无血清悬浮培养型MDCK细胞株及其应用的制作方法

本发明属于细胞培养
技术领域：
，具体涉及一种无血清悬浮培养型mdck细胞株及其应用。
背景技术：
：流感即流行性感冒(influenza)，是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染性疾病，禽流感(birdflu或avianinfluenza)是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的亚型(也称禽流感病毒)引起的一种急性传染病，也能感染人类，人感染禽流感后的死亡率在33％以上。目前为止无论是流感还是禽流感均未找到理想的治疗药物，疫苗接种仍是当今防止疫病发生和流行的最有效手段。流感疫苗和禽流感疫苗传统的生产工艺是鸡胚培养法，这种以鸡胚作为生产基质的方式已使用多年，工艺自然很成熟，但是该生产方式仍存在很多缺陷，如生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染，如遇禽流感大规模爆发，鸡胚的供应也将存在很大问题。鉴于此，who于1995年提出使用哺乳动物传代细胞替代鸡胚作为流感疫苗的生产基质，相对于鸡胚，动物细胞经复苏后可以快速增殖并进入规模化疫苗生产，而且生产过程操作简单且易于控制，能保证疫苗质量和安全，采用传代细胞将不受鸡胚等天然因素的限制，如遇疫情会快速反应，短时间内可提供大量疫苗供应市场。mdck细胞(madin-dabycaninekidneycells，mdck)由madin和darby于1958年从美国cockerspaniel母曲架犬肾脏组织分离培育建立，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，是公认的最适合流感病毒培养的细胞系之一。目前国际上已有批准利用mdck细胞生产的流感疫苗，而我国作为流感疫苗和禽流感疫苗的生产和使用大国，全国有13家流感疫苗生产企业，年产值超过百亿元，其全部为鸡胚工艺生产；禽流感疫苗中仅有2家采用mdck细胞生产，分别是山东信得动物疫苗有限公司(兽药临字153122307)和吉林冠界生物技术有限公司(兽医生字070372306)，但是mdck细胞基质生产的禽流感疫苗的批签发数很少，2018年全国禽流感疫苗总批签发数为1683批，其中，mdck细胞基质为68批，仅占总批数的4％，还有很大提升空间。疫苗是用病毒制备的生物制品，人工获得大量病毒的方法主要有动物接种、鸡胚培养和细胞培养三种增殖方法，但是细胞培养是目前公认的最经济、快速和安全的病毒增殖方法。近年来，生物反应器大规模细胞技术的快速发展，与传统转瓶和细胞工厂培养相比表现出了明显优势，用生物反应器培养细胞和增殖病毒已成为疫苗生产工艺的首选。生物反应器培养细胞有微载体培养、片状载体培养、低血清悬浮培养和无血清悬浮培养等方式，其中，微载体培养和片状载体培养属贴壁培养方式，培养基中需要加动物血清，而且在工艺放大时有技术困难，国内目前最大的单罐培养体积还不到500l。低血清悬浮培养和无血清悬浮培养的方式其培养规模放大容易，目前国内bhk21细胞和mdck细胞悬浮培养单罐体积可达6000l，而且还可以线性放大。无论是微载体培养、片状载体培养，还是低血清悬浮培养，因培养基中含有动物来源的血清成份对疫苗接种者有副反应和其它安全风险，所以，无血清悬浮培养是疫苗生产最青睐的工艺。mdck细胞原始的细胞为贴壁培养型细胞，需要添加血清才能正常生长。流感疫苗/禽流感疫苗无血清悬浮培养工艺的难点是将原始的含血清贴壁培养型细胞系驯化为无血清悬浮培养型细胞株。技术实现要素：针对上述
背景技术：
中指出的现有技术存在的不足，本发明提供了一种无血清悬浮培养型mdck细胞株，该细胞株可应用于流感疫苗和禽流感疫苗的生产中。本发明的第一个目的是提供一种无血清悬浮培养型mdck细胞株，对atcc引进的贴壁培养型mdck细胞系(ccl-34，p55)通过驯化得到了无血清悬浮培养型mdck细胞株，所述无血清悬浮培养型mdck细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno：c2018191，分类命名为：犬肾细胞mdck-xf03，保藏日期为：2018年9月20日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。本发明的第二个目的是提供上述保藏编号为：cctccno：c2018191的无血清悬浮培养型mdck细胞株在流感疫苗和禽流感疫苗生产中的应用。作为优选，所述无血清悬浮培养型mdck细胞株作为细胞基质用于流感疫苗和禽流感疫苗生产。作为优选，所述无血清悬浮培养型mdck细胞株作为细胞基质对流感和禽流感病毒培养时，无血清悬浮培养型mdck-xf03细胞以1.0-2.0×106/ml密度接种培养。相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明通过无血清悬浮培养驯化方法，得到了无血清悬浮培养型mdck细胞株(分类命名：犬肾细胞mdck-xf03，保藏编号cctccno：c2018191)，该细胞株能够增殖流感和禽流感病毒，为我国开展流感疫苗和禽流感疫苗的相关研究和生产提供基础。附图说明附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：图1为mdck细胞形态；其中，a.贴壁培养型(驯化前，10x)，b.悬浮培养型(驯化后，20x)；图2为悬浮培养型mdck-xf03细胞株不同密度培养的生长曲线图；图3为悬浮培养型mdck-xf03细胞株增殖流感和禽流感病毒的ha柱形图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例1.材料1.1mdck细胞株(ccl-34)，从atcc引进，引进时细胞代次为p55，在atcc的保藏号：60245139，在atcc的冻存时间：2011-10-20，为贴壁培养型细胞。引进后按《药典》2010版的要求在培养至60代时建立主细胞库(编号为：mdck-m-60)，冻存数量1560支；在培养至63代时建立了工作细胞库(编号为：mdck-w-63)冻存数量1680支。mdck-m-60和mdck-w-63分别于2014年12月和2015年1月送检中国食品药品检定研究院检定，于2017年12月取得了细胞检验合格报告，报告编号分别为sh201702634和sh201702584。1.2deme(high-glucous)培养基，gibco，货号：02-5062ej；sfm-mdck无血清培养基，兰州百灵，货号为：cfm403；优级胎牛血清(fbs)，兰州民海。1.3胰蛋白酶，gibco，货号：27250，使用时配制成0.25％(m/m)使用液；tryple胰蛋白酶替代物(1x)，gibco，货号：12563-029。1.4流感病毒[a/california/7/2009(nymcx-179a)、a/texas/50/2012(nymcx-223a)、b/phuket/3073/2013(以下简称:b/p)和b/brisbane/60/2008(nymcbx-35)]由长春生物制品研究所有限责任公司从英国国家生物制品检定所(nibsc)购买；重组禽流感病毒(h5亚型re-5、h5亚型re-6、h5亚型re-10)由吉林冠界生物技术有限公司从哈尔滨兽医研究所购买，以上病毒均为疫苗生产株。1.5co2培养箱(美国thermofisher，3111)、co2摇床(上海知楚，zczy-cs8)、细胞计数仪(美国countstar，ic1000)。2.方法2.1细胞悬浮驯化1.2.1低血清适应培养1)用含10％fbs(v/v，下同)的dmem培养基复苏贴壁培养型mdck细胞(mdck-w-63)，待细胞长满单层后，用0.25％胰蛋白酶(m/m)消化分散细胞，以1：6的分瓶比例传代培养。(p64代)2)贴壁培养型mdck细胞每传代培养两代培养基中fbs浓度降低1％，至最终培养基中的血清浓度为1％(p84代)。因降低fbs使细胞生长速变慢，分瓶比例也相应减少，具体操作如表1所示：表1贴壁培养型mdck细胞低血清适应传代培养信息表细胞代次血清浓度(％)分瓶比例p64、p65101:6p66、p6791:6p68、p6981:6p70、p7171:5p72、p7361:5p74、p7551:5p76、p7741:4p78、p7931:4p80、p8121:4p82、p8311:41.2.2无血清悬浮驯化1)从血清浓度降到1％适应培养两代后，消化液由胰蛋白酶换为tryple胰蛋白酶替代物，并逐步减少dmem的量(含1％fbs)，逐步增加无血清培养基的量，分瓶比例为1:4，具体见表2所示：表2无血清驯化培养基组份比例表细胞代次1％fbsdmem无血清培养基cfm403p84、p8582p86、p8764p88、p8955p90、p9146p92、p9337p94、p98282)从p96代传代时开始扩大细胞培养量，至p98时细胞总数达2.0×108个以上，消化离心后全用无血清培养基调整密度为3.0×106/ml，取50ml细胞悬液用150ml锥形瓶(下同)在37℃、5％co2和110rpm摇床悬浮培养，每天离心更换无血清培养基一次。(p99)3)待悬浮培养mdck细胞的活细胞密度达6.0×106/ml以上时离心后按2.0×106/ml密度分瓶培养，以此连续传代，每分瓶培养一次记为一次传代培养。(p100-114)4)将生长快、结团少和均一性好的悬浮细胞冻存建立悬浮培养型mdck细胞株的细胞库(p114)。冻存液的配方为：5％二甲方基亚砜+95％无血清培养液cfm403(v/v)。因mdck细胞最初来源于犬肾，驯化所用的无血清培养基的编号为cfm403，故将驯化的悬浮培养型mdck细胞株命名为：犬肾细胞mdck-xf03，该无血清悬浮培养型mdck细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno：c2018191，保藏日期为：2018年9月20日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。2.2悬浮培养型mdck细胞株的生物学特性检查2.2.1复苏培养1)常规方法复苏犬肾细胞mdck-xf03，并检查细胞活力。2)以2.0×106/ml细胞密度接种后置37℃、5％co2和110rpm摇床悬浮培养。2.2.2不同接种密度培养的生长特性悬浮培养型mdck-xf03细胞复苏培养三代后，以1.0×106/ml、1.5×106/ml和2.0×106/ml的三个密度接种后置37℃、5％co2和110rpm摇床悬浮培养，每组平行三瓶，每12h取样1ml计数细密度，以平均细胞密度为纵坐标、取样时间为横坐标绘制细胞生长曲线，以曲线的最高点为该密度培养的最大增殖密度。2.2.3对流感和禽流感病毒培养增殖的适应性待悬浮培养型mdck-xf03细胞生长至密度达8.0-10.0×106/ml时，用无血清培养基稀释至密度为4.0-5.0×106/ml后按病毒感染复数(moi)为0.01接种流感和禽流感病毒，按2.5μg/ml添加胰蛋白酶，每种病毒平行接种三瓶。其中，流感病毒a/california/7/2009(nymcx-179a)、流感病毒a/texas/50/2012(nymcx-223a)和重组禽流感病毒(h5亚型re-5)、重组禽流感病毒(h5亚型re-6)、重组禽流感病毒(h5亚型re-10)在细胞上接种后置33.5℃、5％co2和110rpm培养；流感病毒b/p和b/brisbane/60/2008(nymcbx-35)在细胞上接种后置34.2℃、5％co2和110rpm培养。在病毒接种后的第24h、36h、48h和60h每瓶各取样1ml混合，用新鲜的鸡红细胞通过红细胞凝集试验检测样品中病毒的血凝效价(ha)，以判断病毒在细胞中的增殖情况，并绘制ha柱形图。3结果3.1贴壁培养型mdck细胞无血清悬浮培养的驯化贴壁培养型(mdck-w-63)逐步降低培养基中胎牛血清浓度，到p83代时已适应了1％fbs培养，生长速有所减缓，按1:4比例分瓶培养时，48h仍可生长成单层细胞，细胞形态与10％fbs培养时相似，但细胞长成单层时相互挤压或重叠现象不如10％fbs培养时明显，对胰蛋白酶的耐受程度也降低，因此换用消化能力相对较低的tryple胰蛋白酶替代物，也消除了消化结束需要中和时细胞对血清的依赖。贴壁培养型mdck细胞适应1％fbs培养后，通过逐步增加无血清基的比例，细胞能适应无血清培养，在无血清培养基悬浮培养活力高、结团少和均一性较好，经4次换液后基本适应了悬浮条件下培养，细胞生长速度变快，第7次换液后培养24h，细胞密度达6.6×106/ml。悬浮培养的mdck细胞(p99代)第一次传代后2.0×106/ml接种培养生长速度逐步加快，如表3所示。细胞中有可见体积偏大的细胞存在，在p107代时取部分冻存10支进行保种，剩余细胞继续传代培养至114代，此时大细胞比例有所减少，冻存176支，冻存密度为6.0×107/ml，细胞活力为93.76％，编号命名为：犬肾细胞mdck-xf03。3.2悬浮培养型mdck-xf03细胞株生物学特性3.2.1复苏活力和细胞形态冻存的悬浮培养型mdck-xf03细胞复苏活力达93.28％％，复苏后细胞形态呈圆，细胞边缘整齐，大小较均一，有少量可见体积偏大的细胞存在，如图1b所示。表3悬浮培养型mdck驯化前期生长密度表3.2.2生长特性悬浮培养型mdck-xf03细胞复苏培养三代后，以1.0×106/ml、1.5×106/ml和2.0×106/ml的三个密度接种培养，细胞生长均快，生长曲线成近“s”型，如图2所示，最大增殖密度分别为14.22×106/ml、14.36×106/ml和14.4×106/ml，最大增殖密度出现的时间分别为84h、84h和72h，说明该细胞以1.0-2.0×106/ml接种培养生长快、最大增殖密度高。细胞在不同时间取样计数的结果见表4。表4悬浮培养型mdck-xf03细胞不同密度接种培养结果表3.2.3对流感和禽流感病毒培养增殖的适应性悬浮培养型mdck-xf03细胞接种甲型的流感病毒a/california/7/2009(nymcx-179a)、流感病毒a/texas/50/2012(nymcx-223a)、重组禽流感病毒(h5亚型re-5)、重组禽流感病毒(h5亚型re-6)和重组禽流感病毒(h5亚型re-10)均能很好的生长，培养24小时ha(log2)达到3-8，60h时达到6-10。接种流感病毒b/p和b/brisbane/60/2008(nymcbx-35)生长更快，24小时ha(log2)达到8，60h时达到10-12。说明该细胞对流感和禽流感病毒均可适应，且增殖效果好，ha规律与病毒本身的生长速度和ha高低不一致的特性相吻合。ha取样测定结果见表5所示，其病毒增殖规律见图3。表5悬浮培养型mdck-xf03细胞培养流感和禽流感病毒的ha测定结果以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12