技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种多肽的制备方法，具体来说是一种用于抑制eif4g1表达的usp10模拟多肽的制备方法。
背景技术：
：
据统计，肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤首位。肺癌可分为非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,nsclc)和小细胞肺癌(smallcelllungcancer,sclc)两大类，其中非小细胞肺癌(nsclc)占所有肺癌病例的80％～85％。其中只有15-25％的非小细胞肺癌有手术治疗的机会，而即使接受根治性手术治疗，仍然有50％的nsclc患者会复发。现在传统的治疗手段(手术及放化疗)在提高非小细胞肺癌的五年生存率方面遇到了瓶颈，而随着近几年转化医学的研究推进，研究了一些肿瘤检测方法和靶点，开发出了一些靶向性药物，但由于对nsclc的疾病机制还不清楚，临床上仍然缺乏有效的早期检测指标和治疗靶点。因此，针对非小细胞肺癌的早期诊断指标和治疗靶点的转化医学基础研究具有重要意义。
真核细胞的蛋白质翻译起始是一个被高度调控的过程，在细胞增殖、分化、存活、维持动态平衡中发挥重要作用。肿瘤恶性表型通常与蛋白质合成失调关系密切，蛋白质翻译起始的调控成为当前肿瘤生物学研究的一个热点。真核翻译起始因子4γ(eukaryotictranslationinitiationfactor4gamma，eif4g)是启动蛋白质合成的关键组分，该因子有三个亚型：eif4g1、eif4g2和p97/nat1/dap-5。eif4g1作为eif4g的一个重要亚型，最早发现是作为真核蛋白质翻译起始因子复合物eif4f的组成蛋白之一。该复合物最重要的功能是将mrna募集到核糖体上，这是蛋白质合成的起始步骤，也是限速步骤。在蛋白质翻译这一生理过程中，eif4g1作为一个支架蛋白，介导eif4a、eif4e等翻译起始因子及其他参与起始的因子的结合从而调控蛋白的合成。
近年来越来越多的研究表明，eif4g1的异常表达与肿瘤的发生、进展密切相关。有研究报道，eif4g1可调控多个目的癌基因的表达，比如smad5、erα、hif1α、c-myc等，在eif4g1表达降低或活性受到抑制时，这些癌基因的表达也会同步下降。在多发性骨髓瘤细胞中，vegf可以通过akt信号通路，上调eif4g1的表达。通过抑制eif4g1的活性，可以有效抑制多发性骨髓瘤细胞的生长过程，有望成为治疗多发性骨髓瘤的潜在靶点。另有研究表明，乳腺癌细胞在电离辐射(ir)诱导的dna损伤应答(ddr)过程中，通过表达高水平的翻译起始因子eif4g1，介导协调选择性mrna翻译，促进了细胞的生长和增殖。有报导显示eif4g1位于染色体3q27上，该区域在50％的肺癌中被检测到有非正常的扩增，基因表达检测显示eif4g1在非小细胞肺癌组织中过量表达。tu等通过研究132例鼻咽癌(npc)患者的临床组织切片发现，eif4g1蛋白的表达水平与肿瘤t分级、淋巴结转移和临床分期呈正相关。通过研究107例npc患者手术后的生存时间与eif4g1水平之间关系发现，npc患者的预后总生存期与eif4g1水平密切相关；相比于eif4g1表达较低的患者，eif4g1高表达的患者总生存时间显著缩短；单因素分析结果显示，淋巴结受累、临床分期以及eif4g1表达都是影响npc患者总生存率的危险因素；cox比例风险模型分析结果显示，eif4g1的高表达能作为预测npc病人总生存期的一项重要指标。但是至今为止，没有研究显示nsclc中过量表达的eif4g1与nsclc组织学分级、分期及预后的相关性的研究报道。
eif4g1能促进肿瘤细胞蛋白翻译、肿瘤血管生成、诱导细胞恶性转化、调节细胞周期和抑制细胞凋亡等，从而影响肿瘤的发生与发展，其在乳腺癌、宫颈癌、头颈部鳞状细胞癌和鼻咽癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤中表达明显增高。eif4g1在蛋白质翻译起始过程中发挥关键调控作用，因此，最近针对eif4g1的小分子化合物抑制剂的研究也成为热点。4egi-1(e/z)-2-(2-(4-(3,4-dichlorophenyl)thiazol-2-yl)hydrazono)-3-(2-nitrophenyl)propanoicacid，eif4e/eif4ginhibitor-1)是近两年发现的能够在体内体外明显抑制eif4e/eif4g相互作用的小分子化合物。该化合物能够抑制eif4e和eif4g之间的相互作用，阻止翻译起始的限速步骤eif4f复合物的形成，体内和体外实验显示具有明显的抑制翻译起始的作用，有效抑制了肿瘤细胞的生长和增殖过程。另一个小分子化合物抑制剂是sbi-0640756(sbi-756)，该化合物以eif4g1为靶点破坏eif4f复合物，在体外有效地抑制nras、braf、和nf1-突变体黑色素瘤的生长。
去泛素化酶usp10(ubiquitin-specificprotease10)能特异的去泛素化并稳定p53，从而调节p53依赖的下游功能。在dna损伤应激条件下，usp1042位苏氨酸及337位丝氨酸被atm激酶磷酸化，磷酸化修饰能稳定usp10并促使usp10入核去泛素化p53，从而调节p53下游网络功能。通过作用于野生型p53，usp10能行使抑癌因子的功能。我们前期工作中发现，eif4g1能够直接与去泛素化酶usp10结合，通过免疫共沉淀实验进一步验证了eif4g1与usp10之间的直接相互作用，细胞学实验显示，过表达usp10可以明显下调细胞株中eif4g1的表达，因此我们推测，usp10通过与eif4g1结合，抑制eif4g1的表达，行使抑癌因子的功能。
综上所述，eif4g1在非小细胞肺癌病人肿瘤组织中高表达，eif4g1在调控非小细胞肺癌肿瘤细胞的生长增殖、凋亡和细胞周期、迁移和侵袭能力等一系列生理功能方面发挥重要作用，可以作为非小细胞肺癌的治疗靶点。因此我们拟通过筛选usp10的模拟多肽，抑制非小细胞肺癌患者体内eif4g1的表达水平，从而达到治疗和延缓疾病发展的目的。
技术实现要素：
：
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于抑制eif4g1表达的usp10模拟多肽的制备方法，所述的这种用于抑制eif4g1表达的usp10模拟多肽的制备方法要解决现有技术中治疗非小细胞肺癌的药物效果不佳的技术问题。
本发明提供了一种用于抑制eif4g1表达的usp10模拟多肽的制备方法，包括如下步骤：
1)以200个氨基酸残基为缺失单位，构建eif4g1c区缺失突变表达载体，其中保留eif4g1抗体结合位点氨基酸不变；免疫共沉淀和wb检测eif4g1缺失突变蛋白片段与usp10的结合情况，如果某一片段不能与usp10结合，说明关键残基存在于缺失区域内，初步确定结合关键残基所在区域；
2)在非小细胞肺癌细胞株中过表达以上步骤筛选到的不能与usp10结合的eif4g1缺失突变表达载体，wb检测usp10的表达水平，观察该缺失突变对usp10表达水平的影响；
3)检测以上eif4g1缺失突变是否影响usp10特异的去泛素化并稳定p53检测系统的活性；
4)在上面筛选出的关键区域内，进一步缩短缺失突变片段长度，以50个氨基酸残基为缺失单位构建缺失突变表达载体，通过哺乳动物细胞表达，免疫共沉淀和wb检测eif4g1缺失突变蛋白片段与usp10结合情况，进一步确定结合关键残基所在区域；
5)按以上步骤2)、3)的方法方法检测usp10的表达水平，以及usp10特异的去泛素化并稳定p53这一活性，进一步缩小影响eif4g1分子中与usp10结合的关键区域；
6)重复以上筛选方法，进一步将结合区域缩短至20-30氨基酸残基时，按以上方法检测usp10的表达水平以及usp10特异的去泛素化并稳定p53这一活性；
7)进行一系列关键残基的定点突变，用丙氨酸替换以上区域内可能的关键残基构建定点突变表达载体，采用哺乳动物细胞表达，免疫共沉淀检测和wb检测eif4g1定点突变蛋白与usp10的结合情况，最终确定eif4g1分子中与usp10结合的关键残基；
8)在以上片段缺失突变筛选过程中，如出现一个以上eif4g1缺失突变肽段与usp10结合力下降的情况，可能是eif4g1与usp10结合的关键残基分布在两个或多个不同缺失突变区域内，则改变缺失突变肽段划分区域，或者不同区域进行组合，按照以上方法逐步筛选，缩短eif4g1分子中与usp10结合的关键残基所在区域；
9)在关键残基的定点突变筛选过程中，如出现一个以上eif4g1突变肽段与usp10结合力下降的情况，可能是eif4g1序列中一个以上氨基酸是与usp10结合的关键残基，则同时突变2个或多个氨基酸，按照以上方法逐步筛选，直到最终确定eif4g1分子中与usp10结合的关键残基。
进一步的，在步骤7)中，用丙氨酸替换以上区域内带电荷氨基酸和带有较大疏水侧链的氨基酸残基。
本发明分别以200个氨基酸残基、50个氨基酸残基为缺失单位，构建usp10缺失突变表达载体，哺乳动物细胞表达，免疫共沉淀和wb检测usp10缺失突变蛋白片段与eif4g1的结合情况。重复以上筛选方法，进一步将结合区域缩短至20-30氨基酸残基时，进行一系列关键残基的定点突变，用丙氨酸替换以上区域内可能的关键残基，免疫共沉淀检测和wb检测eif4g1定点突变蛋白与usp10的结合情况，检测eif4g1的表达水平，最终确定usp10分子中与eif4g1结合的关键残基。
具体实施方式：
实施例1
本发明提供了一种用于抑制eif4g1表达的usp10模拟多肽的制备方法，包括如下步骤：
1)首先以200个氨基酸残基为缺失单位，构建eif4g1c区缺失突变表达载体，其中保留eif4g1抗体结合位点氨基酸不变，通过哺乳动物细胞表达，采用wb检测eif4g1的表达情况；免疫共沉淀和wb检测eif4g1缺失突变蛋白片段与usp10的结合情况，如果某一片段不能与usp10结合，说明关键残基存在于缺失区域内，初步确定结合关键残基所在区域；
2)在非小细胞肺癌细胞株h460，h1299和a549中过表达以上步骤筛选到的不能与usp10结合的eif4g1缺失突变表达载体，wb检测usp10的表达水平，观察该缺失突变对usp10表达水平的影响。
3)利用usp10能特异的去泛素化并稳定p53这一检测系统，检测以上eif4g1缺失突变是否影响usp10特异的去泛素化并稳定p53这一活性；
4)在上面筛选出的关键区域内，进一步缩短缺失突变片段长度，以50个氨基酸残基为缺失单位构建缺失突变表达载体，哺乳动物细胞表达。免疫共沉淀和wb检测eif4g1缺失突变蛋白片段与usp10结合情况，进一步确定结合关键残基所在区域。
5)按以上2)、3)步骤的方法方法检测usp10的表达水平，以及usp10特异的去泛素化并稳定p53这一活性，进一步缩小影响eif4g1分子中与usp10结合的关键区域。
6)重复以上筛选方法，进一步将结合区域缩短至20-30氨基酸残基时，按以上方法检测usp10的表达水平以及usp10特异的去泛素化并稳定p53这一活性；
7)进行一系列关键残基的定点突变，用丙氨酸替换以上区域内可能的关键残基构建定点突变表达载体，哺乳动物细胞表达。免疫共沉淀检测和wb检测eif4g1定点突变蛋白与usp10的结合情况，最终确定eif4g1分子中与usp10结合的关键残基；
8)在以上片段缺失突变筛选过程中，如出现一个以上eif4g1缺失突变肽段与usp10结合力下降的情况，可能是eif4g1与usp10结合的关键残基分布在两个或多个不同缺失突变区域内，则酌情改变缺失突变肽段划分区域，或者不同区域进行组合，按照以上方法逐步筛选，缩短eif4g1分子中与usp10结合的关键残基所在区域；
9)在关键残基的定点突变筛选过程中，如出现一个以上eif4g1突变肽段与usp10结合力下降的情况，可能是eif4g1序列中一个以上氨基酸是与usp10结合的关键残基，则酌情同时突变2个或多个氨基酸，按照以上方法逐步筛选，直到最终确定eif4g1分子中与usp10结合的关键残基。
进一步的，在步骤7)中，优先考虑带电荷氨基酸和带有较大疏水侧链的氨基酸残基)。