一种用于植物基因组编辑载体、及其构建方法和应用与流程

文档序号：17923953发布日期：2019-06-15 00:17阅读：560来源：国知局

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于对植物基因组的特定位点dna进行精确编辑的载体、以及载体的构建方法和应用。

背景技术：

基因定点突变与定点置换技术称为基因组编辑技术，也称为基因打靶技术，该技术能实现在生物体细胞基因组dna的定点突变、定点整合及置换，从而人为定向改变基因的功能。利用这种技术能够实现对基因组dna一个或多个碱基的变异，或者插入一段dna，如一个基因，或者删除一段dna，让基因的某些功能区域缺失。基因组编辑的方法包括：锌指核酸酶(zincfingernuclease，zfn)技术、talen(transcriptionactivator-likeeffectornucleases)技术及crispr/cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crispr-associatedsystems)技术等，其中crispr/cas9构建简单，使用方便，从而得到了更广泛的运用。

crispr是细菌及古细菌基因组中存在的成串重复dna，是降解入侵的病毒dna或其他外源dna的重要免疫机制。crispr系统分成三类，其中i类和iii类需要多种crispr相关蛋白(cas蛋白)才能发挥作用，而ii类系统只需要一种cas蛋白即可。例如，crispr/cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒dna的片段整合到crispr中，并利用相应的crisprrnas(crrnas)来指导cas9蛋白对同源dna序列的降解。依据这种对付入侵细菌细胞病毒dna的原理，设计出在高等生物中对基因进行编辑的系统，能够对细胞的基因组dna进行原位修饰、改变，这不仅为研究基因功能提供了重要手段，而且在基因定向突变，改良农作物品种中，显示出广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明提供了一种用于植物基因组编辑的载体、以及载体的构建和应用方法，实现对植物基因组特定位点dna的精确修饰、编辑，以及将外源dna定点整合到植物基因组的目的，从而达到按照设计改变原基因组特定位置dna遗传信息的目的，将本发明提供的种载体用于对水稻稻瘟病抗性位点dna的编辑修饰获得良好效果。

本发明通过下述技术方案实现：

一种用于植物基因组编辑载体构建的质粒pmf115，所述质粒包含有双生病毒复制相关的小间区sir、大间区lir和复制相关蛋白rep/repa三个dna片段，所述双生病毒小间区sir为seqno.1，双生病毒大间区lir为seqno.2，复制相关蛋白rep/repa片段为seqno.3。所述质粒用于克隆重组的dna片段hr。质粒pmf115结构示意图如图1所示。双生病毒是指双生病毒科植物病毒，如小麦矮缩病毒。

基于上述质粒pmf115的构建方法，包括以下步骤：

setp1，根据双生病毒基因组序列设计并合成小间区sir、大间区lir和复制相关蛋白rep/repa三个dna片段；其中，小间区sir片段如seqno.1所示，大间区lir片段如seqno.2所示，复制相关蛋白rep/repa片段如seqno.3所示，具体操作过程中，将合成的三个dna片段分别克隆在pjwr质粒、pmv质粒和pmv质粒上；

setp2，将小间区sir的dna片段克隆到pgreenii0179的ecori和psti双酶切位点，得到质粒0179-sir。具体地，将含小间区sir的质粒pjwr经ecori和psti双酶切后，与经ecori和psti双酶切后的pgreenii0179片段进行连接，得到质粒0179-sir；

setp3，将大间区lir的dna片段克隆到质粒0179-sir的kpni和xhoi酶切位点，得到质粒0179-lir-sir。具体地，将含有大间区lir的质粒pmv经kpni和xhoi酶切后，与经kpni和xhoi酶切后的0179-sir片段进行连接，得到质粒0179-lir-sir；

setp4，将大间区lir的dna片段克隆到质粒0179-lir-sir的sacii和saci酶切位点，得到质粒pmf096；具体地，采用f-lir-sacii和r-lir-saci作为引物，以质粒0179-lir-sir为模板进行pcr扩增，得到的pcr片段克隆到质粒0179-lir-sir的sacii和saci酶切位点，得到质粒0179-lir-sir-lir，命名为pmf096；其中，f-lir-sacii和r-lir-saci引物如下：

f-lir-sacii：5’-taccgcggggtagtgaacagaagtccg-3’；

r-lir-saci：5’-tagagctccgagatgggctcccacgc-3’；

setp5，在质粒pmf096的大间区lir和小间区sir中间克隆一个多克隆位点区，得到质粒pmf114，所述多克隆位点区包括xhoi、sali、smai/xmai、bamhi、spei、xbai、noti、hindiii、ecorv；具体地，合成序列如下所示的f-pc和r-pc片段，将这两个单链dna片段经变性后复性得到双链dna的片段，再将其克隆到质粒pmf096的sali和hindiii双酶切位点，获得在大间区lir和小间区sir中间含有多克隆位点区xhoi、sali、smai/xmai、bamhi、spei、xbai、noti、hindiii、ecorv的质粒，即pmf114；

f-pc：5’-tcgacccgggggatccactagttctagagcggccgc-3’；

r-pc：5’-agcttgcggccgctctagaactagtggatcccccggg-3’；

setp6，将rep/repa的dna片段克隆到质粒pmf114的sacii和psti双酶切位点，得到质粒pmf115，序列为seqno.4；具体地，将含有复制相关蛋白rep/repa片段的质粒pmv经sacii和psti双酶切后，与pmf114质粒经同样酶切后dna片段连接即可。

一种与上述质粒pmf115配合使用构建植物基因组编辑载体的质粒pmf125，所述质粒pmf125是将质粒pylcrispr/cas9pubi-h中编码cas9蛋白的氨基酸突变，使得cas9由核酸酶变为切口酶。由于cas9核酸酶含有两个功能域：ruvc和hnh，d10a突变使得ruvc丧失功能cas9成为切口酶；同样地，突变在hnh功能域h840a，第840位氨基酸由组氨酸突变成丙氨酸，也可以使cas9由核酸酶变为切口酶。所述质粒pmf125用于克隆目标基因的sgrna表达盒，通过质粒pmf125直接与质粒pmf115配合使用，或者与构建质粒pmf115的中间质粒pmf096或pmf114配合使用构建植物基因组编辑载体。质粒pmf125的结构示意图如图2所示。

上述质粒pmf125的构建方法，包括以下步骤：

setp1，用bamhi酶切pylcrispr/cas9pubi-h质粒，得到约10kb和6.2kb两个片段，6.2kb片段与质粒puc19经bamhi酶切并去磷酸化的片段连接，得质粒t-p-cas9p；10kb片段经去磷酸化处理备用；

setp2，合成如下pcr引物：

f-p-cas9p：5’-ctgagctagcgttcgtacacggat-3’；

r-p-cas9p：5’-atgcgctagctccaccgtcaatgta-3’；

f-cas9pd10a：5’-tccatcggcctcgctatcggcaccaac-3’；

r-cas9pd10a：5’-gttggtgccgatagcgaggccgatgga-3’；

以pylcrispr/cas9pubi-h质粒为模板，分别用引物f-p-cas9p和r-cas9pd10a、f-cas9pd10a和r-p-cas9p进行第一次pcr扩增；以两个第一次pcr扩增片段混合dna为模板，用引物f-p-cas9p和r-p-cas9p进行第二次pcr扩增，第二次pcr扩增片段经nhei酶切与质粒t-p-cas9p经nhei酶切去磷酸化处理的大片段连接，得到质粒t-p-cas9pm；

setp3，质粒t-p-cas9pm经bamhi酶切，回收的片段与上述setp1的10kb大片段连接，从而获得载体质粒pmf125，序列为seqno.5。

一种用于植物基因组编辑的载体，所述编辑载体包括依次连接的两个双生病毒大间区lir、sgrna表达盒和cas9d10a基因，且所述两个双生病毒大间区lir之间含有双生病毒复制相关蛋白rep/repa片段、双生病毒小间区sir和用于重组的dna片段hr；

所述sgrna表达盒是依据目标基因组位点dna序列设计构建而成，包括含启动子、依据靶序列设计的sgrna的dna片段及终止子；

所述用于重组的dna片段hr是指用于与目标基因组位点dna在细胞内重组，从而达到改变原编辑位点dna遗传信息的dna片段。

所述sgrna表达盒为依据目标基因组位点dna序列设计构建，包括含启动子、靶序列和sgrna的dna片段。基因组编辑载体如图3所示，用该载体转化植物，载体质粒的rb到lb的t-dna片段整合进入植物细胞的基因组中，由于t-dna含有两个双生病毒大间区(lir)，两者重组得到如图5所示的环状dna分子。在转入表达的复制相关蛋白(rep/repa)作用下，形成的环状dna类似于双生病毒，在植物细胞内自主大量复制，得到的大量含有hr的dna就易于与基因组的同源目标位点dna发生重组，从而实现对基因组的编辑修饰，特别是转入的cas9d10a核酸酶的表达，在sgrna的引导下，能在目标基因组的目标dna上形成切口，使得这种重组概率大幅度提高，最终实现对基因组高效的编辑。

基于上述用于植物基因组编辑的载体的构建方法，包括以下步骤：

setp1，构建质粒pmf115；

setp2，构建质粒pmf125；

setp3，依据目标基因组位点dna序列设计sgrna表达盒，将所述sgrna表达盒连入载体pmf125制备含sgrna表达盒的质粒；

setp4，将用于重组dna的片段hr连接到载体质粒pmf115；

setp5，将所述setp4构建的质粒中两个大间区lir片段、以及两个大间区lir之间的dna片段克隆到setp3构建的质粒中，获得最终基因组编辑载体。

进一步地，用于植物基因组编辑的载体的构建方法，所述setp3中，sgrna表达盒的设计步骤包括：

setp31，对目标基因组位点dna序列，设计sgrna靶序列，所述sgrna靶序列为5’-n20ngg，其中gc含量为50％-70％，对应启动子为u3或u6；

具体地，sgrna靶序列通常为5’-n20ngg，其中gc含量大于40％，最好为50％-70％，避免连续的4个碱基为t。如果sgrna序列是5’-an19ngg，选择u3作为启动子；如果sgrna序列是5’-gn19ngg，选择u6作为启动子；如果sgrna序列为5’-(t/c)n19ngg，可以任选u3或u6作为启动子；

setp32，pcr引物设计：根据sgrna靶序列，合成重叠延伸pcr的引物，合成构建sgrna表达盒的通用引物；

具体地，根据sgrna靶序列，合成重叠延伸pcr的引物，合成构建sgrna表达盒的通用引物；根据setp31设计的sgrna靶序列，按下述表1合成重叠延伸pcr(overlappcr)的引物，按下述表2合成构建sgrna表达盒的通用引物。

表1含靶位点dna序列的重叠延伸pcr的引物

表2构建sgrna表达盒的通用引物*

*注：ggtctc为bsai识别位点；actagt为spei酶切位点；acgcgt为mlui酶切位点。

setp33，重叠延伸pcr扩增构建sgrna表达盒；

具体地，根据需要选择不同的启动子，再依照选用的启动子不同，分别从如下四个质粒中选择适当的一个作为第一轮pcr的扩增模板：

①pylsgrna-osu3，genbank登录号：kr029103；

②pylsgrna-osu6a，genbank登录号：kr029105；

③pylsgrna-osu6b，genbank登录号：kr029107；

④pylsgrna-osu6c，genbank登录号：kr029108。

两个pcr扩增的引物分别是u-f和osu#t#-、grt#-和gr-r为引物，扩增后分别得到u片段和t片段。

然后，以u片段和t片段混合为模板，pps和pgs为引物，进行第二轮pcr扩增，得到含有bsai酶切位点的pcr产物。

上述重叠延伸pcr(overlappcr)扩增过程如图4所示。

第二轮扩增的pcr片段克隆到zt4-blunt载体(庄盟生物公司，货号zc205)，克隆片段经dna测序验证。bsai酶切质粒得到sgrna表达盒，包括含启动子、靶序列、sgrna的片段。

setp34，根据所设计的靶标序列数目组合扩增多个sgrna表达盒。

具体地，可以根据所设计靶标序列数目组合扩增多个sgrna表达盒，推荐按如下使用启动子及相应的pcr引物组合进行pcr扩增构建sgrna表达盒：

1个目标位点：lacz-osu6a；

2个目标位点：lacz-osu6a+osu6b；

3个目标位点：lacz-osu6a+osu6b+osu6c；

4个目标位点：lacz-osu6a+osu6b+osu6c+osu3m；

5个目标位点：lacz-osu6a+osu6a+osu6b+osu6c+osu3m；

6个目标位点：lacz-osu6a+osu6a+osu6b+osu6b+osu6c+osu3m；

7个目标位点：lacz-osu6a+osu6a+osu6b+osu6b+osu6c+osu6c+osu3m；

8个目标位点：lacz-osu6a+osu6a+osu6b+osu6b+osu6c+osu6c+osu3m+osu3m。

例如，1个靶序列用pps-ggl/pgs-ggr；2个靶序列分别用：pps-ggl/pgs-gg2和pps-gg2/pgs-ggr；3个靶序列分别用pps-ggl/pgs-gg2、pps-gg2/pgs-gg3和pps-gg3/pgs-ggr；4个靶序列分别用pps-ggl/pgs-gg2、pps-gg2/pgs-gg3、pps-gg3/pgs-gg4和pps-gg4/pgs-ggr；依此类推。

setp35，sgrna表达盒连入质粒pmf125：

具体地，sgrna表达盒质粒经bsai酶切分离的表达盒dna片段，与bsai酶切质粒pmf125的dna片段连接，即得到含sgrna表达盒的pmf125质粒。

下面事例为3个sgrna表达盒时，它们的连接顺序(方向为5’-3’)。

进一步地，用于植物基因组编辑的载体的构建方法，所述setp4具体操作方法为：用于重组的dna片段hr通过酶切连接或同源重组连接的方法连入质粒pmf115多克隆位点处；或者用于重组的dna片段hr克隆到质粒pmf096或质粒pmf114得到中间质粒，然后再将rep/repa片段克隆进入上述中间质粒，即得到含hr片段的pmf115质粒。

操作方法如下：

setp41，根据sgrna靶序列位点的基因组dna序列，设计同源臂dna，并与包括设计的突变、缺失或插入的dna一起组成提供重组的片段hr。

setp42，提供重组的hr片段通过酶切连接或同源重组的方法连入质粒pmf115多克隆位点处；

①酶切的方法：根据载体pmf115中多克隆位点处可用酶切位点xhoi、sali、smai/xmai、bamhi、spei、xbai、noti、ecorv及提供重组片段hr序列设计克隆酶切位点。通常采用pcr扩增获得hr片段，hr片段克隆到zt4-blunt(庄盟生物公司，货号zc205)，并测序克隆的hr验证。用设计的酶酶切hr片段，连接到pmf115质粒得到相应质粒。注意：rep/repa中含有一个hindiii酶切位点，pmf115多克隆位点中hindiii不能用于克隆。

②同源重组的方法：根据载体pmf115中多克隆位点处可用酶切位点xhoi、sali、smai/xmai、bamhi、spei、xbai、noti、ecorv任选两个酶(假定为酶a和酶b)酶切pmf115质粒，得到线性pmf115质粒dna。通常用pcr扩增方法得到hr片段，pcr引物以如下所示设计：

正向引物(f-hr)：a酶切位点序列前15个碱基+a酶切位点序列+hr片段序列正向5’-端15～20bp碱基序列-3’。

反向引物(r-hr)：b酶切位点序列前15个碱基+b酶切位点序列+hr序列反向5’-端15～20bp碱基序列-3’。

经酶切线性化的pmf115和pcr扩增片段，经重组酶(vazyme公司，货号c112-01)连接得到相应的质粒。

或者，提供重组dna的hr片段首先克隆到质粒pmf096或者pmf114，然后再将rep/repa片段克隆到这个质粒。特别是，在rep/repa中含有hindiii酶切位点，而克隆hr片段也需要用到hindiii酶切位点时，选择hr片段克隆到pmf096或者pmf114，然后再将rep/repa片段克隆到这个质粒，最终得到含有hr片段的编辑载体pmf115的质粒。

进一步地，用于植物基因组编辑载体的构建方法，所述setp5具体操作步骤包括：

以如下引物：f-lsl和r-lsl：

f-lsl：5’-ttggagtggatggatactagtggtagtgaacagaag-3’；

r-lsl：5’-gcgccaatgataccgacgcgtcgagatgggctccca-3’；

用setp4构建的质粒dna为模板进行pcr扩增，扩增得到的dna片段包括两个病毒大间区lir、以及位于两个病毒大间区lir之间的复制相关蛋白rep/repa、双生病毒小间区sir和用于重组的dna片段hr(如图6所示)；扩增片段与来自setp3含sgrna表达盒的pmf125质粒的mlui和spei双酶切片段经重组酶连接，即获得最终的编辑载体，如图3所示。

或者，如果用于重组的dna片段hr中不含mlui和nhei酶切位点，可采用酶切连接的方法将pcr扩增片段连入pmf125质粒中。具体地，用如下引物：

f-lir-m：5’-taacgcgtggtagtgaacagaagtccg-3’；

r-lir-n：5’-tagctagccgagatgggctcccacgc-3’；

用setp4构建的质粒dna为模板进行pcr扩增，扩增得到dna片段包括病毒大间区lir、复制相关蛋白rep/repa、双生病毒小间区sir和用于重组的dna片段hr(如图6所示)，将该pcr扩增片段经mlui和nhei酶切后，与来自step3含sgrna表达盒质粒pmf125的mlui和spei双酶切片段连接，即获得最终的编辑载体，如图3所示。

基于上述用于构建植物基因组编辑载体的质粒pmf115或质粒pmf125或用于植物基因组编辑的载体的应用。

本发明具有如下的优点和有益效果：

1、用本发明的基因组编辑载体转化植物，质粒的rb到lb的t-dna片段整合进入植物细胞的基因组中，由于t-dna含有两个双生病毒大间区(lir)，从而进行重组得到环状dna分子(如图5所示)。在转入表达的复制相关蛋白(rep/repa)作用下，该环状dna类似于双生病毒，在植物细胞内自主大量复制，得到的大量含有hr的dna就易于与基因组的同源目标位点dna发生重组，从而实现对基因组的编辑修饰，特别是转入的cas9d10a核酸酶的表达，在sgrna的引导下，能在基因组目标dna上形成切口，使得这种重组概率大幅度提高，最终实现对基因组高效的编辑；

2、本发明改进了现有的crispr/cas9基因编辑系统，实现了对基因组特定位点dna的精确修饰、编辑。更确切地说，本发明提供了一种将外源dna定点整合到植物基因组的方法，实现了按照需要进行设计，达到改变原基因组特定位置dna遗传信息的目的。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明的质粒pmf115结构示意图；

图2为本发明的质粒pmf125结构示意图；

图3为本发明的基因组编辑载体结构示意图；

图4为本发明的整个重叠延伸pcr(overlappcr)扩增过程示意图；

图5为本发明的环状dna分子示意图；

图6为本发明中pcr扩增的含病毒复制相关元件和提供重组dna的hr片段示意图；

图7为本发明设计的水稻稻瘟病抗性基因替换供体片段示意图；

图8为本发明的转化水稻植株潮霉素标记基因的pcr检测琼脂糖凝胶电泳图；

图9为本发明的转化水稻植株cas9基因的pcr检测琼脂糖凝胶电泳图；

图10为本发明用于水稻稻瘟病抗性基因进行编辑的实际效应；图中数字000对应的dna序列为原来基因组dna序列，其它是测定的植株发生编辑的dna序列；

图11为稻瘟病抗性位点在水稻基因组各个染色体上的分布，图中数字是遗传图距单位厘摩，下划线的文字为ssr或者rflp标记；此图片引自发表文献：wang,x.,lee,s.,wang,j.,ma,j.,bianco,t.,&jia,y.(2014).currentadvancesongeneticresistancetoriceblastdisease.inrice-germplasm,geneticsandimprovement.intechopen.http://dx.doi.org/10.5772/56824。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

一、构建一种含有双生病毒复制相关原件、用于克隆用于重组dna的片段hr的载体质粒pmf115，如图1所示。

质粒pmf115的构建方法如下：

1、首先根据侵染小麦的小麦矮缩病毒(wheatdwarfvirus)基因组序列(genbank登录号：dq868525.1)设计合成小间区sir(seqno.1)、大间区lir(seqno.2)和复制相关蛋白rep/repa(seqno.3)三个dna片段。

小间区(sir)dna片段由华大基因(http://www.genomics.cn/)合成，并克隆在质粒pjwr上；

大间区(lir)dna片段由华大基因合成，并克隆在质粒pmv上；

复制相关蛋白rep/repa的dna片段，原基因dna序列所含有的bsai位点已经消除。该片段由华大基因合成，并克隆在质粒pmv上。

2、将上述含有小间区sir的质粒经ecori和psti双酶切后，回收约190bp的片段，与经ecori和psti双酶切后的pgreenii0179(https://en.wikipedia.org/wiki/pgreen)片段进行连接，得到质粒0179-sir。克隆片段经dna测序验证。

3，将上述含有大间区lir片段的质粒经kpni和xhoi酶切后，回收约420bp的片段，与经kpni和xhoi酶切后的0179-sir片段进行连接，得到质粒0179-lir-sir。克隆片段经dna测序验证。

4，合成下列pcr引物：

f-lir-sacii：5’-taccgcggggtagtgaacagaagtccg-3’；

r-lir-saci：5’-tagagctccgagatgggctcccacgc-3’；

采用f-lir-sacii和r-lir-saci作为引物，以上述质粒0179-lir-sir为模板进行pcr扩增，得到的pcr扩增片段经sacii和saci酶切，再与经同样酶切的0179-lir-sir片段进行连接，得到质粒0179-lir-sir-lir，命名为pmf096。克隆片段经dna测序验证。

5，合成下列单链dna片段：

f-pc：5’-tcgacccgggggatccactagttctagagcggccgc-3’；

r-pc：5’-agcttgcggccgctctagaactagtggatcccccggg-3’。

将f-pc和r-pc分别溶解配制成10μmol/l浓度，各取2μl混匀成4μl，95℃变性5min，慢退火(pcr反应升至95℃后直接停止关机，30分钟后取出放在室温)，与经sali和hindiii双酶切的质粒pmf096片段连接，获得在左边大间区lir和小间区sir中间含有多克隆位点区xhoi、sali、smai/xmai、bamhi、spei、xbai、noti、hindiii、ecorv的质粒，pmf114。克隆片段经dna测序验证。

6，将上述含有复制相关蛋白rep/repa合成dna片段的质粒经sacii和psti双酶切后，与上述pmf114质粒经sacii和psti双酶切后回收的片段连接，最终得到所需质粒pmf115，序列为seqno.4。克隆片段经dna测序验证。

二、构建一种用于植物基因组编辑载体的质粒pmf125，如图2所示。

pmf125是把质粒pylcrispr/cas9pubi-h(华南农业大学刘耀光教授惠赠，genbank登录号：kr029109)中编码cas9的第10位氨基酸天冬氨酸突变成丙氨酸(d10a)，使得cas9核酸酶突变为切口酶后的质粒。

pmf125的构建方法如下：

1、用bamhi酶切pylcrispr/cas9pubi-h质粒，得到约10kb和6.2kb两个片段，6.2kb片段与质粒puc19经bamhi酶切并去磷酸化的片段连接，得质粒t-p-cas9p。10kb片段经去磷酸化处理备用。

2，合成如下pcr引物：

f-p-cas9p：5’-ctgagctagcgttcgtacacggat-3’；

r-p-cas9p：5’-atgcgctagctccaccgtcaatgta-3’；

f-cas9pd10a：5’-tccatcggcctcgctatcggcaccaac-3’；

r-cas9pd10a：5’-gttggtgccgatagcgaggccgatgga-3’。

以pylcrispr/cas9pubi-h质粒为模板，分别用引物f-p-cas9p和r-cas9pd10a、f-cas9pd10a和r-p-cas9p进行pcr扩增，分别得到970bp片段1和1100bp片段2；将片段1和片段2等摩尔比混合作为模板，再用引物f-p-cas9p和r-p-cas9p进行pcr扩增，得到长约2100bp的片段；该片段经nhei酶切与上述第一步质粒t-p-cas9p经nhei酶切去磷酸化处理的大片段连接，得到质粒t-p-cas9pm。此克隆片段经dna测序验证。

3，质粒t-p-cas9pm经bamhi酶切，回收6.2kb的片段，与上述第一步得到的10kb大片段连接，从而获得载体质粒pmf125，序列为seqno.5。

使用上述pmf115(或者pmf096和pmf114)和pmf125两个质粒，就可以构建用于精确修饰、编辑的植物细胞基因组dna的载体。

实施例2

如图11所示，在水稻基因组第6染色体上存在着一个稻瘟病抗性基因位点，该位点的变异对水稻稻瘟病的许多不同的生理小种产生抗性，在水稻稻瘟病抗性中有着重要作用。

本实施例通过本发明的载体，将人工设计的dna片段重组到位点，达到对抗病基因进行修饰、改良的目的。具体操作步骤如下：

一、编辑载体的构建

第一步，根据一个水稻基因组稻瘟病抗性位点的dna序列(seqno.6)确定sgrna的目标序列：

sgrna-1(正向)：5’-ttgagtagcaaactaaaggaagg-3’；

sgrna-2(反向互补)：5’-cctcccctactaaggacactcag-3’；

第二步，依据确定的靶位点构建两个sgrna表达盒：

①sgrna-1表达盒

合成如下引物：

u-f：5’-ctccgttttacctgtggaatcg-3’；

gr-r：5’-cggaggaaaattccatccac-3’；

grpiz-1：5’-ttgagtagcaaactaaaggagttttagagctagaaat-3’

u6apiz-1：5’-tcctttagtttgctactcaacggcagccaagccagca-3’

pps-ggl：5’-ttcagaggtctctctcgatggaatcggcagcaaagg-3’；

pps-gg2-1：5’-agcgtgggtctcgtcagggtccatccactccaagctc-3’。

pcr一扩：分别以u-f和u6apiz-1、grpiz-1和gr-r分别为引物，以pylgrna-osu6a质粒为模板扩增，分别获得片段1和片段2；pcr二扩：以等量片段1加片段2为模板，用pps-ggl和pps-gg2-1为引物扩增；获得pcr片段用bsai酶切，得到osu6a+sgrna-1如下所示：

②sgrna-2表达盒

合成如下引物：

grpiz-2：5’-ctgagtgtccttagtagggggttttagagctagaaat-3’

u6bpiz-2：5’-cccctactaaggacactcagcaacacaagcggcagc-3’

pps-gg2-2：5’-ttcagaggtctctctgacactggaatcggcagcaaagg-3；’

pps-gg3-1：5’-agcgtgggtctcgtcttcactccatccactccaagctc-3’。

pcr一扩：分别以u-f和grpiz-2、u6bpiz-2和gr-r分别为引物，以pylgrna-osu6b质粒为模板扩增，分别获得片段3和片段4；pcr二扩：以等量片段3加片段4为模板，用pps-gg2-2和pps-gg3-1为引物扩增；获得pcr片段用bsai酶切，得到osu6b+sgrna-2如下所示：

③将①和②中两个sgrna表达盒片段与质粒pmf125经bsai酶切片段连接，得重组质粒就含有2个sgrna表达盒(5’-3’方向)如下，该质粒命名为pmf138。

第三步，克隆重组片段hr

依据来自水稻抗稻瘟病基因位点的dna序列，采用dna合成和pcr扩增相结合的方法构建同源重组的dna片段。本发明分别构建4个不同的重组片段。如下图7所示它们在5’端的一部分(hr1)和3’端一部分(hr2)完全相同，中间为有差异的片段。具体操作如下：

①合成如下pcr引物，用于扩增hr1和hr2片段：

zj01：5’-tagactcttgggtctgtcaccaaaaatagctaatgatcg-3’；

zj02：5’-ggagagagctcgcagtcgcaggtgatcacgttg-3’；

m13r：5’-agcggataacaatttcacacagga-3’；

pi2f：5’-cgatgccataacattgctactgag-3’。

②以有稻瘟病抗性位点dna片段的质粒82779b-r1-4为模板，以pi2f和zj01为一对、zj02和m13r为一对引物，分别进行pcr扩增，分别得到600多bp的hr1片段(seqno.7)和200多bp的hr2片段(seqno.8)。

③依据确定的稻瘟病抗性基因的dna序列合成pi9c(seqno.9)、pi50c(seqno.10)、pigm-6(seqno.11)和pigm-8(seqno.12)。

④合成序列如下的pcr引物，用于扩增全长重组片段(hr)：

pi2f-hr：5’-cgaggtcgacccgggggatcccgatgccataacattgct-3’；

m13r-hr：5’-atcaagcttgcggccgctctagacaggaaacagctatgacc-3’。

⑤以步骤②中克隆得到的hr1和hr2分别与步骤③合成的pi9c、pi50c、pigm-6和pigm-8合做模板，以pi2f-hr和m13r-hr为引物进行pcr扩增，分别得到四条约2000bp左右的dna片段，回收这些dna片段分别与pmf115经bamhi和xbai双酶切的产物进行同源重组克隆得重组质粒，pmf115-pi9c的命名为pmf140，pmf115-pi50c的命名为pmf141，pmf115-pigm-6命名为pmf146，pmf115-pigm-8命名为pmf147。pcr克隆片段经测序验证。

第四步，将重组片段(hr)及相关dna片段克隆到上述pmf138质粒

①合成序列如下的pcr引物。

f-0179-hr：5’-ggagtggatggatactagttagggcgaattgggtacc-3’；

r-0179-hr：5’-gccaatgataccgacgcgtgaacaaaagctggagctc-3’。

②用引物f-0179-hr和r-0179-hr，分别以第三步构建好的pmf140、pmf141、pmf146和pmf147质粒为模板进行pcr扩增，均得到4000多bp的条带，回收这些dna片段与第二步构建好的质粒pmf138经mlui和spei双酶切片段进行同源重组连接，即获得稻瘟病基因位点dna编辑载体，依次分别命名为pmf144、pmf145、pmf151和pmf152。克隆pcr片段经测序验证。

三、编辑载体转入农杆菌

1，农杆菌感受态细胞的制备

取出-80℃保存农杆菌lba4404，接种在含有50mg/l利福平lb培养基培养皿培养(28℃，2-3天)。挑出培养lba4404单菌落接种于50ml含50mg/l利福平液体lb培养基振动培养(28℃，150rpm)，当农杆菌夜od600＝0.5，转入无菌50ml离心管离心(4000rpm，4min，4℃)，去除上清液，加入5ml在冰水上预冷0.15mol/lnacl，轻微震荡悬浮细菌细胞，充分混匀后再次离心(4000rpm，4min，4℃),得到的菌体中再次加入0.15mnacl悬浮细胞，再离心收集菌体(4000rpm，4min，4℃)；最后，在得到的菌体中加入冰水上预冷20mmol/lcacl2溶液600μl，悬浮细菌细胞，加入dmso(7％)混匀，分装于1ml的ep管，每管100μl；置于入液氮冷冻后立即冻存于-80℃低温冰箱备用。

2，载体质粒转化农杆菌

从-80℃低温冰箱取出农杆菌lab4404感受态细胞，加入1μg左右编辑载体质粒，所述编辑载体质粒选择pmf144、pmf145、pmf151、pmf152中的任意一种，混匀后置于冰水30min；然后置入液氮冷冻1min，取出于37℃水浴至解冻，解冻后再次放入液氮冷冻1min，取出后37℃水浴至解冻，置于冰水2min后加入1mllb培养基振动培养3-4h(28℃，140rpm)；离心分离菌体，加入100μllb液体培养基重悬，涂在含100mg/l卡那霉素+50mg/l链霉素的lb平板上培养(28℃，2-3天)长出菌落；取单个菌接种于含有100mg/l卡那霉素+50mg/l链霉素的液体lb(28℃，140rpm)培养培养16h，取2μl菌液进行pcr验证，阳性克隆在-80℃保存备用。

阳性克隆采用pcr方法检测潮霉素标记基因，pcr反应总体积50μl，按厂商(takara,rr001a)说明配制。pcr扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。阳性克隆可以得到片段大小为800多bp左右的dna片段。

其中引物如下：

hptii-f：5’-cgatttgtgtacgcccgacagtc-3’；

hptii-r：5’-cgatgtaggagggcgtggatatg-3’。

四、编辑载体质粒的农杆菌转化水稻

1，水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养

水稻成熟种子去壳，在70％乙醇浸泡30sec，然后在0.1％升汞中浸泡10min，无菌水冲洗7-8次，种子取出放在培养皿的无菌滤纸上吸干水分，接种到愈伤组织的诱导培养基上，29℃光照培养15d。切取成熟胚盾片长出的愈伤组织，并切成2-4mm的小块，再转接种到诱导培养基上培养3d。

诱导培养基：n6+300mg/l水解酪蛋白+2.8g/ll-脯氨酸+30g/l蔗糖+2mg/l2,4-d+4g/l植物凝胶，ph5.8。

2，农杆菌的培养和准备

将上述编辑载体的农杆菌lba4404取出，接种在含有50mg/l链霉素+100mg/l卡那霉素的lb培养皿上培养(19℃，3d)。用接种环挑取少量农杆菌悬浮于15ml加入100μmol/l乙酰丁香酮的浸染培养基，菌液浓度控制在od550＝0.06-0.08。此菌液将用于下一步浸染水稻愈伤组织。

浸染培养基：n6+0.7g/ll-脯氨酸+68.4g/l蔗糖+36g/l葡萄糖+1.5mg/l2,4-d，ph5.2。

3，农杆菌浸染与共培养

将上述预培养的水稻愈伤组织转入50ml的离心管中，加入含有100μmol/l乙酰丁香酮浸染培养基10ml振荡均匀，然后去除液体；将上述准备好的10ml农杆菌悬浮液倒入，轻轻摇3min，倒掉菌液。将愈伤组织取出，放入培养皿的无菌滤纸上吸去多余菌液，愈伤组织转入共培养基培养(19℃，3d)。

共培养基：n6+300mg/l水解酪蛋白+2.8g/ll-脯氨酸+30g/l蔗糖+10g/l葡萄糖+2mg/l2,4-d+100μmol/l乙酰丁香酮+4g/l植物凝胶，ph5.8。

4，洗菌与抗性愈伤组织的筛选

共培养三天后取出愈伤组织，先用无菌水洗7-8次，再用加有250mg/l羧苄青霉素和10mg/l万古霉素的浸染培养基洗一次，然后愈伤组织转放到培养皿的无菌滤纸上吸去多余的液体，转入加50mg/l潮霉素和250mg/l羧苄基青霉素的筛选培养基培养(29℃，14d)。14天后愈伤组织转入筛选培养基再次筛选培养。

筛选培养基：n6+300mg/l水解酪蛋白+2.8g/ll-脯氨酸+30g/l蔗糖+2mg/l2,4-d+4g/l植物凝胶，ph5.8。

5，抗性愈伤组织的分化

将经两轮筛选后长出的旺盛抗性愈伤组织，转入含有50mg/l潮霉素、100mg/l头孢菌素和150mg/l羧苄青霉素的再生培养基上，在29℃光照下，经14-20天左右的培养，分化出绿色斑点，30天左右进一步分化成小苗。

再生培养基：ms+2g/l水解酪蛋白+30g/l蔗糖+30g/l山梨醇+2.0mg/l激动素+0.02mg/l萘乙酸+4g/l植物凝胶，ph5.8。

6，转化植株的壮苗及移栽

当分化的芽长至约2-4cm时，将其转移至生根培养基，29℃光照培养2-3周。试管苗长到约8cm左右，打开试管炼苗3-4天，取出小苗用清水洗去植株根系上的培养基，移栽至土壤，温室培养，获得编辑潮霉素抗性基因的植株。

生根培养基：1/2ms+20g/l蔗糖+0.5mg/l萘乙酸+4g/l植物凝胶，ph5.8。

五、转基因水稻植株的筛选鉴定

1，水稻植株总dna提取

水稻植株dna提取采用ctab法。ctab裂解液组成如下：1.4mol/lnacl，0.1mol/ltris-hcl，20mmol/ledta，2％十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，2％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，1％(v/v)β-巯基乙醇。

具体步骤如下：取水稻上述转化水稻幼苗植株嫩叶片100mg于1.5ml离心管，在液氮中将其研磨成粉，加入600μl预热(65℃)的ctab裂解液，涡旋震荡混匀，放入65℃水浴处理1h，取出加入600μl氯仿：异戊醇(24：1)，反复颠倒混匀，然后离心(10000rpm，15min)，取上清于1.5ml离心管，加入等体积的预冷异丙醇混匀，冰水上放置30min，离心(12000rpm，10min)沉淀dna，去除上清液再加入1ml75％乙醇洗涤dna沉淀，移去酒精风干后加入100μlte溶解dna，-20℃储存备用。

2，转化植株的pcr鉴定

①潮霉素标记基因pcr检测

转基因植株含有潮霉素筛选标记基因，采用如下潮霉素基因特异引物(hptii-f，hptii-r)进行pcr扩增，真正的转基因植物可以得到片段大小为800多bp左右的dna片段，而转基因假阳性水稻无法扩增出这样的dna片段。hptii-f和hptii-r引物如下：

hptii-f：5’-cgatttgtgtacgcccgacagtc-3’；

hptii-r：5’-cgatgtaggagggcgtggatatg-3’。

pcr反应总体积50μl按厂商(takara，货号：rr001a)说明配制。pcr扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察，如图8所示。

②cas转基因的pcr检测

使用如下转入基因cas9的特异引物(f-lcas9-rt，r-lcas9-rt)进行pcr检测，转基因阳性植物可以得到片段大小约为600bp左右的dna片段，阴性植物和非转基因水稻为无法扩增出这个dna片段。f-lcas9-rt和r-lcas9-rt引物如下：

f-lcas9-rt：5’-gaagcggaaggttggtatt-3’；

r-lcas9-rt：5’-ttgtccacgtcggagttat-3’。

pcr反应总体积50μl，按厂商(takara，货号：rr001a)说明配制。pcr扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察，如图9所示。

六，转基因植株中稻瘟病抗性基因dna编辑的鉴定

使用特异的引物(f-piz800，r-piz2607)，pcr方法检测pmf145转化得到的转基因郑旱10号水稻植株，得到1800bp左右的dna片段，该片段克隆到pmd19-t载体(takara，货号：6013)，选取转化大肠杆菌的阳性菌落，提取重组质粒dna测序。

f-piz800和r-piz2607引物序列如下：

f-piz800：5’-agaagggcagtcggatagta-3’；

r-piz2607：5’-atcttttccaacaggggtgag-3’

pcr反应总体积50μl，按厂商(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：p112-03)说明配制。pcr扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min。

测序结果如图10所示，在转基因水稻植株中存在着设计的重组dna片段与原基因组抗稻瘟病位点dna的重组发生，实验证明本发明的载体通过转化水稻，在转化植株中外源重组dna的确可以重组到水稻基因组，实现对基因组dna的定点编辑、修饰。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>四川省农业科学院生物技术核技术研究所

成都亿农农业科技有限公司

<120>一种用于植物基因组编辑载体、及其构建方法和应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>190

<212>dna

<213>人工序列(1)

<400>1

gaattctaataaaataatattttatttatctcatgtcattcgattacagaggctcggcta60

cgagcaaagacaaaccaaattataacaaacaacaacccttacacaatgacatcggaaaag120

gaaatacaacaccctgagatattacatttatagaaactgtacgccgtccgcgctaggaca180

gtcactgcag190

<210>2

<211>421

<212>dna

<213>人工序列(2)

<400>2

ggtaccggtagtgaacagaagtccggcaggtccttagcgaaaaaacggggtgtgccagaa60

aactctatgctctaccctgcgtggaggtgtgaattctgcacactgcaaatgcaatgtgtc120

caatgatttatatagggcaggttttggcgggagaacagggccctagtgttcccacggtag180

cgtagcgaatcgtgtgggccctgttaggtgtgcggtcgggtggcctccacgcgggttata240

atattaccccgcgtggtggcccccgacgcgcactcggcttttcgtgagtgcgcggaggct300

tttggaccacatcttttctgatcactttcgtgaaagatggtgatttatcacacttttgat360

gtggaaatgtgtgccatgccttagcttataaggaagtgcgtgggagcccatctcgctcga420

g421

<210>3

<211>1199

<212>dna

<213>人工序列(3)

<400>3

ccgcggatggcctcttcatctacacccaggttccgagtctattccaagtacctctttcta60

acatatcctcaatgtacccttgagccacagtacgccttggattcacttcgcactctcttg120

aacaaatatgagcccctctacatcgctgctgttagagagctccacgaagatggatcacca180

catctgcacgttctcgtgcagaacaagcttcgtgcttccatcaccaatcccaatgcctta240

aacctccgtatggatacatctccattctccatattccatcctaatatacaagctgccaaa300

gactgcaaccaagttcgtgattacatcacgaaggaggttgactccgatgtaaacacagct360

gagtggggaacattcgtggctgtttcaactccaggtcgtaaagaccgtgatgcggatatg420

aaacagatcattgaatctagttcctctcgcgaggaattcctcagcatggtttgcaatcgt480

tttccgtttgaatggtctatccgtctcaaagacttcgagtacacggcacgccatctattt540

cctgacccagttgccacttacacacctgagtttccaaccgaatcactcatttgccatgag600

actattgaaagctggaaaaatgaacatctatactctgtaagcctcgaatcctatatcctt660

tgtacttccactcctgcggatcaagcgcaatctgacttagagtggatggacgattattcc720

aggagtcaccggggaggcataagtccatctacatctgcgggccaaccagaacaggaaaga780

cttcctgggcaaggtctttagggacacataattattataacagtctagttgacttcacaa840

catatgacgtcaacgccaagtataatatcatcgacgacattccattcaagttcacaccca900

actggaagtgcttcgtcggggctcagcgtgacttcacggtcaatccaaaatacggtaagc960

gaaaagtgatacggggtggcataccttgcatcattttagttaatccagacgaagattggc1020

tcaaggatatgactcccgaacagtcggattacatgtactctaacgctgttgttcactaca1080

tgtatgaaggcgagacgttcatcaactactcgttcgcctccggcgaagatgtcactgctt1140

cgcagtgaactagtcgatccaggcctcccagctttcgtccgtatcatcggtttctgcag1199

<210>4

<211>7297

<212>dna

<213>人工序列(4)

<400>4

agctctcatcaaccgtggctccctcactttctggctggatgatggggcgattcaggcgat60

ccccatccaacagcccgccgtcgagcgggcttttttatccccggaagcctgtggatagag120

ggtagttatccacgtgaaaccgctaatgccccgcaaagccttgattcacggggctttccg180

gcccgctccaaaaactatccacgtgaaatcgctaatcagggtacgtgaaatcgctaatcg240

gagtacgtgaaatcgctaataaggtcacgtgaaatcgctaatcaaaaaggcacgtgagaa300

cgctaatagccctttcagatcaacagcttgcaaacacccctcgctccggcaagtagttac360

agcaagtagtatgttcaattagcttttcaattatgaatatatatatcaattattggtcgc420

ccttggcttgtggacaatgcgctacgcgcaccggctccgcccgtggacaaccgcaagcgg480

ttgcccaccgtcgagcgccagcgcctttgcccacaacccggcggccggccgcaacagatc540

gttttataaatttttttttttgaaaaagaaaaagcccgaaaggcggcaacctctcgggct600

tctggatttccgatccccggaattagagatcttggcaggatatattgtggtgtaacgtta660

tcgatctggattttagtactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaag720

tattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttatatgctcaacacatgagcgaaac780

cctataagaaccctaatttcccttatcgggaaactactcacacattatttatggagaaaa840

tagagagagatagatttgtagagagagactggtgatttcagcgtaccgaattaattctcc900

cgcgaccagccgagcgagcttagcgaactgtggacgagaactgtgccaccaagcgtaagg960

ccgttctctcgcatttgccttgctaggctcgcgcgagttgctggctgaggcgttctcgaa1020

atcagctcttgttcggtcggcatctactctattcctttgccctcggacgagtgctggggc1080

gtcggtttccactatcggcgagtacttctacacagccatcggtccagacggccgcgcttc1140

tgcgggcgatttgtgtacgcccgacagtcccggctccggatcggacgattgcgtcgcatc1200

gaccctgcgcccaagctgcatcatcgaaattgccgtcaaccaagctctgatagagttggt1260

caagaccaatgcggagcatatacgcccggaggcgtggcgatcctgcaagctccggatgcc1320

tccgctcgaagtagcgcgtctgctgctccatacaagccaaccacggcctccagaagaaga1380

tgttggcgacctcgtattgggaatccccgaacatcgcctcgctccagtcaatgaccgctg1440

ttatgcggccattgtccgtcaggacattgttggagccgaaatccgcgtgcacgaggtgcc1500

ggacttcggggcagtcctcggcccaaagcatcagctcatcgagagcctgcgcgacggacg1560

cactgacggtgtcgtccatcacagtttgccagtgatacacatggggatcagcaatcgcgc1620

atatgaaatcacgccatgtagtgtattgaccgattccttgcggtccgaatgggccgaacc1680

cgctcgtctggctaagatcggccgcagcgatcgcatccatagcctccgcgaccggctgaa1740

gaacagcgggcagttcggtttcaggcaggtcttgcaacgtgacaccctgtgcacggcggg1800

agatgcaataggtcaggctctcgctgaactccccaatgtcaagcacttccggaatcggga1860

gcgcggccgatgcaaagtgccgataaacataacgatctttgtagaaaccatcggcgcagc1920

tatttacccgcaggacatatccacgccctcctacatcgaagctgaaagcacgagattctt1980

cgccctccgagagctgcatcaggtcggagacgctgtcgaacttttcgatcagaaacttct2040

cgacagacgtcgcggtgagttcaggctttttcatagggatcagcttgggctgtcctctcc2100

aaatgaaatgaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcg2160

tcatcccttacgtcagtggagatgtcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttgga2220

acgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcg2280

gcagaggcatcttgaatgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggagcca2340

ccttccttttctactgtcctttcgatgaagtgacagatagctgggcaatggaatccgagg2400

aggtttcccgaaattaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtcttctgagact2460

gtatctttgacatttttggagtaggggtacgataacattaacgtttacaatttcgcgcca2520

ttcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctatt2580

acgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggtt2640

ttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattgtaatacgactcactataggg2700

cgaattggtaccggtagtgaacagaagtccggcaggtccttagcgaaaaaacggggtgtg2760

ccagaaaactctatgctctaccctgcgtggaggtgtgaattctgcacactgcaaatgcaa2820

tgtgtccaatgatttatatagggcaggttttggcgggagaacagggccctagtgttccca2880

cggtagcgtagcgaatcgtgtgggccctgttaggtgtgcggtcgggtggcctccacgcgg2940

gttataatattaccccgcgtggtggcccccgacgcgcactcggcttttcgtgagtgcgcg3000

gaggcttttggaccacatcttttctgatcactttcgtgaaagatggtgatttatcacact3060

tttgatgtggaaatgtgtgccatgccttagcttataaggaagtgcgtgggagcccatctc3120

gctcgaggtcgacccgggggatccactagttctagagcggccgcaagcttgatatcgaat3180

tctaataaaataatattttatttatctcatgtcattcgattacagaggctcggctacgag3240

caaagacaaaccaaattataacaaacaacaacccttacacaatgacatcggaaaaggaaa3300

tacaacaccctgagatattacatttatagaaactgtacgccgtccgcgctaggacagtca3360

ctgcagaaaccgatgatacggacgaaagctgggaggcctggatcgactagttcactgcga3420

agcagtgacatcttcgccggaggcgaacgagtagttgatgaacgtctcgccttcatacat3480

gtagtgaacaacagcgttagagtacatgtaatccgactgttcgggagtcatatccttgag3540

ccaatcttcgtctggattaactaaaatgatgcaaggtatgccaccccgtatcacttttcg3600

cttaccgtattttggattgaccgtgaagtcacgctgagccccgacgaagcacttccagtt3660

gggtgtgaacttgaatggaatgtcgtcgatgatattatacttggcgttgacgtcatatgt3720

tgtgaagtcaactagactgttataataattatgtgtccctaaagaccttgcccaggaagt3780

ctttcctgttctggttggcccgcagatgtagatggacttatgcctccccggtgactcctg3840

gaataatcgtccatccactctaagtcagattgcgcttgatccgcaggagtggaagtacaa3900

aggatataggattcgaggcttacagagtatagatgttcatttttccagctttcaatagtc3960

tcatggcaaatgagtgattcggttggaaactcaggtgtgtaagtggcaactgggtcagga4020

aatagatggcgtgccgtgtactcgaagtctttgagacggatagaccattcaaacggaaaa4080

cgattgcaaaccatgctgaggaattcctcgcgagaggaactagattcaatgatctgtttc4140

atatccgcatcacggtctttacgacctggagttgaaacagccacgaatgttccccactca4200

gctgtgtttacatcggagtcaacctccttcgtgatgtaatcacgaacttggttgcagtct4260

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