人间皮素嵌合抗原受体、其T细胞及其制备方法和用途与流程

本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种将t细胞进行基因工程以表达嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)用于治疗与间皮素的表达相关的疾病。

背景技术：

2011年，癌症超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。who在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。

针对肿瘤，传统的手术切除、化疗、放射线治疗，对正常组织有伤害，具有局限性，效果有限。近年来出现的靶向疗法在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，不会伤及肿瘤周围的正常组织细胞；但分子靶向药物有效性低，某种药物只能对特定突变基因型肿瘤产生作用；肿瘤基因突变产生药物耐受性导致长期的治疗效果下降；存在严重的不良反应；部分肿瘤不能通过靶向药物得到有效治疗。新的免疫疗法正能够解决这些问题。

肿瘤免疫治疗通过调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤能力，从而控制和杀伤肿瘤细胞；当免疫系统由于自身或肿瘤细胞原因被削弱时，为肿瘤的发生提供有利条件。肿瘤免疫疗法即通过加强免疫系统在各步骤中对肿瘤细胞的识别与杀伤能力。近年来，随着干细胞生物学、免疫学、分子技术、组织工程技术等的快速发展，细胞免疫治疗作为一种安全而有效的治疗手段，在肿瘤等治疗中的作用越来越突出。当前，新型细胞治疗技术的研究和开发已经成为解决肿瘤等相关疾病的重要研究领域。

2013年免疫抗癌疗法被science杂志评为年度10大科技突破之首。自2013年以来，肿瘤细胞及免疫疗法不断获得突破性进展，临床研究也取得了巨大成功，是当前肿瘤治疗领域最具前景的治疗手段，有望成为继手术、放化疗方法后的新的常规治疗方法。细胞治疗方法包括非特异性免疫疗法和特异性免疫疗法。后者又包括单克隆抗体，过继细胞疗法(act)：til(肿瘤浸润淋巴细胞)、car-t和tcr(t细胞受体)，dc(树突状细胞)疫苗和肿瘤疫苗等。

肿瘤特异性ctl(细胞毒性t淋巴细胞)细胞是体内杀伤肿瘤细胞的直接效应细胞，通过细胞表面的tcr识别肿瘤细胞表面呈递的肿瘤抗原和hla分子复合物，激活ctl细胞内一系列反应，通过分泌穿孔素、颗粒酶等直接杀伤肿瘤细胞。近年来科学家们研究了肿瘤突变产生的新表位对机体抗肿瘤作用的影响，有望推动肿瘤特异性t细胞治疗技术的进步和临床应用。现有临床研究表明，肿瘤组织处肿瘤特异性突变，尤其是免疫原性区域抗原的突变，能够产生新的、肿瘤特异性抗原，这些抗原能够激发体内特异性t细胞免疫反应，产生的t细胞表面tcr亲和力较高，从而有效发挥肿瘤细胞杀伤功能。然而肿瘤组织处的免疫耐受环境限制了特异性t细胞的有效激活和功能发挥，需要体外环境下实施人为干预，对突变抗原特异性t细胞进行体外扩增和活化。

新鲜外周血中cd4+/cd8+t细胞比例约为2:1。在t细胞分化过程中，t细胞经历t细胞、效应性t细胞、效应性记忆性t细胞和中枢记忆性t细胞的不同时期，其分化增殖的能力各不相同。t细胞分化过程中，其细胞表面标识发生逐渐变化，表现为cd45ra由阳性逐渐变为阴性，而cd62l逐渐由阴性变为阳性，双染色分析表现为：细胞表征为cd45ra+/cd62l+；效应性t细胞表征为cd45ra+/cd62l-；效应性记忆性t细胞表征为cd45ra-/cd62l-；中枢记忆性t细胞表征为cd45ra-/cd62l+。在免疫细胞治疗过程中，终末分化的t细胞由于其分化增殖能力相对较差，而早期t细胞能够快速反应并且能够大量增殖，对于肿瘤等的治疗具有更加持久的作用时间，t细胞培养过程中产生的t细胞分群对于后期免疫细胞治疗效果具有重要意义，含有较高含量的早期t细胞同时富集cd4+/cd8+t细胞的培养方法在临床上具有需求。

细胞免疫治疗目前已经广泛开展，从早期的lak细胞治疗尝试，发展到cik(细胞因子诱导的杀伤细胞)、dc-cik细胞治疗等。cik细胞由ifn-γ，il-2及抗-cd3抗体(okt3)刺激后分化产生，其中在第0天加入1,000iu/ml的ifn-γ，24小时后加入50ng/mlokt3和300iu/mlil-2，中间间隔2天加入含il-2的新鲜培养基，之后经过2-3周的培养可得到cik细胞。

嵌合抗原受体修饰的t细胞治疗方法(car-t)是提取患者外周血中的普通t细胞，通过病毒载体引入新的基因，使其表达能够识别癌细胞抗原的受体，在受体另一端嵌合激活t细胞的元件，并在嵌合蛋白中引入多个共刺激分子，使得t细胞的生存能力、增殖能力、记忆效应增强，从而激活引导t细胞寻找杀死癌细胞。car-t细胞使用特异性抗原不依赖于hla复合体的抗体轻链和重链的单链可变区(scfv)。一代car包括scfv，一段跨膜区，cd3ζ链(tcr复合体的信号域)，仅可向t细胞提供1类刺激信号，对于重复抗原刺激，可能导致t细胞无反应；二代car包括额外的共刺激区域，可提供针对靶向抗原的scfv的2类刺激信号。目前常用的共刺激分子有cd28或41bb的信号域，其他的分子也在研究。现有临床试验均采用二代car；另外，还有三代car加入两个共刺激区域，还包括其他基因，编码可提高t细胞存活或调节肿瘤微环境的蛋白等。

mesothelin(msln，间皮素)是一个通过糖磷脂酰肌醇区域(gpidomain)连接在细胞膜上的糖蛋白。msln基因首先合成71kda细胞表面蛋白，然后n端被弗林蛋白酶切除后，40kda的c端留在细胞膜上，可溶的31kda的n端片段mpf(megakaryoticpotentiatingfactor，巨核细胞增强因子)被释放。msln在正常的组织中并非必须的，在包括间皮在内的正常成人组织中存在很少，但在例如间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌中不正常的大量表达(changk,pastani.molecularcloningofmesothelin,adifferentiationantigenpresentonmesothelium,mesotheliomas,andovariancancers.procnatlacadsciusa1996；93:136–40.)。过量的间皮素表达首先在间皮瘤和卵巢癌中被发现，之后又相继在肺癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、胆道癌、子宫内膜癌、胸腺癌、结肠癌、乳腺癌中被发现(morelloa,sadelainm,adusumillips.mesothelin-targetedcars:drivingtcellstosolidtumors[j].cancerdiscovery,2015,6(2).)。间皮素的表达在90％的类上皮恶性胸膜间皮瘤，69％肺腺癌，60％乳癌，46％食道癌中被发现(morelloa,sadelainm,adusumillips.mesothelin-targetedcars:drivingtcellstosolidtumors[j].cancerdiscovery,2015,6(2))。间皮素在更具有侵略性的肺癌，乳腺癌(三阴性乳腺癌)和食道癌(高度发育不良和腺癌)中表达得更普遍。在这些癌症细胞中，间皮素一般会在癌腔内、细胞膜或细胞质中表达。因此，间皮素作为一个肿瘤抗原，是car-t一个良好的靶点。

当前，car-t细胞免疫治疗技术已经成为国际肿瘤治疗研究的热点领域。开展car-t细胞治疗技术研发对于提高医疗卫生专业技术和理论水平，推动高端生物医疗产业发展是一个重要的契机。

因此，体外高效制备间皮素嵌合抗原受体t细胞(carmesothelin-t)细胞并进行体外和动物试验功能检测，获得高效car-t细胞的技术和试剂的开发，对于提高肿瘤治疗效果具有重要意义。

为了解决上述问题，本发明发明人提供了一种体外高效制备carmesothelin-t细胞的方法及其检测和应用。

技术实现要素：

本发明第一方面提供了一种编码嵌合抗原受体(car)的核酸分子，其中所述的car包含：i)含有人抗间皮素结合结构域的抗体或抗体片段，ii)跨膜结构域，和细胞内信号传导结构域，其特征在于所述的抗间皮素结合结构域由包含一个或多个含有或选自以下的重链互补决定区(cdr)序列和/或轻链互补决定区(cdr)序列编码：

(a)包含seqidno:1所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(cdr)1；包含seqidno:2所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(cdr)2；包含seqidno:3所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(cdr)3；包含seqidno:4所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(cdr)1；包含seqidno:5所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(cdr)2；和包含seqidno:6所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(cdr)3；

(b)包含seqidno:7所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(cdr)1；包含seqidno:8所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(cdr)2；包含seqidno:9所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(cdr)3；包含seqidno:10所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(cdr)1；包含seqidno:11所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(cdr)2；和包含seqidno:12所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(cdr)3；

(c)包含seqidno:13所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(cdr)1；包含seqidno:14所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(cdr)2；包含seqidno:15所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(cdr)3；包含seqidno:16所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(cdr)1；包含seqidno:17所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(cdr)2；和包含seqidno:18所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(cdr)3。

优选地，所述的抗间皮素结合结构域含有由上述重链互补决定区(cdr)1、重链互补决定区(cdr)2和重链互补决定区(cdr)3组成的重链可变区序列和/或由上述轻链互补决定区(cdr)1、轻链互补决定区(cdr)2和轻链互补决定区(cdr)3组成的轻链可变区序列，或分别由其组成。

优选地，所述的重链互补决定区(cdr)序列和轻链互补决定区(cdr)序列之间由连接序列(linker)进行连接，所述的连接序列可以是本领域公知的连接序列，例如，连接序列可以是ggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggc。

优选地，所述的抗间皮素结合结构域的抗体或抗体片段：

(a)与seqidno:31的序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

(b)与seqidno:33的序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

(c)与seqidno:35的序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

优选地，所述的重链互补决定区(cdr)序列和轻链互补决定区(cdr)序列之间由连接序列(linker)进行连接，所述的连接序列可以是本领域公知的连接序列，例如，连接序列可以是ggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggc。

优选地，所述的核酸分子为分离的核酸分子。

本发明第二方面提供了嵌合抗原受体(car)，其含有由上述的核酸分子编码的氨基酸序列。本领域技术人员可以理解的是本发明的范围涵盖了编码所述的氨基酸序列的核苷酸序列，在本发明公开内容的基础上这样的序列是容易由本领域技术人员获得的。

本发明第三方面提供了含有所述的嵌合抗原受体的t细胞。

本发明第四方面提供了载体，其包含所述的核酸分子；优选地，所述载体为病毒载体；更优选地，所述载体为慢病毒载体。

本发明第五方面提供了一种宿主细胞，其包含所述的载体；优选地，所述宿主细胞是人t细胞；更优选地，所述宿主细胞是人cd8⁺和/或cd4⁺t细胞。

本发明第六方面提供了一种获得carmesothelin-t细胞的方法，其包括以下步骤：使用所述的载体转导人cd8+/cd4+t细胞；优选地，所述载体为慢病毒载体。

优选地，所述的方法具体包括以下步骤：

1)从人外周血分离pbmc；

2)对所述pbmc进行磁性分选，获得cd4⁺和/或cd8⁺t细胞悬液；

3)使用无血清细胞培养基将步骤2)所获得的t细胞悬液用分别添加有il-2和il-7的培养液培养，其中所述培养基中；所述的细胞培养板包被有与细胞数量优选为1：1的cd3/cd28磁珠；

4)构建carmesothelin慢病毒包装质粒；

5)将所述t细胞悬液用carmesothelin慢病毒包装质粒进行感染(优选moi10)；获得目的carmesothelin-t细胞。

本发明第七方面提供了所述核酸分子、所述的car、所述的car-t细胞、所述的载体、所述的宿主细胞在治疗间皮素表达相关疾病中的应用；优选地，所述间皮素表达相关疾病为癌症；更优选地，所述间皮素表达相关疾病选自间皮瘤、类上皮恶性胸膜间皮瘤、卵巢癌、肺癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、胆道癌、子宫内膜癌、胸腺癌、结肠癌、乳腺癌。

具体来说，所述的应用包含其在制备药物中的用途。优选地，所述的药物为抗肿瘤的药物。

本发明第八方面提供了一种抗体或抗体片段，其含有seqidno:20、22、24、26、28、30、32、34或36所述的氨基酸序列。

本发明提供一种能够与间皮素蛋白特异结合的抗间皮素抗体scfv片段。

本发明提供一种高效制备carmesothelin-t细胞的方法及其检测和应用，包括以下步骤：

抽取人全血5-100ml并对其进行处理以获得分离的pbmc；

对所述的分离的pbmc进行分选，获得cd4+t细胞∶cd8+t细胞比率为1：1-1：5的t细胞悬液；

将所述的t细胞悬液在细胞培养板中在37℃、5％co2和100％湿度条件下以gt-t51无血清细胞培养基进行培养1天，其中所述的培养基中分别添加有终浓度为300u/ml的il-2、终浓度为20u/ml的il-7；其特征在于所述的细胞培养板内添加有与细胞数量为1：1的cd3/cd28磁珠；

构建carmesothelin慢病毒载体，并包装获得高滴度病毒；

将所述t细胞悬液加入到预包被有8.34μg/mlretronectin的细胞培养板中，并加入慢病毒进行感染(moi10)；获得目的t细胞；

获得的carmesothelin-t细胞经过体外试验和动物试验验证功能和治疗效果。

优选地，所述的t细胞悬液的接种密度为5×10⁵/ml。

优选地，所述的添加与细胞数量为1：1的cd3/cd28磁珠是通过下述方法实现的：将与细胞数量为1：1的cd3/cd28磁珠与细胞一起加入到细胞培养板共培养。

优选地，所述的预包被有retronectin的细胞培养板是通过下述方法实现的：将含有终浓度为8.34μg/ml的retronectin的pbs缓冲液按照1000μl/孔(6孔板)或500μl/孔(24孔板)加入到细胞培养板后37℃孵育2小时。

优选地，所述的处理为：先将新鲜采集的外周血用冷却的无菌磷酸盐缓冲液稀释一倍，将稀释的血样以1：2的比例加入到淋巴细胞分离液中，在25℃用水平离心机于700g离心20分钟，吸出中间淋巴细胞层至新的无菌离心管中，用等体积的磷酸盐缓冲液等体积稀释后于25℃以800g的离心力离心10分钟；弃掉上清，用无血清rpmi1640重悬，在25℃下500g离心5分钟，弃掉上清，重悬，加入含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基清洗，于25℃下500g离心5分钟，弃掉上清后用含10％fbs的rpmi-1640培养基重悬,取适量重悬液于血球计数板上进行细胞计数，并用含10％血清的rpmi-1640培养基将细胞液调整至2.5×10⁶细胞/ml的最终密度。

优选地，所述的pbs缓冲液为0.01m、ph7.4的pbs溶液。

优选地，所述的分选是通过分选柱实现的。

优选地，所述的分选是通过将分选柱放置在强磁场中实现的。

优选地，所述的构建carmesothelin慢病毒载体是通过构建慢病毒表达载体，包括抗-间皮素抗体的scfv、cd8铰链区、cd28跨膜区、cd3胞内区和41bb胞内区实现的。

优选地，所述的获得高滴度病毒是通过使用构建carmesothelin慢病毒包装质粒感染lentix细胞实现的。

优选地，所述的体外试验是通过与靶标肿瘤细胞系h226细胞共孵育后，检测分泌细胞因子和杀伤功能实现的。

优选地，所述的动物试验是通过使用nsg小鼠肿瘤模型实现的。

本发明的技术方案获得的carmesothelin-t细胞，阳性率可达到20-40％，且细胞增殖数量多、活力好、cd8+t细胞与cd4+t细胞之比接近正常生理状态，具有较高的细胞因子分泌水平和杀伤能力。

附图说明

图1表示杂交瘤上清结合间皮素蛋白的elisa实验结果，其中杂交瘤编号分别为1g7-1、3a11-1、3f5-1、6h12-2、8c7-1、8f8-2、8g8-2、11e2-1、11h3-2，横坐标为浓度，单位为mol/l，纵坐标为od值，即450nm的吸光度；

图2car的结构，包括抗-间皮素scfv抗体、cd8铰链区、cd28跨膜区、4-1bb胞内区和cd3ζ；

图3间皮素蛋白鉴定，其中数字代表收集蛋白管的标号，黑框内代表目的蛋白(间皮素蛋白，大小约为41kda)；左图为考马斯亮蓝染色，右图为western染色；

图4培养第8天car-t细胞感染阳性率(gfp％)；其中t是t细胞对照组，8g8、8f8、11h3是本发明涉及的8g8-2、8f8-2和11h3-2三种不同car-t细胞；横轴代表gfp，纵轴代表ssc；

图5培养第8天t和car-tcd4/cd8细胞分群特征；其中t是t细胞对照组，8g8、8f8、11h3是本发明涉及的8g8-2、8f8-2和11h3-2三种不同car-t细胞；横轴代表cd4，纵轴代表cd8；

图6培养第8天t和car-ttcm细胞分群和分化特征；其中t是t细胞对照组，8g8、8f8、11h3是本发明涉及的8g8-2、8f8-2和11h3-2三种不同car-t细胞；横轴代表cd45ro，纵轴代表cd62l；

图7t细胞和car-t细胞分泌ifn-γ水平；其中t+h226代表t细胞与靶细胞按照效靶比3:1互作20小时后ifn-γ水平；8g8+h226、8f8+h226、11h3+h226分别代表本发明涉及的8g8-2、8f8-2和11h3-2三种不同car-t细胞，与靶细胞按照效靶比3:1互作20小时后ifn-γ水平；

图8t细胞和car-t细胞杀伤h226细胞水平；其中t+h226代表t细胞与靶细胞按照效靶比3:1互作20小时后细胞毒性水平；8g8+h226、8f8+h226、11h3+h22分别代表本发明涉及的8g8-2、8f8-2和11h3-2三种不同car-t细胞与靶细胞按照效靶比3:1互作20小时后细胞毒性水平；

图9小鼠肿瘤体积，其中t组是注射t细胞对照小鼠组，car-t组是注射本发明涉及的8g8-2car-t细胞小鼠组；横轴代表时间，纵轴代表肿瘤体积。

具体实施方式

定义

术语“嵌合抗原受体”(car)是car-t的核心部件，赋予t细胞hla非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过car改造的t细胞相较于天然t细胞表面受体tcr能够识别更广泛的目标。car的基础设计中包括一个胞外抗原(tumor-associatedantigen，taa)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scfv段)，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于car的特异性、有效性以及基因改造t细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。

术语“信号区”是指通过在细胞内传递信息而起作用的蛋白质的功能性部分，用来通过产生第二信使或通过作为效应子对这样的信使响应起作用的信号通路调节细胞活性。

术语“间皮素”(mesothelin，msln)是一个40kda的蛋白质，其为通过糖磷脂酰肌醇区域(gpidomain)连接在细胞膜上的糖蛋白。msln基因首先被合成为71kda细胞表面蛋白，然后n端被弗林蛋白酶切除后，40kda的c端留在细胞膜上，可溶的31kda的n端片段mpf(megakaryoticpotentiatingfactor，巨核细胞增强因子)被释放。

术语“抗体”是指一类能与抗原特异性结合的衍生自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体、可以是单链或多链或者完整的免疫球蛋白分子，可以为天然来源或来自重组技术。

术语“抗体片段”是指保留与抗原的表位特异性地相互作用的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的例子包括：fab,fab’,f(ab’)2,fv片段、scfv抗体片段、由vh和ch1结构域组成的fd片段、线形抗体等等。

术语“scfv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述的轻链和重链可变区是邻接的-例如经由合成街头-，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scfv保留其所来源的完整抗体的特异性。

术语“重组抗体”是指通过使用重组dna技术产生的抗体。例如，通过合成编码抗体蛋白质的dna分子或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中所述dna或氨基酸序列已经使用重组dna或本领域可获得且熟知的氨基酸序列技术获得。

术语“肿瘤治疗效果”是指通过多种手段表现的生物效应，包括但不限于肿瘤或癌体积缩小、肿瘤或癌细胞数量减少、肿瘤/癌转移数量减少、预期寿命增加、肿瘤或癌细胞增殖减少、肿瘤或癌细胞存活率降低或与癌性病症有关的各种生理学症状的改善。本发明与间皮素相关的癌症的实例包括但不限于：间皮瘤、卵巢癌、肺癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、胆道癌、子宫内膜癌、胸腺癌、结肠癌、乳腺癌、以及与表达间皮素相关的癌前病变。

两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。适于测定序列同一性百分数和序列相似性的算法的两个实例为blast和blast2.0算法，见altschul等人，1990，j.mol.biol.215:403-410中。

在一种实施方式中，胞内信号区也叫“细胞内信号传导结构域”，其可以包括一系级细胞内信号传导结构域。

本发明通过具体实施方式和附图进一步阐述本发明的技术方案，但是本领域普通技术人员可以理解的是：以下具体实施方式以及实施例旨在阐述本发明，而不应理解为以任何方式限制本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特殊说明，均为本领域常规的实验方法，所使用的实验材料如无特别说明，均属于可以容易的从商业公司获取的实验材料，本发明所使用的抗体均可由商业公司容易地获得。

实施例1.间皮素重组蛋白表达质粒的构建

体外合成间皮素cdna片段，尾端加入his标签，两端分别引入酶切位点ecor1和bglii，克隆入表达载体pcaggs，构建间皮素全长蛋白的重组真核表达质粒。以上工作由苏州泓迅公司完成。

间皮素重组蛋白cdna序列如下：

atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacgaattcggaagtggagaagacagcctgtccttcaggcaagaaggcccgcgagatagacgagagcctcatcttctacaagaagtgggagctggaagcctgcgtggatgcggccctgctggccacccagatggaccgcgtgaacgccatccccttcacctacgagcagctggacgtcctaaagcataaactggatgagctctacccacaaggttaccccgagtctgtgatccagcacctgggctacctcttcctcaagatgagccctgaggacattcgcaagtggaatgtgacgtccctggagaccctgaaggctttgcttgaagtcaacaaagggcacgaaatgagtcctcaggtggccaccctgatcgaccgctttgtgaagggaaggggccagctagacaaagacaccctagacaccctgaccgccttctaccctgggtacctgtgctccctcagccccgaggagctgagctccgtgccccccagcagcatctgggcggtcaggccccaggacctggacacgtgtgacccaaggcagctggacgtcctctatcccaaggcccgccttgctttccagaacatgaacgggtccgaatacttcgtgaagatccagtccttcctgggtggggcccccacggaggatttgaaggcgctcagtcagcagaatgtgagcatggacttggccacgttcatgaagctgcggacggatgcggtgctgccgttgactgtggctgaggtgcagaaacttctgggaccccacgtggagggcctgaaggcggaggagcggcaccgcccggtgcgggactggatcctacggcagcggcaggacgacctggacacgctggggctggggctacagggcggcatccccaacggctacctggtcctagacctcagcatgcaagaggccctccaccaccaccaccaccactag

实施例2.间皮素蛋白的表达与纯化

1)转染hek293t细胞(购自上海细胞库,bncc338274)：转染18个小时前，hek293t细胞以1.5x10⁷/ml传至30个15cm培养皿中培养；取37.5mldmem(购自gibco,c11995500cp)(无血清及抗生素)至50ml管中，加入2970μg聚醚酰亚胺(pei)megatran1.0(购自alfaaesar，9002-98-6)混勾；取37.5mldmem(无血清及抗生素)至50ml管中，加入间皮素质粒dna990μg混勾；将pei/dmem溶液加入到已经配好的dna溶液中，迅速混匀并室温静置15分钟；分别取2.5mlpei/dna/dmem混合液至各培养皿中于37℃、5％co2培养箱中培养。转染6小时后，小心吸出培养液，每皿细胞加入25ml新的培养液dmem+2％fbs(购自gibco，10270)+0.12％双抗(penicillin-streptomycin，购自gibco，15140-163)+0.12％丁酸钠(购自sigma，3303410-500g)，继续培养。

2)上清收集和纯化：转染48小时后，收集含有蛋白的培养基，6000转4℃离心1小时，取上清，用磷酸调整ph值至7.0-7.4。以0.22μm滤膜过滤调整好ph值的上清，4℃保存。先用20％的乙醇清洗aktaprimeplus(gehealthcarebio-sciences)的管路(约需要25ml20％乙醇)，再用过滤的milliq水清洗aktaprimeplus的管路(约需要25ml过滤后的milliq水)。将histrap^tmexcel柱(gehealthcare)接入aktaprimeplus管路，用5个柱体积milliq水清洗柱子。清洗完毕后，用20mm的磷酸钠(bindingbuffer，约需要30ml，使20mm磷酸钠充满管路及柱子)清洗管路及柱子。将aktaprimeplus及柱子搬入层析柜，将过滤并调整好ph值的上清上到柱子中(上样过程保持4℃，速度不超过1ml/分钟，根据柱子的大小而定)。上样完毕后，将aktaprimeplus及柱子移回室温，用20mm磷酸钠冲洗管路及柱子(约30ml左右，使磷酸钠充满管路及柱子)。用10mm、20mm、50mm、100mm、250mm、500mm的咪唑依次冲洗管路及柱子(每种浓度的咪唑需要30ml左右)，依照电脑上显示的蛋白峰收集蛋白(用2ml管收集，每管收集1.5ml)。

如图3所示，10mm咪唑收集9管，20mm咪唑收集8管，250mm及500mm咪唑各收集2管。从1开始标记所收集的蛋白管，取峰值较高的第3、4、5、6、7、8、13、14、15管，每管取出20μl蛋白进行鉴定收集的蛋白是否为所需蛋白。图上的数字代表收集蛋白管的标号，黑框中为目的蛋白(大小约为41kda)，左图为考马斯亮蓝染色，跑胶电压约为180v，时间为30分钟。蛋白条带较为单一，主要条带集中在43dka靠下部分。右图为western染色，跑胶电压约为180v，时间为30分钟。恒流转膜(300ma，时间为55分钟)，5％脱脂牛奶4℃封闭过夜(脱脂牛奶溶解于tbst溶液中)，一抗为mouseanti-hismab，室温孵育1h(1:10000，购自中杉金桥，ta-02)，二抗为辣根酶标记山羊抗小鼠igg(h+l)，室温孵育1h(1:5000，购自中杉金桥，zb-2305)，条带集中在43kda靠下部分。两图均表明所收集纯化的蛋白为所需蛋白，而且纯度较高。

将浓度较高的4-8蛋白管中的蛋白收集至1个15ml管，利用amiconultra-4centrifugalfilters(millipore，10k)将蛋白中的咪唑置换成磷酸盐缓冲液(0.01mpbs，ph7.4，经121℃高压灭菌)，并浓缩至1ml，检测浓度后，分装，获得全长间皮素重组蛋白。用液氮速冻后，存放在-80℃。

实施例3.间皮素单克隆抗体的制备与初步筛选

此部分工作由南京金斯瑞公司完成，根据标准方法用实施例2获得的纯化的全长间皮素重组蛋白(以下简称为间皮素抗原)用于对b6/c57小鼠进行免疫、细胞融合、筛选等，获得9株单克隆定株。

其对应融合板细胞株为1g7-1、3a11-1、3f5-1、6h12-2、8c7-1、8f8-2、8g8-2、11e2-2、11h3-2，对应单克隆抗体以此标号。

实施例4.间皮素单克隆抗体上清的结合活性检测和筛选

1)酶联免疫实验(elisa)检测抗体结合：

提前一天将间皮素蛋白按照100ng/孔包被于96孔板上，4℃过夜；次日洗涤后，加入200μl封闭液37℃封闭1小时；洗涤后按照实验设计加入梯度稀释的抗体(实施例3获得的抗体，各抗体从6.67e-05mol/l起6倍稀释8个梯度)，室温孵育1小时；洗涤后加入鼠源二抗(1:2000)(购自中杉金桥)，室温孵育1小时；加入tmb100μl/孔，避光显色5分钟(37℃显色)；2mh2so4终止反应，15分钟内读数。

如图1，上述9株杂交瘤上清抗体起始od值均在4.0以上，ec50均在10⁷以上，说明与间皮素蛋白的结合力高。

表1

2)流式细胞术检测抗体结合：

非小细胞肺癌细胞系h226细胞(购自上海细胞库)于37℃消化约5分钟，800rpm，5分钟离心后重悬于pbs中(4.5×10⁵个细胞/ml)。分别以上述9株杂交瘤的上清液检测h226细胞间皮素表达。二抗：pe抗小鼠igg(购自biolegend)1μl/样品。染色后上机(beckman，cytoflex)检测，90％以上的细胞显示出阳性。

利用间皮素蛋白免疫小鼠，通过筛选得到的杂交瘤细胞单克隆抗体1g7-1、3a11-1、3f5-1、6h12-2、8c7-1、8f8-2、8g8-2、11e2-2、11h3-2，能够与天然表达于非小细胞肺癌细胞系h226的间皮素蛋白结合；同时经elisa检测，具有较高的亲和力。

经过筛选，将杂交瘤细胞单克隆抗体8f8-2、8g8-2、11h3-2测序，其能够与间皮素蛋白特异结合的抗-间皮素抗体的scfv段，包含重链互补决定区(cdr)和轻链互补决定区(cdr)，序列如下表2：

表2

单克隆抗体8f8-2、8g8-2、11h3-2能够与间皮素蛋白特异结合的抗-间皮素抗体的scfv段包含重链可变区和轻链可变区，序列如下：

8f8-2scfv段重链可变区：

gaagtgaagtttgaggagtctggaggaggcttggtgcaacctggaggatccatgaaactctcctgtgttgcctctacactcactttcagtaactactggatgaactgggtccgccagtctccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagattgaaatctaataattatgcaacacaatatgcggagtctgtgaaagggaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagtagtgtctacctgcaaatgaacaacttaagagctgaagacactggcatttattactgtgccaggggaacaggctggtggtttacttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca

(seqidno.:19)

8f8-2scfv段轻链可变区：

gacattgtgatgtcacagtctccatcctccctagctgtgtcagttggagagaaggttactatgagctgcaagtccagtcagagccttttatatagtggcaatcaaaagaactacttggcctggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatttactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtgtgaaggctgaagacctggcagtttatttctgtctgcaatattatagctatccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa(seqidno.:21)

8g8-2scfv段重链可变区：

gacgtgaagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctctgcagcctctggattcactttcagtagctataccatgtcttggattcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtgattacacctactatccagacagtgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgcagtctgaggacacagccatttattactgtgcaagagatggggggtacggctattactatgctgtggactactggggtcaaggaacctcagtcattgtctcctca(seqidno.:23)

8g8-2scfv段轻链可变区：

gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacagagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaaatacacatgctccgaacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa(seqidno.:25)

11h3-2scfv段重链可变区：

gaagtgatgctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtagtcacaccttcgatccagacagtatgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtatctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatatattactgtgcaagatgggacggtacctccgggaggtggtacttcgatgtctggggcgctgggaccacggtctccgtctcctca(seqidno.:27)

11h3-2scfv段轻链可变区：

gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgacctacacagtttccaatcgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacattttccgtacacgttcggaggggggaccaaactggaaataaaa(seqidno.:29)

所使用的连接片段(linker)为本领域常用的连接片段，例如，

ggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggc。

连接片段将轻链可变区与重链可变区连接在一起，共同构成scfv。

本发明8f8-2scfv序列如下：

gacattgtgatgtcacagtctccatcctccctagctgtgtcagttggagagaaggttactatgagctgcaagtccagtcagagccttttatatagtggcaatcaaaagaactacttggcctggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatttactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtgtgaaggctgaagacctggcagtttatttctgtctgcaatattatagctatccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaagtgaagtttgaggagtctggaggaggcttggtgcaacctggaggatccatgaaactctcctgtgttgcctctacactcactttcagtaactactggatgaactgggtccgccagtctccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagattgaaatctaataattatgcaacacaatatgcggagtctgtgaaagggaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagtagtgtctacctgcaaatgaacaacttaagagctgaagacactggcatttattactgtgccaggggaacaggctggtggtttacttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca(seqidno.:31)

本发明8g8-2scfv序列如下：

gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacagagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaaatacacatgctccgaacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgacgtgaagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctctgcagcctctggattcactttcagtagctataccatgtcttggattcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtgattacacctactatccagacagtgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgcagtctgaggacacagccatttattactgtgcaagagatggggggtacggctattactatgctgtggactactggggtcaaggaacctcagtcattgtctcctca(seqidno.:33)

本发明11h3-2scfv序列如下：

gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgacctacacagtttccaatcgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacattttccgtacacgttcggaggggggaccaaactggaaataaaaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaagtgatgctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtagtcacaccttcgatccagacagtatgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtatctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatatattactgtgcaagatgggacggtacctccgggaggtggtacttcgatgtctggggcgctgggaccacggtctccgtctcctca(seqidno.:35)

实施例5.car病毒表达载体构建

分别采用上述三种抗-间皮素scfv抗体序列进行car病毒表达载体构建。体外合成car的dna片段，包括抗-间皮素scfv抗体、cd8铰链区、cd28跨膜区、4-1bb胞内区和cd3ζ，两端分别引入酶切位点，克隆入表达载体pcdh(购自sbi)。分别得到三种目标表达载体，分别为yw-z-0201-8f8-2、yw-z-0201-8g8-2、yw-z-0201-11h3-2。以上工作由苏州泓迅公司进行。

实施例6.car病毒表达载体扩增

对实施例5获得的car病毒目标表达载体进行扩增：

提前20-24小时将lenti-x细胞(购自takara，632180)批量铺入15cm细胞培养皿，每皿1.5×10⁷个细胞，使用的培养基为25ml含有10％fbs的dmem。将细胞放入37℃、5％co2和100％湿度条件下培养。

当细胞量覆盖住70-80％培养皿时进行转染。将终浓度36ug/ml的pei和共33μg的病毒包装质粒plp1、plp2和vsvg(购自sbi)和每一种目标表达载体溶解到dmem中，混合均匀后室温孵育15分钟，所用质粒比例为plp1:plp2:vsvg:目标表达载体＝9:6:9:8，三种病毒包装质粒和一种目标表达载体的总量为33μg。吸取2.5ml溶解在dmem中的dna/pei混合物缓慢加入培养皿边缘，轻晃混匀。

6小时后，小心吸出培养液，加入25ml含有2％fbs和0.12％丁酸钠的dmem。64小时后收集含有病毒的上清液2.5l，等待浓缩。

实施例7.car病毒表达载体浓缩：

浓缩使用spectrumlabs公司krosflotff系统浓缩机。使用该浓缩机进行浓缩的技术为本领域公知技术。

用1l水清洗柱子，背压4psi，完成后用500mlpbs平衡柱子，装载上述实施例6获得的含有病毒的上清液样品开始浓缩，注意整个过程中不要产生气泡。

收集的上清液2.5l用4000转离心1小时，去除细胞碎片。将离心后液体加入截留500kd的s型中空纤维系统进行浓缩，管路选择#17，流速300ml/分钟，背压5psi。当样品浓缩至15ml时，关闭背压，向补液容器内加入90mldmem，继续浓缩至35-40ml，4℃，10000g离心5分钟。将离心后的上清液进行分装，获得目标car慢病毒，并存入-80℃。

实施例8.病毒滴度检测

1)病毒液稀释：将浓缩后的病毒15000g离心2分钟，取上清。取50μl病毒上清加入到450μldmem培养基中，混匀，标记为10^-1。从10^-1混合液开始再用dmem连续倍比稀释4个稀释度，标记为5×10^-2，2.5×10^-2，1.25×10^-2，6.25×10^-3。

2)293t细胞的准备：用trypsin将293t消化成单个细胞，洗2遍后用完全培养基(dmem+10％fbs+0.12％双抗)重悬，取适量细胞悬液于细胞计数板计数。计数后，将细胞悬液用完全培养基稀释成1×10⁵个细胞/ml，根据体积，每毫升中加入0.6μl聚凝胺。

3)病毒感染：6孔板的每个孔中加入2ml上述细胞悬液，加入100μl上述1)中制备的稀释后的病毒混合液，混匀，设无病毒感染孔做对照，置于37℃、5％co2和100％湿度条件下培养。24小时后，换成完全培养基继续培养。

4)facs检测：病毒感染72小时后，收集细胞。用pbs洗2次后，500μlpbs重悬于流式管中，用facs检测gfp表达量。

5)病毒滴度计算

取facs阳性率在3％-30％的结果计算病毒滴度，计算公式如下：

病毒滴度(pfu/ml)＝(阳性比率gfp％*200000)/(病毒原液体积(l)*100)

注：公式中的20000，是指6孔板中，每孔的293t细胞数。

病毒滴度如下：

yw-b-0201-8f8-2：2.98×10⁷

yw-b-0201-8g8-2：9.16×10⁶

yw-b-0201-11h3-2：1.22×10⁷

实施例9.志愿者外周血淋巴细胞(pbmc)分离：

本发明所用的淋巴细胞来自个体的静脉外周血。经过筛选的个体经临床医生体检合格后，由试验者告知具体项目流程及所需血液的数量，经志愿者同意并签署知情同意书，由临床医务人员对志愿者进行采血。最终本项目筛选了1例健康志愿者v62，采血时使用含有edta-k2抗凝的10ml一次性真空采血管(购自bd公司，367525)，每名志愿者采血约50ml，采血后将血样立即颠倒防止凝血。

1)先将新鲜采集的外周血用预热的氯化钠注射液(购自石家庄四药有限公司)稀释一倍，将稀释的血样以5:3的比例加入到事先准备好的15ml淋巴细胞分离液(购自天津灏洋生物技术有限公司，lts1077)中，需缓慢加入以避免界面混乱；

2)将上述含淋巴细胞分离液和血样的离心管在25℃条件下用水平离心机(购自thermofisher公司，75004524)将升降速设置为升速2，降速2，以700g离心30分钟；离心后的样品分四层，从管底往上依次是红细胞层、淋巴细胞分离液层、白色云雾状的单个核细胞层(包括淋巴细胞和单核细胞)、血浆层，将最上层血浆用巴斯德移液管吸出弃掉，之后小心吸出单个核细胞层并移至新的无菌离心管中，由此制得粗纯pbmc细胞；

3)用等体积的氯化钠注射液稀释粗纯pbmc细胞，之后在25℃条件下以300g的离心力离心10分钟；弃掉上清，重复上述步骤一次；加入适量氯化钠注射液重悬细胞后开始计数；获得分离的pbmc细胞备用。

实施例10.志愿者外周血t细胞分选

通过免疫磁珠法对上述分离的pbmc细胞中的t淋巴细胞进行分选富集，以获得高纯度的t细胞，用以进行后续培养。

1)首先将上述获得的分离的pbmc细胞按照每1×10⁷细胞与20μl的cd4抗体偶联磁珠(购自德国美天旎生物技术有限公司,130-045-101)、20μl的cd8抗体偶联磁珠(购自德国美天旎生物技术有限公司,130-045-201)含0.5％胎牛血清(fbs，购自美国gibco公司品牌澳洲来源，10270-106)和含2mmedta-na的80μlpbs-f缓冲液缓冲液(以磷酸盐缓冲液(0.01mpbs，ph7.4，经121℃高压灭菌)为溶剂，fbs和edta-na为溶质而配置的用于t细胞分离的缓冲液，其中溶质浓度为0.5％和2mm)进行混合，之后置4℃进行孵育15分钟。然后对于每10⁷个细胞加1-2mlpbs-f缓冲液，于室温300g离心10分钟。

2)用移液枪小心吸除细胞上清液，用500μlpbs-f缓冲液重悬上述细胞(一般小于10⁸个细胞加500μl缓冲液重悬)，并通过200目一次性无菌滤网(购自德国美天旎生物技术有限公司，130-101-812)过滤，去除细胞悬液中的杂质，以使得细胞能够顺利通过分选柱(ms分选柱，购自德国美天旎生物技术有限公司，130-042-201)，获得cd4和/或cd8抗体磁珠结合的pbmc细胞。

3)将ms分选柱放置在强磁场(octomacsseparator，购自德国美天旎生物技术有限公司，130-042-108)中，用0.5mlpbs-f缓冲液润洗2次，至最后一次润洗pbs-f缓冲液完全流出分选柱后，获得经处理的ms分选柱备用。

4)将上述步骤2)获得的cd4和/或cd8抗体磁珠结合的pbmc细胞缓慢加入到步骤3)处理后的ms分选柱，此时结合了cd4抗体磁珠和/或cd8抗体磁珠的t细胞就会在磁场作用下滞留在ms分选柱中，而未结合磁珠的其他细胞则沿分选柱流出，即为流穿细胞。用1ml的pbs-f缓冲液分三次缓慢加入到分选柱，使分选柱内未结合磁珠的细胞完全洗脱出分选柱，以便获得更高纯度的结合了cd4抗体磁珠和/或cd8抗体磁珠的t细胞。

5)将含有结合了cd4抗体磁珠和/或cd8抗体磁珠的t细胞分选柱远离磁场，加入1ml的pbs-f缓冲液，用ms分选柱活塞推出分选柱内与磁珠结合的cd4和/或cd8t细胞，于300g离心10分钟，弃掉上清后用gt-t551无血清细胞培养基(购自takara公司，gt-t551，下同)清洗两次，并以含0.6％人体自身血清(hs，购自sigma公司)和终浓度为300iu/ml白细胞介素-2(il-2)(购自双鹭药业)、终浓度为20u/ml的il-7(购自peprotech公司，af-200-07)的gt-t551培养基重悬计数至浓度为5×10⁵细胞/ml的细胞悬液，将细胞悬液加入到6孔细胞培养板内，在37℃、5％co2和100％湿度条件下进行培养，获得以cd4+和/或cd8+t细胞为主的高纯度t细胞，以备后续刺激处理。

实施例11.志愿者外周血t细胞体外活化

1)将含有终浓度为8.34μg/ml的人纤维连接蛋白(购自takara，t100b)的pbs缓冲液按照1000μl/孔(6孔板)或500μl/孔(24孔板)加入到细胞培养板后37℃孵育2小时；弃掉孔内上清溶液；每孔加入2mldpbs(购自gibco公司，a12856-01)，漂洗1次；每孔再加入1mlgt-t551细胞培养基(来源同上)漂洗1次；弃掉孔内上清溶液。

2)将实施例10的步骤5)获得的以cd4+和/或cd8+t细胞为主的高纯度t细胞按照5×10⁵/ml密度加入到细胞培养板中进行培养，添加与细胞数量比为1:1的cd3/cd28磁珠(购自life公司,11132d)，添加含终浓度为300u/ml的il-2及终浓度为20u/ml的il-7的gt-t551培养基；

3)经过上述分别处理的t细胞在37℃、5％co2和100％湿度条件下进行培养24小时，获得了已活化的t细胞悬液。

实施例12.体外感染t细胞

1)将实施例11步骤3)获得的已活化24小时后的t细胞悬液，按照(感染复数(每个细胞感染病毒的数量)moi＝10)分别加入实施例7获得的三种目标car慢病毒进行感染；

2)感染24小时后，取出细胞，300g离心10分钟，弃掉上清，重新使用添加有终浓度300u/ml的il-2和终浓度20u/ml的il-7的gt-t551培养基，在37℃、5％co2和100％湿度条件下进行培养7-12天，获得本发明的8g8-2、8f8-2和11h3-2carmesothelin-t细胞(下述简称8g8-2、8f8-2和11h3-2car-t细胞)。

实施例13.t细胞高效体外扩增

在实施例11获得的t细胞悬液和实施例12获得的car-t细胞，按照隔天传代的规律进行传代培养。培养至第8天分别取样，使用血球计数板进行计数，以评价培养后细胞增殖情况。经过培养后第8天，t细胞和8g8-2、8f8-2和11h3-2car-t细胞分别平均增殖15倍以上。

实施例14.car-t细胞阳性率分析

由于实施例5获得的目标表达载体及实施例7获得的目标car慢病毒带有gfp(绿色荧光蛋白)标签，与car共表达。因此，将通过检测gfp比例，评价car比例，即car-t细胞阳性率。

在细胞培养后第8天分别取样，进行流式细胞检测，以评价感染和培养后car-t细胞阳性率。分别取培养后t细胞、8g8-2、8f8-2和11h3-2car-t细胞5×10⁵个，以300g离心10分钟，弃掉上清后用1ml的pbs缓冲液进行2次离心清洗；最后一次离心后，用500μl2％多聚甲醛进行重悬，分别获得重悬后的t细胞、8g8-2、8f8-2和11h3-2car-t细胞。

使用双激光流式细胞分析仪检测(购自beckmancoulter公司，cytoflex)对上述获得的重悬液进行分析，所得数据用cytoexpert进行分析。如图4所示的经过培养后第8天，8g8-2、8f8-2和11h3-2car-t的gfp比例，即阳性率分别为27％、19％和24％。本发明的car-t细胞阳性率比例为20-30％。

实施例15.cd4+和/或cd8+t细胞、car-t细胞、效应性记忆t细胞检测

在t细胞培养后第8天分别取样进行流式细胞检测，以评价培养后t细胞亚群及分化特征。

1)cd4/cd8t细胞亚群分析

分别取培养后t细胞、8g8-2、8f8-2和11h3-2car-t细胞5×10⁵个，以300g离心10分钟，弃掉上清后用1ml的pbs缓冲液进行2次离心清洗；最后一次离心后用100μlpbs重悬，加入流式管(购自海门)中；加入peanti-humancd4antibody(购自biolegend，357404)和percp-cy5.5anti-humancd8antibody(购自biolegend，344710)抗体推荐用量的1/4-1/5,室温孵育15分钟，之后分别用2-3ml的pbs缓冲液洗涤，300g离心10分钟后，弃上清液；用500μl2％多聚甲醛进行重悬。

使用双激光流式细胞分析仪检测(购自beckmancoulter公司，cytoflex)，所得数据所得数据用cytoexpert进行分析。

如图5所示，经过培养后第8天，t、8g8-2、8f8-2和11h3-2car-t的cd4+/cd8+比例分别为63％/33％、60％/29％、64％/27％、63％/27％。本发明的cd4+/cd8+比例为2:1。

2)t细胞分化特征分析

分别取培养后t细胞、8g8-2、8f8-2和11h3-2car-t细胞5×10⁵个，以300g离心10分钟，弃掉上清后用1ml的pbs缓冲液进行2次离心清洗；最后一次离心后用100μlpbs重悬，加入流式管(购自海门)中；加入peanti-humancd62lantibody(购自biolegend，304806)和percp-cy5.5anti-humancd45roantibody(购自biolegend，304222)抗体推荐用量的1/4-1/5,室温孵育15分钟，之后分别用2-3ml的pbs缓冲液洗涤，300g离心10分钟后，弃上清液；用500μl2％多聚甲醛进行重悬。

使用双激光流式细胞分析仪检测(购自beckmancoulter公司，cytoflex)，所得数据所得数据用cytoexpert进行分析。

如图6所示，经过培养后第8天，t、8g8-2、8f8-2和11h3-2car-t的t细胞，即cd45ro-cd62l+细胞比例分别为22％、15％、20％和18％；效应性记忆t细胞，即cd45ro+cd62l+细胞比例分别为56％、61％、61％和60％。本发明的t细胞(包括car-t)比例为15-22％，效应性记忆t细胞(包括car-t)比例为56％-61％。

实施例16.car-t细胞分泌细胞因子

实施例11获得的t细胞和实施例12获得的car-t细胞培养8天，分别取培养后细胞2×10⁵个，与2×10⁵个h226细胞共同培养于96孔细胞培养板中，效靶比为t或car-t细胞与h226细胞的比例，t/car-t即为细胞与h226细胞的比例为3:1，其中t/car-t细胞6×10⁵个，h226细胞2×10⁵个。20小时后，以300g离心5分钟，收集细胞上清。

使用ifn-γelisa检测试剂(purifiedanti-humanifn-γantibody，购自biolegend，507502；biotinanti-humanifn-γantibody，购自biolegend，502504；hrpstreptavdin，购自biolegend，405210)检测细胞上清中分泌ifn-γ水平。图7为分泌ifn-γ水平，当效靶比为3:1时，t+h226组(ifn-γ的分泌量较低，小于100pg/ml；8g8-2+h226、8f8-2+h226和11h3-2+h226组的ifn-γ的分泌量分别为80000、4000和11000；均高于t+h226组2倍以上(图7)。说明本发明的car-t细胞产生大量细胞因子，从而特异性杀死肿瘤细胞。

实施例17.car-t细胞杀伤能力

实施例11获得的t细胞和实施例12获得的car-t细胞培养8天，分别取培养后细胞6×10⁵个，与2×10⁵个h226细胞共同培养于96孔细胞培养板中，效靶比3:1，其中t/car-t细胞6×10⁵个，h226细胞2×10⁵个。20小时后，以300g离心5分钟，收集细胞上清，检测乳酸脱氢酶(ldh)释放水平并进行分析。

使用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(购自碧云天，c0017)检测细胞上清490nm吸光度，计算细胞毒性水平。计算方法为：细胞毒性(％)＝(t/car-t+h226孔吸光度－培养基对照孔吸光度)/(t/car-t+h226细胞最大酶活性时的吸光度－培养基对照孔吸光度)×100。

图8为t细胞和本发明的car-t细胞杀伤h226细胞水平，当效靶比为3:1时，t+h226组细胞毒性14％左右；8g8-2+h226、8f8-2+h226和11h3-2+h226组细胞毒性分别为42％、17％和31％；均高于t+h226组。说明本发明的car-t细胞可以特异性杀伤h226细胞，释放大量ldh。

实施例18.动物试验效果

以8g8-2car-t细胞为例，使用nsg小鼠(购自南模生物)，每只皮下注射3×10⁶个h226细胞，以建立小鼠肿瘤模型；14天后，肿瘤体积生长至100mm3以上。取2名志愿者实施例11获得的t细胞和实施例12获得的car-t细胞，分别在各4只肿瘤模型小鼠上进行瘤内注射，每组共8只，注射剂量分别为5×10⁶个t、car-t细胞/只小鼠，每天观察小鼠状态。

肿瘤模型小鼠和注射t细胞小鼠肿瘤体积35天达到400mm³左右，而同时注射本发明的car-t细胞的小鼠肿瘤体积缩减到70mm³左右。证实本发明的car-t细胞具有良好的治疗肿瘤效果。

因此，通过上述实施例发现，本发明制备的carmesothelin-t细胞具有较高的car阳性率，较高的细胞因子ifn-γ水平，较高对h226细胞的杀伤能力，同时有较高增殖水平，保持合适的cd4+细胞/cd8+细胞比例，及合适比例的tcm细胞，经动物试验验证其对肿瘤的治疗效果，可用于临床治疗。

序列表

<110>英威福赛生物技术有限公司

<120>人间皮素嵌合抗原受体、其t细胞及其制备方法和用途

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