从小龙虾肠道分离的枯草芽胞杆菌CP-3的制作方法

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及从小龙虾(克氏原螯虾，procambarusclarkii)肠道分离的一株枯草芽胞杆菌cp-3。该枯草芽胞杆菌具有产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶的特性，可应用于生物饲料发酵和微生态制剂制备菌剂的应用。

背景技术：

近年来，小龙虾即克氏原螯虾的养殖产业飞速发展，由最初的小规模养殖和简单的加工出口而不断发展完善，现在中国的小龙虾产业成为集育苗、养殖、加工、餐饮、销售、休闲旅游和文化等一体的综合性产业。虽然小龙虾产业发展迅猛，但是其相关的科学研究却显得相对滞后。目前，国内外对克氏原螯虾的研究主要集中于其行为学、种群结构与分布及疾病与免疫方面，对营养饲料方面的研究也主要集中在蛋白质、脂肪等方面，而对于小龙虾肠道细菌的相关研究却鲜有报道。肠道微生物在水产动物营养吸收、生长代谢和免疫抗病等方面发挥着重要作用，对小龙虾肠道菌群的研究可为小龙虾养殖用益生菌的开发和饲料配方的优化提供依据。

小龙虾肠道微生物是小龙虾降解蛋白质、纤维素和半纤维素的主要驱动力，因此，从小龙虾肠道内筛选到降解木质纤维素以及蛋白质的优良菌株，为创制新型小龙虾饲料提供饲料菌剂。

技术实现要素：

本申请人已经表明，肠道是小龙虾(克氏原螯虾，procambarusclarkii)消化蛋白质以及木质纤维素的重要部位，而定殖细菌主要集中在此部位，可以从小龙虾肠道内筛选优良益生菌株，为小龙虾提供生物饲料菌剂。

本发明分离的菌株枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)菌株，是申请人2017年11月5日从湖北潜江市的克氏原螯虾(俗称：小龙虾)肠道菌群中分离并鉴定的一株分离菌株，申请人将该菌株命名为bacillussubtiliscp-3(枯草芽胞杆菌cp-3)，该菌株具有以下一种或多种特征：

(i)具有纤维素酶活性；

(ii)具有木聚糖酶活性；

(iii)具有蛋白酶活性；

(iv)具有淀粉酶活性；

该菌株最适发酵时间为3d，最适培养温度为37℃，初始ph＝5，装料量为30g/250ml三角瓶，接种量为2.5％，培养基中碳源为麸皮与玉米芯混合物，其中麸皮占比为60％(质量比)，当氮源为氯化铵时，其木聚糖酶活力可达3459.58u/g(以湿基计)。

从菌落形态来看，cp-3菌落圆形，扁平，表面干燥，革兰氏染色阳性，产芽孢。

根据经典微生物学分类和16srdna序列辅助鉴定，申请人将该菌株鉴定为bacillussubtiliscp-3，于2018年12月06日将该菌株送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno:m2018867。

附图说明

图1：枯草芽胞杆菌菌株cp-3木聚糖酶的活性检测。

图2：枯草芽胞杆菌菌株cp-3纤维素酶的活性检测。

图3：枯草芽胞杆菌菌株cp-3蛋白酶的活性检测。

图4：枯草芽胞杆菌菌株cp-3淀粉酶的活性检测。

图5：枯草芽胞杆菌菌株cp-3木聚糖酶的活力检测。附图标记说明：图5a是枯草芽胞杆菌菌株cp-3初始ph和碳源中麸皮占比交互作用的响应面分析图；图5b是枯草芽胞杆菌菌株cp-3初始ph和碳源中麸皮占比交互作用的等高线图；图5c是枯草芽胞杆菌菌株cp-3初始ph和发酵时间交互作用的响应面分析图；图5d是枯草芽胞杆菌菌株cp-3初始ph和发酵时间交互作用的等高线图；图5e是枯草芽胞杆菌菌株cp-3碳源中麸皮占比和发酵时间交互作用的响应面分析图；图5f是枯草芽胞杆菌菌株cp-3碳源中麸皮占比和发酵时间交互作用的等高线图。

图6：枯草芽胞杆菌菌株cp-3菌落形态。

具体实施方式

对核苷酸序列表的说明：

seqidno:1是本发明分离的枯草芽胞杆菌菌株cp-3的16srdna序列。

实施例1

申请人2017年11月5日从湖北省潜江市养殖的小龙虾基地分离得到一种小龙虾肠道枯草芽胞杆菌菌株cp-3。该枯草芽胞杆菌菌株cp-3的特征具有下列所述的一种或多种特征，具体为：

(i)具有纤维素酶活性；

(ii)具有木聚糖酶活性；

(iii)具有蛋白酶活性；

(iv)具有淀粉酶活性；

该菌株最适发酵时间为3d；最适培养温度为37℃；初始ph＝5；装料量为30g/250三角瓶；接种量为2.5％；培养基中的碳源为麸皮和玉米芯混合物，培养基中麸皮占比的为60％(以质量比计)；当氮源为氯化铵时，该菌株的木聚糖酶活力可达到3459.58u/g(以湿基计)。

具体实施步骤如下：

试验用的小龙虾为湖北省潜江市养殖的鲜活的小龙虾，在实验室条件下进行暂养。

小龙虾肠道细菌的分离筛选：选取10只小龙虾，用70％酒精、无菌水依次清洗体表，解剖出全肠，放于1ml灭菌磷酸盐缓冲液(简称pbs缓冲液，配方：请补充)中，用灭菌的匀浆棒充分匀浆后的液体即为小龙虾肠道菌悬液。吸取小龙虾全肠菌悬液倒入富集培养基中(富集培养基配方为：木聚糖1％，kh2po40.1％，mgso40.05％，ph8.0，在1×10⁵pa的高压灭菌锅中灭菌20min)，于37℃下震荡培养24h。将富集培养基中的菌液稀释涂在平板上，该平板含有筛选培养基(筛选培养基配方为：胰蛋白胨0.5％，nacl0.58％，木聚糖0.8％，酵母膏0.1％，葡萄糖0.1％，柠檬酸三钠0.45％，ph8.0，琼脂粉2％，1×10⁵pa灭菌20min)，试验设计梯度从10^-2到10^-7，每个梯度涂两个平行。在28℃的恒温箱中进行倒置培养2d。将筛选培养基上长出的菌经分类标记后，分别用牙签点在干净新鲜的筛选培养基中，在28℃的恒温箱中进行倒置培养24h。用沾了酒精的纸板轻轻刮去培养基表面的菌体，再用0.2％刚果红染色15min，1m的nacl脱色30min，观察水解圈的形成。将有水解圈的菌落进行标记，挑到筛选培养基的平板上进行分离纯化。记录水解圈直径和菌落直径大小，并将纯化的菌落置于-80℃甘油中保藏。

小龙虾肠道细菌的鉴定，对菌株进行个体形态观察，根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》初步判断所筛选细菌菌株的科属。采用细菌通用引物27f(5’-agagtttgatcctggctcag-3’)和1492r(5’-tacggytaccttgttacgactt-3’)进行16srdnapcr扩增。pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸7min；15℃保存。pcr结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增结果，送上海桑尼生物科技有限公司测序。16srdna序列如下所示：

序列同序列表seqidno:1：

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申请人将该菌株命名为bacillussubtiliscp-3，于2018年12月06日将该菌株送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno:m2018867。

本发明从小龙虾肠道中分离的菌株bacillussubtiliscp-3，具有产纤维素酶，木聚糖酶，蛋白酶和淀粉酶特性。cp-3菌株是从小龙虾肠道分离的益生菌，能够在小龙虾肠道中定殖，在生产开发与利用上，利用本发明分离的枯草芽胞杆菌菌株可以制成微生物菌剂添加到小龙虾饲料中，为创制新型小龙虾饲料开辟新途径。一方面，饲料中添加枯草芽胞杆菌cp-3，能够对水产中的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害微生物有很强的抑制作用，能有效预防水产动物的肠炎，烂鳃等疾病；另一方面，枯草芽胞杆菌cp-3能够促进饲料中营养素的降解，使小龙虾对饲料的吸收利用更加充分，从而可以提高小龙虾产量，进而提高小龙虾养殖的经济效益。

序列表

<110>武汉设计工程学院

<120>从小龙虾肠道分离的枯草芽胞杆菌cp-3

<141>2018-12-01

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1514

<212>dna

<213>枯草芽胞杆菌(拉丁文学名)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1514)

<400>1

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