一种一氧化氮供体小分子及其制备与应用的制作方法

本发明涉及化学和生物技术领域，具体涉及一种利用硝基还原酶释放一氧化氮的一氧化氮供体小分子及制备方法与在肿瘤细胞活性抑制中的应用。

背景技术：

硝基还原酶(ntr)是一种依赖于黄素单核苷酸(fmn)或黄素腺嘌呤二核苷酸(hd)的细胞质酶，在辅酶nad(p)h还原剂的作用下可以将芳硝基化合物还原为芳胺化合物。在低氧条件下，细胞内线粒体功能会受到抑制，体内硝基还原酶将过度表达，而缺氧状态是癌症生长过程中普遍存在的现象。因此，硝基还原酶不仅可以作为疾病的标志物，也可以被用作药物递送系统的激活剂，从而获得癌症靶向性。

一氧化氮(no)是一种简单的气体分子，但其对生理系统的功能调节却是复杂的，它可以根据自身浓度的高低产生保护性或毒性作用。在哺乳动物细胞中，线粒体是内源性no产生的主要场所，在调节细胞功能中起关键作用。一般肿瘤细胞线粒体中产生的内源性no含量有限，很大程度上并不能很好地发挥抗肿瘤效应。因此，研究学者开始关注通过一定的方法或技术手段向肿瘤细胞中输送高浓度的外源性no，以达到抗肿瘤目的。但是，由于这种气态物种的高反应性以及不方便处理等缺点，不能将其直接输送到生物系统，因此研究者们通过利用能在机体内释放一氧化氮的化合物，又被称为no供体，向机体输送高水平no，以此达到抗肿瘤目的。

本发明设计并合成了一种能够在肿瘤细胞线粒体内硝基还原酶的触发下释放一氧化氮的供体小分子。该供体小分子结合了硝基还原酶触发基团和新型一氧化氮供体(n-羟基胍)，使得小分子中的硝基在肿瘤细胞线粒体内硝基还原酶的催化下被还原成氨基，同时经过分子内电子重排后，在生理条件下释放一氧化氮。

技术实现要素：

本发明目的是利用肿瘤细胞线粒体内过表达的硝基还原酶为触发因子，通过结合触发基团与新型no供体(n-羟基胍)，制备了一种可触发释放一氧化氮的供体分子，该供体小分子在正常生理条件下是稳定的，只有在一定的刺激条件下才会被激活，释放no，从而促使肿瘤细胞凋亡，为癌症治疗提供一种新方式。

本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种式(i)所示可触发释放一氧化氮的供体小分子，式(i)中，包括一个跟细胞内小分子或蛋白质等大分子反应的触发基团，以及一个一氧化氮供体。

第二方面，本发明提供一种式(i)所示一氧化氮供体小分子的制备方法，具体如下：

1、本发明所述合成式(i)所示一氧化氮供体小分子的反应路线如下：

2、本发明所述式(i)所示一氧化氮供体小分子的制备方法，按照如下步骤进行：

(1)将苯基硫脲(s-1)溶于去离子水中，加入钼酸钠二水合物，冰浴(优选0℃)环境下，搅拌过程中缓慢滴加30％过氧化氢，室温反应4个小时后，抽滤，收集固体沉淀，将沉淀用去离子水洗涤(优选三次)，洗涤后的固体溶于甲醇中，加入石油醚沉淀，抽滤至干，得到式(s-2)所示化合物；

(2)冰浴(优选0℃)环境下，将对硝基苄溴(1-1)溶于乙腈中，加入n-羟基氨基甲酸叔丁酯，搅拌过程中，缓慢滴加二氮杂二环，室温搅拌反应3个小时后，反应液蒸除溶剂后加入10倍体积饱和碳酸钾水溶液，并用二氯甲烷萃取(优选3次，合并有机相)，有机相用饱和盐水洗涤、无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液浓缩后，以体积比1:5的乙酸乙酯/石油醚为展开剂进行硅胶薄层层析，收集rf值为0.45的产物，干燥，得到式(1-2)所示化合物；

(3)将步骤(2)所得式(1-2)所示化合物溶于4.0m氯化氢二氧六环溶液中，在室温下搅拌反应30分钟后，将反应混合物滴入乙醚中，离心，弃去上清液，抽干乙醚，得到式(1-3)所示化合物；

(4)将步骤(1)所得式(s-2)所示化合物和步骤(3)所得式(1-3)所示化合物，溶于n,n-二甲基甲酰胺中，然后加入4-二甲氨基吡啶和氢氧化钾，在室温搅拌反应48个小时，将反应液倒入去离子水中，然后用二氯甲烷萃取(优选3次，合并有机相)，有机相用饱和盐水洗涤、无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液浓缩后，以体积比1:1的乙酸乙酯/石油醚为展开剂进行硅胶薄层层析，收集rf值为0.5的产物，干燥，得到式(i)所示一氧化氮供体小分子；

进一步，步骤(1)中去离子水体积用量以式(s-1)所示化合物物质的量计为10-20ml/mmol(优选15ml/mmol)；式(s-1)所示化合物与钼酸钠二水合物、30％过氧化氢的投料物质的量之比为1:0.01～0.02:1～5，优选1:0.015:3；优选甲醇体积用量以式(s-1)所示化合物物质的量计15-20ml/mmol(优选18ml/mmol)，石油醚体积用量以式(s-1)所示化合物物质的量计(5-10ml/mmol，优选8ml/mmol)，甲醇：石油醚体积比为12：5。

进一步，步骤(2)中乙腈体积用量以式(1-1)所示化合物物质的量计为5-15ml/mmol(优选8.7ml/mmol)，式(1-1)所示化合物与n-羟基氨基甲酸叔丁酯、二氮杂二环的投料物质的量之比为1:1～3:1～3，优选1:1.3:1。

进一步，步骤(2)滤液浓缩至0.5～1g/ml，优选0.6g/ml。

进一步，步骤(3)中4.0m氯化氢二氧六环溶液体积用量以式(1-2)所示化合物质量计为5-15ml/g，优选5.6ml/g。优选沉淀析出使用乙醚为氯化氢二氧六环溶液体积的5～10倍，优选6倍。

进一步，步骤(3)将反应混合物滴入(优选用一次性滴管)加有乙醚的离心管中，观察到有白色固体析出，然后13000rpm离心3分钟，弃去上清液，再加入乙醚，离心，去上清，重复操作3次；抽干乙醚，得到式(1-3)所示化合物。

进一步，步骤(4)中n,n-二甲基甲酰胺体积用量以式(1-3)所示化合物物质的量计为10-20ml/mmol(优选13ml/mmol)，式(1-3)所示化合物与式(s-2)所示化合物、4-二甲氨基吡啶和氢氧化钾的投料物质的量之比为1:1～3:1～2:1～5，优选1:1.5:1:3。去离子水体积用量以式(1-3)所示化合物物质的量计为120-130ml/mmol。

第三方面，本发明还提供一种所述式(i)所示供体小分子在制备肿瘤细胞活性抑制剂中的应用，所述细胞为人前列腺癌细胞pc-3。

本发明所述供体小分子(i)通过与细胞共孵育，可在肿瘤细胞线粒体中过表达的硝基还原酶的触发下释放高水平一氧化氮气体，从而使肿瘤细胞凋亡，以此达到抑制肿瘤细胞活性的目的。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明以肿瘤细胞内过表达的硝基还原酶(ntr)为触发因子，结合新型no供体，开发了一种可以在肿瘤细胞线粒体内释放no的小分子，并具有良好的抗肿瘤细胞活性的功能。本发明选用的no供体是其第一次被应用于活细胞研究，为开发新的no释放系统和癌症的治疗提供了一种新策略。

附图说明

图1为本发明中供体小分子(i)的核磁氢谱。

图2为本发明中供体小分子(i)的核磁碳谱。

图3为硝基还原酶对供体小分子(i)释放no检测图。

图4为供体小分子(i)抗肿瘤细胞增殖活性分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述室温为22-26℃。

实施例1供体小分子(i)的合成

1、化合物(s-2)的合成

向100ml圆底烧瓶中加入苯基硫脲(6.57mmol，购于安耐吉)，钼酸钠二水合物(0.10mmol，购于安耐吉)和去离子水(100ml)。0℃下向混合液中滴加30％过氧化氢(2.24ml，19.73mmol)，滴毕，在室温下反应4个小时，通过tlc监测反应。反应完成后，抽滤，收集固体沉淀，将沉淀用去离子水(100ml)清洗三次。再将固体混合物溶于甲醇(120ml)中并用石油醚(50ml)沉淀，抽滤至干，得到化合物(s-2)1.38mmol，收率21％。

¹hnmr(500mhz,dmso)δ9.61(s,1h),7.51(dd,j＝10.7,4.8hz,2h),7.41(t,j＝7.4hz,1h),7.32-7.28(m,2h).

2、化合物(1-2)的合成

0℃环境下，向对硝基苄溴(1-1，2.31mmol)的乙腈(20ml)溶液中加入n-羟基氨基甲酸叔丁酯(3.01mmol)，并缓慢滴加二氮杂二环(2.31mmol)，滴毕，在室温下搅拌反应3个小时，通过tlc监测反应。反应液蒸除溶剂后加入10倍体积饱和碳酸钾水溶液，并用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，有机层用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液浓缩至0.6g/ml后，以体积比1:5的乙酸乙酯/石油醚为展开剂进行硅胶薄层层析，收集rf值为0.45的产物，干燥，得到化合物(1-2)1.73mmol，收率75％。

¹hnmr(500mhz,dmso)δ8.25-8.22(m,2h),7.59(d,j＝8.6hz,2h),7.23(s,1h),4.97(s,2h),1.49(s,9h).

3、化合物(1-3)的合成

向50ml圆底烧瓶中加入化合物(1-2)0.89g(1.17mmol)和4.0m氯化氢二氧六环溶液5ml，在室温下搅拌反应30分钟。反应结束后，将反应混合物用一次性滴管滴入加有乙醚30ml的离心管中，观察到有白色固体析出。然后13000rpm离心3分钟，弃去上清液，再加乙醚30ml，离心，去上清，重复操作3次。抽干乙醚，得到化合物(1-3)0.41g(0.85mmol)，产率73％。

¹hnmr(500mhz,dmso)δ8.26(dd,j＝8.9,2.0hz,2h),7.70(d,j＝8.7hz,2h),5.24(s,2h).

4、一氧化氮供体小分子(i)的合成

向步骤3制备的化合物(1-3)(1.19mmol)的n,n-二甲基甲酰胺(15ml)溶液中加入步骤1制备的化合物(s-2)(1.79mmol)，4-二甲氨基吡啶(1.19mmol)和氢氧化钾(3.57mmol)。在室温下搅拌反应48个小时，通过tlc监测反应。将反应液倒入去离子水(150ml)中，然后用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，有机层用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液浓缩至0.6g/ml后，以体积比1:1的乙酸乙酯/石油醚为展开剂进行硅胶薄层层析，收集rf值为0.5的产物，干燥，得到供体小分子(i)0.048g(0.17mmol)，产率14％，核磁图谱见图1，图2。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.18(d,j＝8.7hz,2h),7.53(d,j＝8.6hz,2h),7.22(t,j＝7.1hz,2h),7.09(d,j＝7.4hz,2h),6.97(t,j＝6.8hz,1h),5.02(s,2h),4.72(s,1h).

¹³cnmr(126mhz,cdcl3)δ151.85,147.33,146.34,139.88,129.27,128.23,123.52,122.59,119.56,77.28,77.03,76.78,73.91.

实施例2评估供体小分子释放一氧化氮的能力

1)待测样品：

a组：供体小分子(i)(500μm)+pbs(ph＝7.4)；

b组：供体小分子(i)(5μm)+ntr(50μg/ml)+nadh(500μm)+pbs(ph＝7.4)；

c组：供体小分子(i)(50μm)+ntr(50μg/ml)+nadh(500μm)+pbs(ph＝7.4)；

d组：供体小分子(i)(500μm)+ntr(50μg/ml)+nadh(500μm)+pbs(ph＝7.4)；

对照组：pbs(ph＝7.4)；

其中，ntr为硝基还原酶，nadh为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。每组两个平行。置于25℃，1000rpm的混匀仪上震荡，即为待测样品。

2)标准品：用pbs(ph＝7.4)稀释亚硝酸钠标准品，设置6个标准品浓度梯度，其终浓度为2.5，5，10，20，40，80μm。

3)取出griessreagenti和griessreagentii(购于碧云天，s0021)，恢复室温，震荡均匀后使用。

4)加样：在96孔板中，按50μl/孔，分别加入标准品及待测样品。然后向各孔中加入50μl室温griessreagenti，再向各孔中加入50μl室温griessreagentii，将96孔板轻轻震荡数次，待各孔反应液完全混匀后，并于37℃孵育箱中反应10分钟。用酶标仪在540nm波长处测定吸光度(od值)。

8)以浓度(x)为横坐标，所测得的标准品od值(y)为纵坐标，利用excel绘制标准曲线(y＝0.0056x+0.0457，r²＝0.9998)。

9)利用此标准曲线计算各待测样品的一氧化氮含量。

结果如图3所示，在pbs中仅加入供体小分子(i)的条件下，几乎没有检测到一氧化氮释放。当加入一定剂量的ntr(终浓度为50μg/ml)+nadh(终浓度为500μm)时，检测到一定浓度的一氧化氮，且随着供体浓度的增加，一氧化氮浓度逐渐增大。证明我们设计的供体小分子(i)可成功释放一氧化氮。

实施例3评估供体小分子(i)的抗肿瘤细胞增殖活性

1、细胞培养条件

选用人前列腺癌细胞pc-3，购自atcc公司。使用细胞培养基(含10％胎牛血清、0.1mg/ml链霉素和100u/ml青霉素的dmem高糖培养基(购自杭州泽衡生物科技有限公司))，在含37℃/5％co2，饱和湿度的细胞培养箱中培养细胞。

2、供体小分子(i)的抗肿瘤细胞增殖活性检测

在96孔细胞培养板中，以5000个细胞/孔的接种量接种长势良好的人前列腺癌细胞pc-3(含有100μl细胞培养基)，并置于37℃/5％co2培养箱贴壁培养16～20个小时。

实验组：分别加入终浓度5μm，50μm，500μm的供体小分子(i)。

对照组：加入等体积量pbs(ph＝7.4)。

调零组：加入等体积量细胞培养基。

每组2个平行。置于37℃/5％co2培养箱曝毒72个小时后，每孔加10μlcck-8，继续孵育1个小时(37℃/5％co2)后，用酶标仪检测450nm波长处每孔的吸光度(od值)，利用公式计算细胞存活率，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制柱状图，结果如图4所示，孵育72小时后，随着供体浓度的增加细胞存活率明显下降，表现出良好的抗肿瘤细胞增殖活性。

细胞存活率＝(实验组或对照组)/(调零组)×100％。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。