本发明属于益生菌制品制备技术领域，具体涉及一种可提高保加利亚乳杆菌常温保存能力和抗压能力的冻干保护剂及其冻干菌粉制备工艺。
背景技术：
保加利亚乳杆菌(l.delbrueckiisubsp.bulgaricus)是德氏乳杆菌(l.delbrueckii)种内的一个亚种，革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，不运动，无芽孢，兼性厌氧。徳氏乳杆菌保加利亚亚种是最主要的酸乳发酵剂菌种之一，在发酵过程中可经同型乳酸发酵将乳糖转化为乳酸，并且将蛋白质降解为肽类和氨基酸，为乳制品提供了独特的质地、风味，同时赋予乳制品特殊的食疗功效，也提高了乳制品功能性以及营养价值，其在发酵乳产业中具有非常重要的经济价值。随着人们对保加利亚乳杆菌研究的深入，除可以用于酸奶发酵剂外，其本身具有提高人体免疫力、调节肠道菌群、改善肠道功能等重要的生理和保健功能。因此，越来越多的含有保加利亚乳杆菌的益生菌制品在医疗、保健和营养方面得到推广和应用。
由于保加利亚乳杆菌自身比较脆弱，极易受到温度、ph、气体成分、机械作用力等外界因素的影响而导致活菌数量减少和功效降低。为确保产品货架期内的具有较高活菌数和益生功效，绝大多数含有保加利亚乳杆菌的益生菌产品需要通过冷链运输和低温储存的方式进行销售，极大的影响和限制了产品的应用方式和产品效果，同时提高了产品成本，进而影响产品的销售。此外，由于保加利亚乳杆菌对机械应力的耐受能力较差，在其制剂加工生产过程中活菌损失较大，导致生产成本增加，生产效率下降。因此，提升保加利亚乳杆菌对环境的耐受性关系到生产企业生产效率的提升以及相关益生菌制剂更好和更广泛的应用。
中国专利cn102952755a公开了一种保加利亚乳杆菌的冻干保护剂，由乳糖20～30份、脱脂乳粉20～30份、抗坏血酸钠3～5份、聚乙二醇40000.2～0.6份、聚乙烯吡咯烷酮0.2～0.8份、牛血清白蛋白0.5～2.0份和蒸馏水100份组成。由于组分过多，制备不是很方便，同时，在制备过程中对其抗压能力没有要求。
由于现阶段保加利亚乳杆菌菌粉均是通过冷冻干燥进行制备，因此，筛选和优化冻干保护剂配方，调整冻干工艺参数成为了提升保加利亚乳杆菌对环境耐受性最为直接和有效的手段。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服保加利亚乳杆菌自身耐受性较差的弱点，提供一种高活性、强抗逆性的保加利亚乳杆菌冻干保护剂及其冻干菌粉制备工艺，使其能够显著提高保加利亚乳杆菌的常温保存能力和抗压能力。
为实现上述目的，本发明提供一种可提高保加利亚乳杆菌常温保存能力和抗压能力的冻干保护剂。冻干保护剂的组成成分为：预胶化淀粉、脱脂乳粉、麦芽糊精和海藻糖，余量为水。其中预胶化淀粉具有较强的吸水性，能够维持菌粉低水活度状态，提高菌粉在贮藏及产品中的稳定性。脱脂乳粉、麦芽糊精和海藻糖能够有效减轻冻干损伤和干燥应力损伤，提高菌体的冻干存活率。
本发明还提供一个具体的技术方案，冻干保护剂各成份按重量计分别为：预胶化淀粉80～120份、脱脂乳粉50～100份、麦芽糊精80～100份、海藻糖20～40份、无菌蒸馏水640～770份。
本发明另一个目的是提供一种提高保加利亚乳杆菌常温保存能力和抗压能力的冻干菌粉制备工艺，包括如下步骤：
①保加利亚乳杆菌进行活化后，按照5-10％(v/v)的接种量进行逐级放大发酵培养，通过离心方式收集菌体，按照菌泥：冻干保护剂为1：1～3的重量比进行充分混和，制成冻干上机液。
②将冻干上机液倒入冻干托盘，上机液厚度控制在0.5～2.0cm，在-35℃～-45℃放入冻干机内预冻4-8h。
③干燥过程真空度始终控制在0.1-0.3mbar之间，一次干燥过程按照0.5～3℃/h的速率升温至0℃。解析干燥过程按照1～4℃/h的速率从0℃升温至30℃，维持2-4h。
④真空冷冻干燥后，将菌粉进行粉碎装入铝塑袋内密封存放与-20℃。
本发明的优点在于通过对保加利亚乳杆菌冻干保护剂的筛选和冻干工艺的优化，实现了保加利亚乳杆菌菌粉的常温保存，显著提高了其在后续片剂加工过程的抗压能力，有利于稳定生产，提高生产效率，降低生产和销售成本。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、菌株、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1.冻干保护剂以及冻干菌粉的制备
冻干保护剂各成份按重量计分别为：预胶化淀粉100份、脱脂乳粉50份、麦芽糊精80份、海藻糖20份、无菌蒸馏水750份。
冻干菌粉制备工艺，包括如下步骤：保加利亚乳杆菌进行活化后，按照5-10％(v/v)的接种量进行逐级放大发酵培养，通过离心方式收集菌体，按照菌泥:冻干保护剂为1：2的重量比进行充分混和，制成冻干上机液。将冻干上机液倒入冻干托盘，上机液厚度控制在1.5cm，在-40℃放入冻干机内预冻6h。干燥过程真空度始终控制在0.2mbar，一次干燥过程按照2℃/h的速率升温至0℃。解析干燥过程按照3℃/h的速率从0℃升温至30℃，维持3h。真空冷冻干燥后，将菌粉进行粉碎装入铝塑袋内密封存放于-20℃。
实施例2.冻干保护剂以及冻干菌粉的制备
冻干保护剂各成份按重量计分别为：预胶化淀粉120份、脱脂乳粉60份、麦芽糊精80份、海藻糖40份、无菌蒸馏水700份。
冻干菌粉制备工艺，包括如下步骤：保加利亚乳杆菌进行活化后，按照5-10％(v/v)的接种量进行逐级放大发酵培养，通过离心方式收集菌体，按照菌泥:冻干保护剂为1：3的重量比进行充分混和，制成冻干上机液。将冻干上机液倒入冻干托盘，上机液厚度控制在1.5cm，在-40℃放入冻干机内预冻4-8h。干燥过程真空度始终控制在0.2mbar之间，一次干燥过程按照2℃/h的速率升温至0℃。解析干燥过程按照3℃/h的速率从0℃升温至30℃，维持3h。真空冷冻干燥后，将菌粉进行粉碎装入铝塑袋内密封存放与-20℃。
实施例3.保加利亚乳杆菌菌粉常温保存稳定性试验
以现有菌粉生产工艺制备的保加利亚乳杆菌菌粉为对照，其冻干保护剂成份：脱脂乳粉180份、乳糖60份、酵母粉60份、无菌蒸馏水700份；冻干工艺：干燥过程真空度始终控制在0.2mbar之间，预冻温度-60℃，预冻时间10h,一次干燥过程按照4℃/h的速率升温至0℃。解析干燥过程按照2℃/h的速率从0℃升温至25℃，维持3h。
考察实施例1和2制备菌粉在25℃条件下贮藏8周的稳定性。其试验结果(表1)显示，与对照组相比，实施例1和2制备菌粉的常温保存能力显著提高。
表1保加利亚乳杆菌菌粉常温保存稳定性
实施例4.保加利亚乳杆菌菌粉抗压试验
以现有菌粉生产工艺制备的保加利亚乳杆菌菌粉为对照，其冻干保护剂成份：脱脂乳粉180份、乳糖60份、酵母粉60份、无菌蒸馏水700份；冻干工艺：干燥过程真空度始终控制在0.2mbar之间，预冻温度-60℃，预冻时间10h,一次干燥过程按照4℃/h的速率升温至0℃，解析干燥过程按照2℃/h的速率从0℃升温至25℃，维持3h。
将对照组菌粉和实施例1、2制备的保加利亚乳杆菌菌粉按照5×109cfu/g的标准分别与辅料进行混合，采用高速压片机制备片剂产品，通过片剂中活菌存活率考察其抗压能力。其试验结果(表2)显示，实施例1和2制备的保加利亚乳杆菌菌粉具有较强的抗压能力，能够显著提高产品的出成率。
表2保加利亚乳杆菌菌粉抗压能力
实施例5.保加利亚乳杆菌菌粉常温保存稳定性
由于实施例4将源于实施例1和2的菌粉制得片剂，对不同来源的片剂的常温保存稳定性进行考察，其结果显示(表3)，保加利亚乳杆菌菌粉与辅料混合后仍具备较高的常温保存能力，其产品达到常温贮存、运输和销售的要求。
表3保加利亚乳杆菌片剂产品常温保存稳定性