一类具有抗肿瘤活性的3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物及合成方法和应用与流程

本发明属于有机合成及药物应用技术领域，尤其是一类具有抗肿瘤活性的3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物及合成方法和应用。

背景技术：

查尔酮(chalcone)或称为1,3-二苯基-2-丙烯-1-酮，是许多天然化合物中常见的简单支架，是植物界中最重要的类黄酮类化合物之一，广泛分布于蔬菜、水果、茶和其他植物中。查尔酮是黄酮类和异黄酮类生物合成的开链前体，主要作为多酚化合物出现，其颜色从黄色变为橙色。

从合成角度看，该类化合物存在大量的可替换氢原子，可以合成许多查尔酮衍生物，从而呈现不同的生物活性，比如抗炎、抗氧化、减肥等作用。其实该类化合物的治疗作用可以追溯到数千年前，含有查尔酮化合物的植物或草药能够治疗癌症、炎症和糖尿病等疾病。目前已有几种查尔酮类化合物已被批准用于临床，其中美托卡龙(metochalcone)是一种利胆药；索法卡龙(sofalcone)是一种抗溃疡和粘膜保护药；hesperidinmethychalcone是治疗慢性静脉淋巴功能不全的药物；hesperidintrimetylchalcone用于治疗静脉曲张。基于此，合成查尔酮类衍生物，并研究其潜在的生物活性对人类疾病具有重要的研究意义。

通过检索，发现如下三篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

1、二氢吡唑类衍生物及其制备方法(cn107266367a)，提供一类二氢吡唑类衍生物及其制备方法，该衍生物的结构式为：其中，r1为-clc6h4、-brc6h4、-no2c6h4、-t-bu、-omec6h4、-ch3c6h4等，r2为-ts等。该方法与已有的合成二氢吡唑衍生物的方法相比具有以下优点：a)、采用廉价且环境友好的无水醋酸铜作为催化剂而非价格昂贵的过渡金属催化剂；b)、室温条件下即可反应，且具有良好的普适性和较高的收率；c)、实验操作简单，目标产物单一，后处理方便。温和的反应条件，简单的操作，廉价易得的催化剂，较高的收率为该发明的广泛应用以及工业化生产奠定了基础。

2、一类具抗肿瘤活性的甘草查尔酮a二氢吡唑类衍生物及其合成方法(cn106632043a)，涉及一类具有抗肿瘤活性的甘草查尔酮a二氢吡唑类衍生物及其合成方法，该类化合物以甘草查尔酮a、肼类化合物为原料，在无水乙醇作为溶剂下反应合成得到。该方法操作安全性高，反应条件温和，适用于工业化生产。经初步生物活性测试表明该类型化合物有较好的抗肿瘤活性，具有重要的医药应用价值。

3、一类具抗肿瘤活性的甘草查尔酮a二氢吡唑类衍生物及其合成方法(cn107235902a)，涉及一类具抗肿瘤活性的甘草查尔酮a二氢吡唑类衍生物及其合成方法。该类化合物以甘草查尔酮a、肼类化合物为原料，在无水乙醇作为溶剂下反应合成得到。该方法操作安全性高，反应条件温和，适用于工业化生产。经初步生物活性测试表明该类型化合物有较好的抗肿瘤活性，具有重要的医药应用价值。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种具有抗肿瘤活性的3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物及合成方法和应用，本发明首次合成了3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物，体外抗肿瘤活性研究证明，本发明3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物对多种肿瘤细胞，包括3种肺癌细胞系h460、h1975和hcc827，1种肝癌细胞hepg2，1种白血病细胞k562具有很强的抗肿瘤活性，可望开发成新的抗肿瘤药物。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一类具有抗肿瘤活性的3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物，其结构式通式如下：

而且，所述r为羟基、甲基或c1-10烷氧基。

而且，所述二氢吡唑类衍生物的名称及结构为：

4-(3-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-1h-pyrazol-5-yl)phenol，其结构为：

或者，为：2-(4-(3-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-1h-pyrazol-5-yl)phenoxy)ethan-1-ol，其结构为：

或者，为：

2,2'-(((4,5-dihydro-1h-pyrazole-3,5-diyl)bis(4,1-phenylene))bis(oxy))bis(ethan-1-ol)，其结构为：

或者，为：4-(3-(4-hydroxyphenyl)-4,5-dihydro-1h-pyrazol-5-yl)-2,6-dimethylphenol，其结构为：

，其结构为：

或者，为：4-(3-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-1h-pyrazol-5-yl)-2,6-dimethylphenol，其结构为：

如上所述的一类具有抗肿瘤活性的3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物的合成路线，具体为：

而且，合成时所用的溶剂为乙醇。

而且，合成时反应温度为70℃。

而且，合成时反应时长为5小时。

而且，具体步骤如下：

准确称取查尔酮类化合物于10ml的耐压管中，量取无水乙醇加入耐压管中，查尔酮类化合物：无水乙醇的比例mmol：ml为1.06：3，然后准确量取水合肼加入体系中，查尔酮类化合物：水合肼的摩尔比为1.06：3.18；加完毕后，封管，油浴70℃，反应5h，tlc追踪反应停止，减压蒸去溶剂，固体用乙酸乙酯、冷乙醇洗涤，干燥，即得二氢吡唑类衍生物。

如上所述的一类具有抗肿瘤活性的3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

而且，所述抗肿瘤药物为治疗3种肺癌细胞系h460、h1975和hcc827，或为1种肝癌细胞hepg2，或为1种白血病细胞k562的药物。

本发明取得的优点和积极效果为：

本发明通过波普和质谱数据分析表明合成得到的3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物为新化合物，且经体外抗肿瘤活性研究表明，本发明提供的3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物对多种肿瘤细胞，包括3种肺癌细胞系h460、h1975和hcc827，1种肝癌细胞hepg2，1种白血病细胞k562具有很强的抗肿瘤活性，是一种优良的抗肿瘤新化合物，可开发成为新的抗肿瘤药物。

附图说明

图1为本发明中化合物1在氘代dmso中的核磁氢谱图；

图2为本发明中化合物1在氘代dmso中的核磁碳谱图；

图3为本发明中化合物2在氘代dmso中的核磁氢谱图；

图4为本发明中化合物2在氘代dmso中的核磁碳谱图；

图5为本发明中化合物4在氘代dmso中的核磁氢谱图；

图6为本发明中化合物4在氘代dmso中的核磁碳谱图；

图7为本发明中3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物1-5对huvec细胞的细胞毒作用图；

图8为本发明中化合物2对hepg2细胞的形态学影响图；

图9为本发明中annexinv-fitc/pi法测定化合物2诱导hepg2细胞凋亡的作用图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一类具有抗肿瘤活性的3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物，其结构式通式如下：:

较优地，所述r为羟基、甲基或c1-10烷氧基。

较优地，所述二氢吡唑类衍生物的名称及结构可以为表1化合物1-5所示：

表1二氢吡唑类衍生物的具体结构及名称

如上所述的一类具有抗肿瘤活性的3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物的合成路线，具体为：

较优地，合成时所用的溶剂为乙醇。

较优地，合成时反应温度为70℃。

较优地，合成时反应时长为5小时。

较优地，具体步骤如下：

准确称取查尔酮类化合物于10ml的耐压管中，量取无水乙醇加入耐压管中，查尔酮类化合物：无水乙醇的比例mmol：ml为1.06：3，然后准确量取水合肼加入体系中，查尔酮类化合物：水合肼的摩尔比为1.06：3.18；加完毕后，封管，油浴70℃，反应5h，tlc追踪反应停止，减压蒸去溶剂，固体用乙酸乙酯、冷乙醇洗涤，干燥，即得二氢吡唑类衍生物。得表1所示各化合物，产率为55-63％。

如上所述的一类具有抗肿瘤活性的3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

较优地，所述抗肿瘤药物为治疗3种肺癌细胞系h460、h1975和hcc827，或为1种肝癌细胞hepg2，或为1种白血病细胞k562的药物。

下面通过实施例具体说明。

以下各实施例的化合物的合成通法均为如下步骤：

准确称取查尔酮类化合物(1.06mmol)于10ml的耐压管中，量取3ml无水乙醇加入耐压管中，然后准确量取水合肼(3.18mmol)加入体系中；加完毕后，封管，油浴70℃。反应5h，tlc追踪反应停止。减压蒸去溶剂，固体用乙酸乙酯、冷乙醇洗涤，干燥。

实施例1

化合物1的合成：

实施例1的合成方法同上述合成通法。

如图1和图2所示，化合物1为白色固体；收率：58％；结构参数：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.33(s,1h),7.57-7.55(m,2h),7.22(d,j＝3.6hz,1h),7.17(d,j＝8.4hz,2h),6.95-6.93(m,2h),6.73-6.71(m,2h),4.72-4.66(m,1h),3.77(s,3h),3.36-3.29(m,1h),2.51-2.50(m,1h).¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ159.32,156.51,148.78,133.20,127.75,126.88,126.12,115.11,113.97,63.32,55.18,40.80。

实施例2

化合物2的合成：

实施例2的合成方法同上述合成通法。

如图3和图4所示，化合物2为白色固体；收率：62％；结构参数：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.56(d,j＝8.4hz,2h),7.28(d,j＝8.8hz,3h),6.92(dd,j＝17.2,8.4hz,4h),4.86(s,1h),4.74(t,j＝10.4hz,1h),3.96(t,j＝5.2hz,2h),3.77(s,3h),3.70(d,j＝5.6hz,2h),3.36(dd,j＝16.4,10.4hz,1h),2.77(dd,j＝16.4,10.8hz,1h).¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ159.29,157.83,148.71,134.92,127.74,126.85,126.03,114.31,113.94,69.50,63.12,59.58,55.15,40.79。

实施例3

化合物4的合成：

实施例3的合成方法同上述合成通法。

如图5和图6所示，化合物4为白色固体；收率：62％；结构参数：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.44(d,j＝8.4hz,2h),7.06(s,1h),6.90(s,2h),6.76(d,j＝8.4hz,2h),4.63-4.58(m,1h),3.30-3.23(m,1h),2.76-2.70(m,1h),2.14(s,6h).¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ158.08,152.64,149.48,133.88,127.39,126.92,125.04,124.42,115.75,63.65,41.39,17.17。

本发明的相关检测：

3,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物的体外抗肿瘤活性测定：

在体外抗肿瘤试验中，选用了5种人源癌细胞系，包括3种肺癌细胞系h460、h1975和hcc827，1种肝癌细胞hepg2，1种白血病细胞k562，检测化合物1-5的体外抗肿瘤活性。

取处于对数生长期的细胞，调整h460等五株细胞密度为5×10⁴cell/ml接种于96孔板上，每孔加入细胞悬液100μl，同时设置空白孔和对照孔。于37℃、5％co2培养箱中培养一定时间(悬浮细胞培养2h，贴壁细胞培养24h)，分别加入不同浓度梯度化合物，每孔0.5μl，每个药物浓度设置3个复孔，置于37℃，5％co2恒温培养箱中，孵育48h后，每孔加入5mg/ml的mtt溶液20μl，置于37℃，5％co2恒温培养箱中继续孵育4h，终止培养。贴壁细胞处理方式为小心移除孔内培养上清液，每孔加入100μldmso；悬浮细胞处理方式就是在每孔中继续加入100μl盐酸-异丙醇溶液后吹打混匀，37℃放置10min后，使紫色结晶物甲瓒充分溶解，用酶标仪(490nm,630nm或570nm,630nm)测定各孔的吸光度(od)值，按以下公式计算细胞抑制率。

细胞存活率(％)＝(实验组od-空白组od)/(对照组od-空白组od)×100％。

mtt试验结果，如表2所示，结果显示，这些化合物在100μm以内均能剂量依赖的抑制肿瘤细胞的生长。化合物4对白血病细胞有抑制作用，ic50值为8.90±3.35μm；化合物2对肝癌细胞具有抑制作用，ic50值为9.42±4.32μm。

表23,5-二苯基取代的二氢吡唑类衍生物的体外抗肿瘤细胞活性的ic50值(μm)

注：悬浮细胞为k562人白血病细胞，贴壁细胞h460、h1975和hcc827为人肺癌细胞、hepg2人肝癌细胞

化疗药物羟基喜树碱(hcpt)为阳性对照药物：

化合物的选择性是取决于化合物对正常细胞的毒性，为了检验化合物是否在具有抗肿瘤作用的同时显示出毒性作用，本试验选择了正常的人内皮细胞huvec作为对照，如图7所示，结果显示化合物在100μm时，化合物均表现出不同程度细胞毒性。而对于化合物2，在10μm时，huvec细胞的存活率在90％以上，而其ic50值低于10μm，这说明这种化合物具有很好的选择性，基本不影响正常细胞的存活。

化合物2对肿瘤细胞的形态学影响：

选用了两种不同浓度的化合物2，观察其对hepg2的形态影响，如图8所示，采用100倍和200倍的显微镜，空白组的hepg2细胞，细胞长满，形态完整，而给药组肝癌细胞的数量明显少于空白组，并随着浓度的增加，细胞数减少，说明化合物2对肝癌细胞呈现浓度依赖性；从200倍显微镜显示，空白组的细胞是长梭形，而低浓度的给药组细胞开始出现形态的变化，变为圆形，高浓度给药组大部分细胞都呈现圆形，并有凋亡小体出现，说明化合物2可以诱导肝癌细胞的凋亡，从而抑制癌细胞的生长。

化合物2诱导肝癌细胞凋亡作用：

选用化合物2作用较强的肝癌细胞进行凋亡分析，采用流式细胞术的方法，用annexinv-fit/pi染色后，观察化合物作用于hepg2细胞48h后细胞凋亡的比例。如图9所示，空白组即只加dmso组，细胞早期凋亡和晚期凋亡的比例为4.2％，而对于化合物2，试验中选用了两个浓度5和20μm，结果显示在5μm时，早期凋亡和晚期凋亡的比例为3.4％，在20μm时，化合物2诱导的早期凋亡增长为10％，晚期凋亡增长为13.9％，总凋亡数为23.9％，这说明，该化合物具有诱导肝癌细胞凋亡的作用。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。