒感染哺乳动物细胞，并采用qrtpcr测定法对加工的shmir的表达进行定量。

对于这些实验，由商业供应商在哺乳动物细胞中制备表达靶向hbv聚合酶基因转录物的3个shmir的重组aav8颗粒(vectorbiolabs；www.vectorbiolabs.com)。此外，由第二家供应商即全美儿童医院载体中心在哺乳动物细胞中制备表达靶向人pabpn1的2个shmir的重组aav9颗粒(https://ccts.osu.edu/research-support-services/clinical-research-support/nationwide-childrens-viral-vector-gmop-facility)。

评估以下的生物活性：(i)在哺乳动物细胞(vectorbiolabs)中产生的具有未修饰的vp1的aav8，(ii)在昆虫细胞中由杆状病毒产生的具有修饰的vp1的aav8(如本文所述使用bacaav8-rep-vpmod)，和(iii)使用wtaav8-rep/cap(ben10，virovek，hayward，ca)在昆虫细胞中由杆状病毒产生的具有未修饰的wtvp1的aav8，每一者编码靶向hbv聚合酶基因的3个shmir(shmir1、shmir2和shmir3)。简言之，用上述修饰或未修饰的重组病毒制剂以4x10e9、8x10e9和1.6x10e10的moi感染jhu67细胞，并在感染后72小时对三个shmir中的每一者的shmir表达进行定量。为了定量shmir的表达，使用qiagenrna迷你试剂盒(qiagen)从感染的细胞中提取rna。使用qiagenmiscript试剂盒(qiagen)逆转录rna。然后在qpcr反应中使用cdna，特异性引物被设计为扩增shmir靶以确定样本中存在的拷贝总数。

如图10a-10c中所示，用在哺乳动物细胞中制备的具有未修饰的wtvp1的aav8感染的细胞容易产生可检测水平的shmir，而在昆虫细胞中由杆状病毒产生的具有未修饰的wtvp1的aav8产生很少(如果有的话)的shmir。相比之下，在昆虫细胞中由杆状病毒产生的具有修饰的vp1的aav8产生相对高水平的shmir，表明与在昆虫细胞中由杆状病毒产生的具有未修饰的wtvp1的aav8相比，这些aav的功能性提高。

还评估了以下的生物活性：(i)在哺乳动物细胞(nationwide)中产生的具有未修饰的衣壳蛋白的aav9，和(ii)在昆虫细胞中使用bacaav9-rep-vpmod(如本文所述)由杆状病毒产生的具有修饰的衣壳蛋白的aav9，每一者编码靶向人pabpn1的转录物的2个shmir(标记为sh13和sh17)。简言之，用4x10e9、8x10e9和1.6x10e10个载体基因组感染表达aav内化受体的c2c12细胞。72小时温育之后，收获细胞，提取rna，并根据上述qpcr方法定量两个shmir的shmir表达。

如图11中所示，两种制剂显示出非常类似的shmir表达水平，表明病毒功能性非常类似。

虽然在来自血清型8和9的aav的情况下进行了展示，但可预期根据本文所述的方法修饰其它aav血清型(不同于血清型2)的vp1亚基序列将会恢复当在昆虫细胞中由杆状病毒表达系统产生时的aav的功能性。

本领域技术人员将要理解的是，在不脱离本公开的广义范围的情况下可对上述实施方案进行多种变动和/或修改。因此本发明实施方案的所有方面都被视为是说明性而非限制性的。

序列表

<110>贝尼泰克生物制药有限公司(benitecbiopharmalimited)

<120>具有修饰的磷脂酶结构域的腺相关病毒(aav)

<130>4226.006pc01/bnc/pmr

<150>65/553,028

<151>2017-08-31

<160>39

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>64

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>aav血清型的修饰的共有vp1子序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>xaa是gly或phe

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(20)

<223>xaa是arg或lys

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)..(29)

<223>xaa是glu或ala

<220>

<221>misc_feature

<222>(30)..(30)

<223>xaa是val或ala

<220>

<221>misc_feature

<222>(32)..(32)

<223>xaa是arg或leu

<220>

<221>misc_feature

<222>(36)..(36)

<223>xaa是ile或lys

<220>

<221>misc_feature

<222>(37)..(37)

<223>xaa是ser或ala

<220>

<221>misc_feature

<222>(39)..(39)

<223>xaa是asn或asp

<220>

<221>misc_feature

<222>(51)..(51)

<223>xaa是lys或arg

<220>

<221>misc_feature

<222>(61)..(61)

<223>xaa是glu或gln

<220>

<221>misc_feature

<222>(62)..(62)

<223>xaa是lys或arg

<400>1

serargglyleuvalleuproglytyrasntyrleuglyproxaaasn

151015

glyleuaspxaaglygluprovalasnglualaaspxaaxaaalaxaa

202530

gluhisaspxaaxaatyrxaaargglnleuaspserglyaspasnpro

354045

tyrleulystyrasnhisalaaspalaglupheglnxaalysleulys

505560

<210>2

<211>64

<212>prt

<213>腺相关病毒(adeno-associatedvirus)

<400>2

alaargglyleuvalleuproglytyrasntyrleuglyproglyasn

151015

glyleuaspargglygluprovalasnargalaaspgluvalalaarg

202530

gluhisaspilesertyrasngluglnleuglualaglyaspasnpro

354045

tyrleulystyrasnhisalaaspalaglupheglnglulysleuala

505560

<210>3

<211>64

<212>prt

<213>腺相关病毒(adeno-associatedvirus)

<400>3

serargglyleuvalleuproglytyrlystyrleuglypropheasn

151015

glyleuasplysglygluprovalasnglualaaspalaalaalaleu

202530

gluhisasplysalatyraspargglnleuaspserglyaspasnpro

354045

tyrleulystyrasnhisalaaspalaglupheglngluargleulys

505560

<210>4

<211>64

<212>prt

<213>腺相关病毒(adeno-associatedvirus)

<400>4

argargglyleuvalleuproglytyrlystyrleuglyproglyasn

151015

glyleuasplysglygluprovalasnglualaaspalaalaalaleu

202530

gluhisasplysalatyraspglnglnleulysalaglyaspasnpro

354045

tyrleulystyrasnhisalaaspalaglupheglngluargleugln

505560

<210>5

<211>64

<212>prt

<213>腺相关病毒(adeno-associatedvirus)

<400>5

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151015

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