一种重组表达水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E的方法与流程

本发明属于蛋白的重组表达方法，特别是涉及一种在真核细胞中重组表达水痘-带状疱疹病毒v-oka株截短型糖蛋白e的方法。

背景技术：

水痘-带状疱疹病毒(varicella-zostervirus，vzv)是一种具包膜的双链dna病毒，属疱疹病毒科。原发感染引起水痘，再度被激活则引起带状疱疹(herpeszoster,hz)，病毒可通过接触或飞沫传播，并在人体神经节内终生潜伏，外因刺激下可再次发作。水痘减毒活疫苗容易诱发成年人、老年人的hz，尤其易引起老年人hz复发，部分人会伴有严重并发症。随着年龄的增加，减毒疫苗对人的保护率逐渐下降。目前减毒活疫苗是研究较多的一类疫苗，但在理论上存在潜在致癌性，而亚单位疫苗去除了dna成分，规避了上述风险，安全性更高。vzv包膜上有至少8种糖蛋白，其中糖蛋白e(ge)由orf68基因编码，包含623个氨基酸残基，分子量最大、含量最高，是病毒主要抗原，也是制备亚单位疫苗的主要抗原。那么如何大规模生产出高价值的vzv糖蛋白e也是制备亚单位疫苗的关键之处。

目前，有很多文献和专利报道了vzv糖蛋白e的改造及表达，如截短型geaa1-511(vafaietal.1993,1994,1995)；截短型geaa1-546(haumontetal.1996,jacquetetal.2002；glaxosmithklineep0405867b11990,wo0043527a12000)；截短型geaa1-539(cn1025173022011)；包含geaa37-161的融合蛋白的表达(cn1059067212016)等等。而体外基因真核细胞表达系统主要包括cho等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等，上述大多数vzv糖蛋白e的表达都使用了cho体系。然而与其它真核表达系统相比较，杆状病毒表达系统最突出的特点是能获得重组蛋白高水平的表达，最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50％，这有利于目的蛋白的大规模生产，对于疫苗的制备很关键。本发明采用了杆状病毒表达系统表达了可溶性的vzv-oka株截短型ge，该截短型ge保留了完整ge蛋白的抗原性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种重组表达水痘-带状疱疹病毒v-oka株截短型糖蛋白e的方法。

本发明提供的重组表达水痘-带状疱疹病毒v-oka株截短型糖蛋白e的方法，是将携带水痘-带状疱疹病毒v-oka株截短型糖蛋白e基因片段的杆粒转染入sf9昆虫细胞中，得到的重组杆状病毒感染sf9细胞，表达得到可溶性的重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白e。具体方法为：水痘-带状疱疹病毒v-oka株糖蛋白e基因进行密码子优化合成，选取ge的n端和c端部分氨基酸缺失的截短体作为表达区域，针对pfastbac^tmhta载体设计引物，选用ecorⅰ和notⅰ两个酶切位点，设计引物对相应区域基因序列进行pcr扩增，经过酶切，连接等系列操作，将目的基因克隆至pfastbac^tmhta供体质粒，生成重组载体质粒，将携带水痘-带状疱疹病毒v-oka株截短型糖蛋白e的基因的质粒转化至dh10bac感受态细胞中，经过系列蓝白斑筛选确认表型，提取杆粒，生成了重组杆粒。将携带水痘-带状疱疹病毒v-oka株截短型糖蛋白e的基因的杆粒转染入sf9昆虫细胞中，生成重组杆状病毒，扩增杆状病毒库，使用该病毒库感染sf9昆虫细胞，表达得到可溶性的重组水痘-带状疱疹病毒v-oka株截短型糖蛋白e。

所述的pfastbac^tmhta供体质粒n端有6×his标签，可利用金属螯合树脂进行重组融合蛋白纯化，带有tev蛋白酶酶切位点，可用于蛋白纯化后6×his标签的去除。

所述的筛选条件为：制备含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素、100μg/mlbluo-gal和40μg/mliptg的lb琼脂板，用于筛选dh10bac^tm转化体。具体方法为：将1ul重组质粒转化至100uldh10bac^tm感受态细胞中，加入900ullb培养基振荡培养4h后，使用lb培养基进行10倍连续稀释细胞，将200ul各稀释度的细胞接种在上述制备的lb琼脂板上，37℃孵育48h，挑选白斑菌落，将其重新涂布于新制备的上述lb琼脂板中，37℃过夜孵育，接种白色单克隆至3ml含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素的lb培养基中，37℃振荡培养，至浑浊后，取出2ml加入上述lb培养基中，37℃，250rpm过夜孵育。

用上述重组表达方法得到的水痘-带状疱疹病毒v-oka株截短型糖蛋白e也属于本发明的保护范围。

本发明提供的重组表达水痘-带状疱疹病毒v-oka株截短型糖蛋白e的方法，该方法是将去除部分信号肽、部分跨膜区和整个胞内区的水痘-带状疱疹病毒v-oka株截短型糖蛋白e基因转化入dh10bac感受态细胞中生成重组杆粒，重组杆粒转染sf9昆虫细胞后，生成的重组杆粒病毒感染sf9昆虫细胞表达可溶性的重组蛋白。该表达方法保留了水痘-带状疱疹病毒v-oka株截短型糖蛋白e蛋白分子的抗原决定簇，同时去除其部分信号肽、部分跨膜区和整个胞内区，且选择的pfastbac^tmhta载体n端有6×his标签，可利用金属螯合树脂进行重组融合蛋白纯化，带有tev蛋白酶酶切位点，可用于蛋白纯化后6×his标签的去除。该表达方法的优势在于：易于重组杆粒的筛选，简化后期纯化工作，能表达有困难的高价值蛋白，有助于目的蛋白的大规模生产，且批间质量稳定，可以为制备安全、有效的候选疫苗抗原预防带状疱疹的发生提供工艺基础。

附图说明

图1水痘-带状疱疹病毒v-oka株全长ge和本发明水痘-带状疱疹病毒v-oka株重组截短型ge的分子模式图

图2pfastbac^tmhta载体结构示意图

图3pcr扩增的截短型vzv-oka株gpe基因的琼脂糖凝胶电泳结果

图4重组表达载体质粒aagpe-pfastbac^tmhta的ecorⅰ和notⅰ双酶切鉴定结果

图5重组表达杆粒的pcr鉴定结果

图6用抗vzvgpe多抗进行重组杆粒初次感染sf9细胞后表达的重组截短型vzvgpe的westernblot的鉴定结果

图7用抗vzvgpe多抗进行p1病毒储液感染sf9细胞后表达的重组截短型vzvgpe的westernblot的鉴定结果

图8.用抗vzvgpe多抗和抗his标签的抗体进行p2病毒储液感染sf9细胞后不同时间点表达的重组截短型vzvgpe的westernblot的鉴定结果

具体实施方式

下面将结合具体实施例详细描述本发明。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1.水痘-带状疱疹病毒v-oka株截短型ge(gpe)的重组表达

本发明涉及水痘-带状疱疹病毒v-oka株截短型ge(gpe)的重组表达(简称截短型voka-gpe)

1.水痘-带状疱疹病毒v-oka株截短型ge(gpe)基因的获得(1)扩增截短型voka-gpe基因的引物设计和合成

图1示出水痘-带状疱疹病毒v-oka株全长ge和本发明水痘-带状疱疹病毒v-oka株重组截短型ge的分子模式图，与水痘-带状疱疹病毒v-oka株全长ge相比，本发明重组截短型voka-gpe去除了部分信号肽、部分跨膜区以及整个胞内区，且选择的pfastbac^tmhta载体n端有6×his标签，如图2所示的pfastbac^tmhta载体结构示意图。

(2)截短型vzv-oka株gpedna片段的扩增

以优化合成的水痘-带状疱疹病毒v-oka株全长ge基因组dna为模板，使用上述引物进行pcr扩增，pcr扩增体系为(总体积50ul)：基因组dna模板1ul，fastpfudnapolymerase(购自transgen)1ul，5×fastpfubuffer10ul，正反引物各1ul，2.5mmdntp4ul，ddh2o32ul；

pcr扩增条件：95℃2min，95℃20s→60℃20s→72℃1min(32个循环)，72℃5min。pcr反应结束后，对pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示(marker：dl2000；a：以基因组dna为模板，使用上述正反引物扩增出来的截短型vzv-oka株gpe基因；b：阴性对照)，显示获得了长度约1614bp的dna片段，与预期片段大小相符，使用dna胶回收试剂盒回收该目的片段。

2.重组表达载体质粒aagpe-pfastbac^tmhta的构建

将回收并纯化的vzvoka株gpedna片段和载体pfastbac^tmhta分别用ecorⅰ和notⅰ双酶切，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离后，使用dna胶回收试剂盒回收目的基因和载体的dna片段，再将回收的目的基因和载体pfastbac^tmhta大片段用t4dna连接酶22℃连接2h后4℃过夜进行连接。转化：将连接产物转入dh5α^tm大肠杆菌中，扩大培养(37℃，220rpm，12h),使用含有100μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂板筛选转化体，挑选单个菌落后，在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中37℃，220rpm过夜培养，使用去内毒素质粒dna小量提取试剂盒从大肠杆菌转化体中纯化高纯度的质粒dna，用ecorⅰ和notⅰ进行双酶切鉴定，鉴定结果如图4所示(marker：dl5000；a：质粒通过限制性内切酶ecorⅰ和notⅰ消化后得到的dna片段；b：pfastbac^tmhta空载质粒通过限制性内切酶ecorⅰ和notⅰ消化后得到的dna片段)，结果显示经过双酶切后得到了4820bp的载体pfastbac^tmhta和1614bp的截短型vzv-oka株gpe基因，与预期结果相符。最后对该质粒进行测序，如图5所示，测序结果表明获得了插入序列及位置均正确的携带有vzv-oka株截短型gpe基因重组表达载体及菌液，将该重组表达载体命名为aagpe-pfastbac^tmhta。

3.重组表达杆粒的构建及筛选

将aagpe-pfastbac^tmhta重组质粒转入dh10bac感受态细胞中，转座至杆粒内，生成重组杆粒，具体方法为：冰上解冻100uldh10bac感受态细胞，将1ul重组质粒加入细胞中，轻轻混匀，冰敷30min，热激细胞45s，冰上2min，添加900ul室温lb培养基，37℃、225rpm振荡培养4h，使用lb培养基对细胞进行10倍连续稀释，将200ul各稀释倍数的细胞接种到含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素、100μg/mlbluo-gal和40μg/mliptg的lb琼脂板，37℃孵育48h。挑选白色菌落将其重新涂布在含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素、100μg/mlbluo-gal和40μg/mliptg的lb琼脂板上，37℃过夜孵育，从重新涂布的琼脂板上挑选白色细菌单克隆，接种到3ml含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素和10μg/ml四环素的lb液体培养基内，37℃、250rpm培养，取出2ml加入200ml上述lb液体培养基中37℃、250rpm过夜培养。使用质粒dna小量提取试剂盒提取杆粒dna。对杆粒用引物puc/m13-f和puc/m13-r进行pcr鉴定，pcr鉴定结果如图6所示(m：5000dnamarker；质粒使用引物puc/m13-f和puc/m13-r进行pcr扩增，泳道出现与预期大小4043bp一致的dna片段)。

4.sf9细胞的转染及生成重组杆粒病毒

(1)sf9细胞的培养

使用不添加fbs及抗生素的esf912培养基重悬复苏的sf9细胞，转移至摇瓶中，27℃，100～120rpm悬浮培养，计算转染实验所需的sf9细胞数，并相应的扩增细胞，转染前确保细胞健康，存活率高于95％，且处于对数生长期，细胞密度为1.5×10⁶～2.5×10⁶个细胞/ml。

(2)sf9细胞的转染及生成重组杆粒病毒

a.将处于对数期的sf9细胞使用不含添加剂的grace昆虫细胞培养基(不得含有添加剂、fbs或抗生素)重悬，并铺到一个6孔组织培养板中，每孔2×10⁶个细胞，共铺3孔，27℃培养30min，让其贴壁生长。使用前混匀ii(转染试剂)，取8μl稀释于100μl不含添加剂的grace培养基中(无抗生素或血清)，短暂涡旋混匀(该混合物在室温中放置不得超过30min)。取5μl上述杆粒dna稀释于100μl不含添加剂的grace培养基中(无抗生素或血清)，轻轻混匀。将稀释后的dna与稀释的ii混合(总体积～210μl)，轻轻混匀，并在室温下孵育30分钟。将混合物逐滴加入上述1孔细胞中，并将未混合杆粒dna的ii稀释液加入1孔细胞中，剩余1孔细胞不做任何处理，作为阴性对照，27℃培养箱孵育细胞6h，吸出转染混合物，每孔加入2mlesf912培养基，27℃培养箱孵育细胞72h，直至观察到病毒感染征象(与空细胞对照相比，细胞停止生长；病毒出芽征象；细胞呈囊泡状；细胞从培养板上解离下来)，吹打细胞，吸至无菌的15ml离心管，4℃，500g，离心5min，吸取上清移至新的15ml离心管中，此为p1病毒储液。离心管中细胞用于检测截短型vzv-oka株gpe的表达。

b.取70ml处于对数期的sf9细胞(2.5×10⁶个细胞/ml)转移至250ml锥形培养瓶中，将上述步骤a中收集的2mlp1病毒储液加入培养瓶的细胞中，27℃摇床，100～120rpm悬浮培养，随后每天取出10ul细胞在显微镜下观察细胞病变情况，当观察到细胞有接近50％的死亡时，将培养瓶中的细胞转移到无菌的50ml离心管中，4℃，500g，离心5min，吸取上清转移到新的离心管中，此为p2病毒储液，避光储存于4℃。离心管中细胞用于检测截短型vzv-oka株gpe的表达。

c.考虑到重组杆粒病毒感染时间的不同可能对截短型vzv-oka株gpe的表达有影响，所以将1ml上述步骤b中收集的p2病毒储液加入100mlsf9细胞(2.5×10⁶个细胞/ml)中，27℃摇床，100～120rpm悬浮培养，分别在感染后48h、72h和96h收集细胞，用于检测截短型vzv-oka株gpe的表达。

5.重组截短型ge(gpe)的鉴定

a.将上述步骤a中收集到的细胞用300ulpbs重悬细胞，在冰浴情况下使用细胞超声破碎仪超声破碎这些细胞(超声参数：60hz、超声3s停3s、时间3min)，4℃，14500rpm，离心30min。取200ul上清加入50ul5×sds，置于99℃金属浴中加热10min。弃去剩余上清，使用200ulpbs吹打沉淀，充分混匀，加入50ul5×sds，置于99℃金属浴中加热10min。用抗vzvgpe多抗(1:4000)进行westernblot鉴定，鉴定结果如图7所示(泳道a：aagpe-pfastbac^tmhta杆粒感染的细胞超声破碎后收集的上清；泳道b：aagpe-pfastbac^tmhta杆粒感染的细胞超声破碎后收集的沉淀；泳道c：只加入ii转染试剂的细胞超声破碎后收集的上清；泳道d：只加入ii转染试剂的细胞超声破碎后收集的沉淀；泳道e：不做任何处理的细胞超声破碎后收集的上清；泳道f：不做任何处理的细胞超声破碎后收集的沉淀)，可以看出aagpe-pfastbac^tmhta杆粒感染的细胞超声破碎后的上清和沉淀在55kda处有蛋白印记，与预期的蛋白分子量相一致，表明重组杆粒初次感染表达得到少量的可溶性目的蛋白。

b.将上述步骤b中收集到的细胞用3mlpbs重悬细胞，使用细胞超声破碎仪超声破碎这些细胞(超声参数：10mm探头、100w、超声3s停3s、时间5min)，4℃，14500rpm，离心30min。取200ul上清加入50ul5×sds，置于99℃金属浴中加热10min。弃去剩余上清，使用3mlpbs吹打沉淀充分混匀，吸取200ul溶液加入50ul5×sds，置于99℃金属浴中加热10min。用抗vzvgpe多抗进行westernblot鉴定，鉴定结果如图8所示(泳道a：p1病毒储液感染的细胞经超声破碎后的上清；泳道a：p1病毒储液感染的细胞经超声破碎后的沉淀)，看到如上相同的蛋白印记，含量比初次感染表达的重组蛋白多，表明p1病毒储液感染能够得到更多的可溶性目的蛋白。

c.将上述步骤c中不同时间点(48h、72h、96h)收集到的细胞分别用3mlpbs重悬细胞，使用细胞超声破碎仪超声破碎这些细胞(超声参数：10mm探头、100w、超声3s停6s、时间2min)，4℃，14500rpm，离心30min。取200ul上清加入50ul5×sds，置于99℃金属浴中加热10min。弃去剩余上清，使用3mlpbs吹打沉淀充分混匀，吸取200ul溶液加入50ul5×sds，置于99℃金属浴中加热10min。分别用商品化抗vzvge多抗(1:4000)和抗his标签(1:5000)的抗体进行westernblot鉴定，鉴定结果如图9所示(泳道a：p2病毒储液感染感染48h的细胞经超声破碎后收集的上清；泳道b：p2病毒储液感染感染48h的细胞经超声破碎后收集的沉淀；泳道c：p2病毒储液感染感染72h的细胞经超声破碎后收集的上清；泳道d：p2病毒储液感染感染72h的细胞经超声破碎后收集的沉淀；泳道e：p2病毒储液感染感染96h的细胞经超声破碎后收集的上清；泳道f：p2病毒储液感染感染96h的细胞经超声破碎后收集的沉淀)，同样在55kda出看到了预期的更大含量的蛋白印记，并且在感染48h时可溶性目的蛋白的表达量最大，该结果显示我们利用真核细胞(昆虫细胞)所表达的截短型糖蛋白e(gpe)具有被抗ge多克隆抗体所识别的抗原性特征。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。