丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合多肽及其使用方法与流程

本申请是原案申请日为2012年6月28日、申请号为201280041956.5(国际申请号为pct/us2012/044730)、发明名称为“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合多肽及其使用方法”的专利申请的分案申请。

相关申请

本申请要求2011年6月28日提交的美国临时申请号61/502055、2011年12月14日提交的美国临时申请号61/570394、2011年12月19日提交的美国临时申请号61/577204和2012年4月25日提交的美国临时申请号61/638168的权益。这些申请每一个的内容均通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本发明涉及包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列和第二多肽的分子，具体地说是多肽，更具体地说是融合蛋白。另外，本发明涉及包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列、第二多肽和第三多肽的融合蛋白。准确地讲，本发明涉及包括至少一个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽和第二多肽的融合蛋白或包括至少一个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽、第二多肽和第三多肽的融合蛋白，其中本发明融合蛋白的第二多肽和第三多肽可以是以下的至少一个：fc多肽或来源于fc多肽的氨基酸序列；细胞因子靶向多肽或来源于细胞因子靶向多肽的序列；含有wap结构域的多肽或来源于含有wap的多肽的序列；或白蛋白多肽或来源于血清白蛋白多肽的氨基酸序列。本发明还涉及在各种治疗和诊断适应症中使用所述分子的方法以及生产所述分子的方法。

发明背景

丝氨酸蛋白酶活性异常或蛋白酶对蛋白酶抑制剂失衡可导致蛋白酶介导的组织破坏和炎性反应。因此，存在对靶向丝氨酸蛋白酶活性异常和/或蛋白酶对蛋白酶抑制剂失衡的治疗剂和疗法的需要。此外，可通过减少异常细胞因子信号转导和丝氨酸蛋白酶活性获得增强的治疗效果。另外，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白蛋白质显示抗感染活性，而靶向炎性细胞因子显示增加感染风险。本发明的融合蛋白具有减少炎性细胞因子活性和限制感染风险的潜力。

发明概述

本文所述融合蛋白包括至少丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列(多肽1)和第二多肽(多肽2)。另外，本文所述融合蛋白包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列(多肽1)、第二多肽(多肽2)和第三多肽(多肽3)。本文可互换使用的术语“融合蛋白”和“融合多肽”是指与至少第二多肽或来源于至少第二多肽的氨基酸序列有效连接的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列。融合蛋白的个别元素可以多种方式的任一种连接，包括例如直接连接、使用中间体或间隔肽、使用接头区、使用铰链区或使用接头区和铰链区两者。在一些实施方案中，接头区可落入铰链区的序列内，或者，铰链区可落入接头区的序列内。优选接头区是肽序列。例如，接头肽约包括0-40个氨基酸，例如0-35个氨基酸、0-30个氨基酸、0-25个氨基酸或0-20个氨基酸。优选铰链区为肽序列。例如，铰链肽约包括0-75个氨基酸，例如0-70个氨基酸、0-65个氨基酸或0-62个氨基酸。在融合蛋白包括接头区和铰链区两者的实施方案中，优选接头区和铰链区各自为肽序列。在这些实施方案中，铰链肽和接头肽合起来约包括0-90个氨基酸，例如0-85个氨基酸或0-82个氨基酸。

在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽和第二多肽可通过中间体结合蛋白连接。在一些实施方案中，融合蛋白的基于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的部分和第二多肽部分可为非共价连接的。

在一些实施方案中，本发明的融合蛋白可具有自n端至c端方向或自c端至n端方向的下式之一：

多肽1(a)–铰链m–多肽2(b)

多肽1(a)–接头n–多肽2(b)

多肽1(a)–接头n–铰链m–多肽2(b)

多肽1(a)–铰链m–接头n–多肽2(b)

多肽1(a)–多肽2(b)–多肽3(c)

多肽1(a)–铰链m–多肽2(b)–铰链m–多肽3(c)

多肽1(a)–接头n–多肽2(b)–接头n–多肽3(c)

多肽1(a)–铰链m–接头n–多肽2(b)–铰链m–接头n–多肽3(c)

多肽1(a)–接头n–铰链m–多肽2(b)–接头n–铰链m–多肽3(c)

其中n为0-20的整数，其中m为1-62的整数，其中a、b和c为至少1的整数。这些实施方案包括上式及其任何变化或组合。例如，式中多肽的顺序还包括多肽3(c)–多肽1(a)–多肽2(b)、多肽2(b)–多肽3(c)–多肽1(a)或其任何变化或组合。

在一些实施方案中，多肽1序列包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白是一类具有类似结构的蛋白质，最初被鉴定为一组能够抑制蛋白酶的蛋白质。以非限制性实例的方式，适用于本文提供的融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白蛋白质包括α-1抗胰蛋白酶(aat)、抗胰蛋白酶相关蛋白(serpina2)、α1-抗胰凝乳蛋白酶(serpina3)、kallistatin(serpina4)、单核细胞嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(serpinb1)、pi-6(serpinb6)、抗凝血酶(serpinc1)、纤溶酶原激活物抑制剂1(serpine1)、α2-抗纤溶酶(serpinf2)、补体1-抑制剂(serping1)和神经丝抑蛋白(serpini1)。

在一些实施方案中，多肽1序列包括α-1抗胰蛋白酶(aat)多肽序列或来源于aat的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽1序列包括aat蛋白的一部分。在一些实施方案中，多肽1序列至少包括aat蛋白的反应部位环部分。在一些实施方案中，aat蛋白的反应部位环部分至少包括氨基酸序列：gteaagamfleaipmsippevkfnk(seqidno:1)。

在一个优选的实施方案中，aat多肽序列或来源于aat的氨基酸序列是或来源于人aat多肽序列。

在一些实施方案中，融合蛋白包括具有下列氨基酸序列的全长人aat多肽序列：

在一些实施方案中，融合蛋白包括与seqidno:2的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人aat多肽序列。

在一些实施方案中，aat多肽序列是以下genbank登录号所示的一个或多个人aat多肽序列，或者来源于aat多肽的氨基酸序列源自于以下genbank登录号所示的一个或多个人aat多肽序列：aab59495.1、caj15161.1、p01009.3、aab59375.1、aaa51546.1、caa25838.1、np_001002235.1、caa34982.1、np_001002236.1、np_000286.3、np_001121179.1、np_001121178.1、np_001121177.1、np_001121176.16、np_001121175.1、np_001121174.1、np_001121172.1和/或aaa51547.1。

在一些实施方案中，融合蛋白含有一个或多个突变。例如，融合蛋白在融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白部分的甲硫氨酸(met)残基处含有至少一个突变。在这些met突变中，met残基可被任何氨基酸取代。例如，met残基可被具有疏水侧链的氨基酸(例如亮氨酸(leu，l))取代。不希望受理论束缚，met突变防止氧化和随后本发明融合蛋白抑制活性的失活。在一些实施方案中，met残基可被带电荷的残基(例如谷氨酸(glu，e))取代。在一些实施方案中，met突变在aat多肽的358位处。例如，met突变是met358leu(m358l)。在一些实施方案中，met突变在aat多肽的351位处。例如，met突变是met351glu(m351e)。在一些实施方案中，met突变在aat多肽的351位和358位处，例如，met突变是met351glu(m351e)和met358leu(m358l)。例如，融合aat多肽的这种变体的反应部位环具有下列序列：gteaagaefleaiplsippevkfnk(seqidno:32)。在一些实施方案中，met突变在aat多肽的351位和358位处，例如，met突变是met351leu(m351l)和met358leu(m358l)。例如，融合aat多肽的这种变体的反应部位环具有下列序列：gteaagalfleaiplsippevkfnk(seqidno:33)。

在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合蛋白的第二多肽(多肽2)是fc多肽或来源于fc多肽。这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc融合蛋白”。本文所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc融合蛋白至少包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的氨基酸序列和fc多肽或来源于fc多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc融合蛋白包括单个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc融合蛋白包括多于一个的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽，且这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(a’)-fc融合蛋白”，其中(a’)为至少2的整数。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(a’)-fc融合蛋白中的各个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽包括相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(a’)-fc融合蛋白中的各个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽包括具有不同氨基酸序列的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(a’)-fc融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽可位于融合蛋白内的任何位置。

在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽至少包括aat蛋白的反应部位环部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，aat蛋白的反应部位环部分至少包括seqidno:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽至少包括aat蛋白的反应部位环部分的变体的氨基酸序列。在一些实施方案中，aat蛋白的反应部位环部分的变体至少包括seqidno:32或seqidno:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽至少包括具有seqidno:2的氨基酸序列的全长人aat多肽序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽包括与seqidno:2或32或33的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人aat多肽序列。

在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽包括其为以下genbank登录号所示的人aat多肽序列中的一个或多个的aat多肽序列，或包括其来源于以下genbank登录号所示的人aat多肽序列中的一个或多个的源自于aat多肽的氨基酸序列：aab59495.1、caj15161.1、p01009.3、aab59375.1、aaa51546.1、caa25838.1、np_001002235.1、caa34982.1、np_001002236.1、np_000286.3、np_001121179.1、np_001121178.1、np_001121177.1、np_001121176.16、np_001121175.1、np_001121174.1、np_001121172.1和/或aaa51547.1。

在一些实施方案中，融合蛋白的fc多肽是人fc多肽，例如人iggfc多肽序列或来源于人iggfc多肽序列的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，fc多肽是人igg1fc多肽或来源于人igg1fc多肽序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc多肽是人igg2fc多肽或来源于人igg2fc多肽序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc多肽是人igg3fc多肽或来源于人igg3fc多肽序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc多肽是人igg4fc多肽或来源于人igg4fc多肽序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc多肽是人igmfc多肽或来源于人igmfc多肽序列的氨基酸序列。

在本发明的融合蛋白包括fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的fc多肽包括具有下列氨基酸序列的人igg1fc多肽序列：

在本发明的融合蛋白包括fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的fc多肽包括与seqidno:3的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人igg1fc多肽序列。

在本发明的融合蛋白包括fc多肽的一些实施方案中，fc多肽被突变或修饰以提高fcrn结合。在这些实施方案中，突变或修饰的fc多肽包括使用kabat编号系统的下列突变：met252tyr、ser254thr、thr256glu(m252y、s256t、t256e)或met428leu和asn434ser(m428l、n434s)。在一些实施方案中，fc多肽部分经突变或以其它方式修饰，使得破坏fc介导的二聚化。在这些实施方案中，融合蛋白在性质上是单体。

在本发明的融合蛋白包括fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的fc多肽包括具有下列氨基酸序列的人igg2fc多肽序列：

在本发明的融合蛋白包括fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的fc多肽包括与seqidno:4的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人igg2fc多肽序列。

在本发明的融合蛋白包括fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的fc多肽包括具有下列氨基酸序列的人igg3fc多肽序列：

在本发明的融合蛋白包括fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的fc多肽包括与seqidno:5的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人igg3fc多肽序列。

在本发明的融合蛋白包括fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的fc多肽包括具有下列氨基酸序列的人igg4fc多肽序列：

在本发明的融合蛋白包括fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的fc多肽包括与seqidno:6的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人igg4fc多肽序列。

在本发明的融合蛋白包括fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的fc多肽包括具有下列氨基酸序列的人igmfc多肽序列：

在本发明的融合蛋白包括fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的fc多肽包括与seqidno:7的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人igmfc多肽序列。

在本文提供的融合蛋白的一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合蛋白的第二多肽(多肽2)是细胞因子靶向多肽或来源于细胞因子靶向多肽。这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向多肽融合蛋白”。本文所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向多肽融合蛋白至少包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列和细胞因子靶向多肽或其衍生物。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向多肽融合蛋白包括单个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向多肽融合蛋白包括多于一个的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽，且这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(a’)-细胞因子靶向多肽融合蛋白”，其中(a’)为至少2的整数。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(a’)-细胞因子靶向多肽融合蛋白中的各个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽包括相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(a)-细胞因子靶向多肽融合蛋白的每个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽包括具有不同氨基酸序列的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽。

在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向多肽融合蛋白的细胞因子靶向多肽是细胞因子受体或来源于细胞因子受体。在一个优选的实施方案中，细胞因子靶向多肽或来源于细胞因子受体的氨基酸序列是或来源于人细胞因子受体序列。在其它实施方案中，细胞因子靶向多肽是抗体或抗体片段，例如抗细胞因子抗体或抗细胞因子抗体片段。在一个优选的实施方案中，细胞因子靶向多肽或来源于抗体或抗体片段的氨基酸序列来源于嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体序列。术语抗体片段包括单链、fab片段、f(ab')2片段、scfv、scab、dab、单一结构域重链抗体和单一结构域轻链抗体。

在其它实施方案中，细胞因子靶向多肽结合细胞因子受体，并防止细胞因子与受体结合。在其它实施方案中，细胞因子靶向多肽是抗体或抗体片段，例如抗细胞因子受体抗体或抗细胞因子受体抗体片段。

在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向多肽融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽至少包括aat蛋白的反应部位环部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，aat蛋白的反应部位环部分至少包括seqidno:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽至少包括aat蛋白的反应部位环部分的变体的氨基酸序列。在一些实施方案中，aat蛋白的反应部位环部分的变体至少包括seqidno:32或seqidno:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽至少包括或来源于具有seqidno:2的氨基酸序列的全长人aat多肽序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽包括与seqidno:2或32或33的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人aat多肽序列。

在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽包括aat多肽序列或来源于aat多肽的氨基酸序列，其是或来源于以下genbank登录号所示的人aat多肽序列中的一个或多个：aab59495.1、caj15161.1、p01009.3、aab59375.1、aaa51546.1、caa25838.1、np_001002235.1、caa34982.1、np_001002236.1、np_000286.3、np_001121179.1、np_001121178.1、np_001121177.1、np_001121176.16、np_001121175.1、np_001121174.1、np_001121172.1和/或aaa51547.1。

丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向多肽融合蛋白可以掺入丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc融合蛋白的一部分。例如，抗体含有fc多肽。因此，在细胞因子靶向多肽是细胞因子-靶向抗体的一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向多肽融合蛋白将掺入丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc融合蛋白的一部分。此外，具有治疗效用的大多数受体融合蛋白是fc融合蛋白。因此，在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向多肽融合蛋白是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子受体融合蛋白的一些实施方案中，除了丝氨酸蛋白酶抑制蛋白部分和细胞因子受体部分以外，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向多肽融合蛋白可掺入fc多肽。

在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向多肽融合蛋白包括fc多肽序列的一些实施方案中，fc多肽序列包括或来源于seqidno:3、4、5、6或7中任一个的氨基酸序列。在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向融合蛋白包括fc多肽序列的一些实施方案中，fc多肽序列与seqidno:3、4、5、6或7的氨基酸序列中任一个具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽和细胞因子靶向多肽通过接头区有效地连接，接头区例如甘氨酸-丝氨酸接头或基于甘氨酸-丝氨酸的接头。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽和细胞因子靶向多肽通过铰链区有效地连接。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽和细胞因子靶向多肽通过接头区和铰链区有效连接。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽和细胞因子靶向多肽直接连接。

在本文提供的融合蛋白的一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合蛋白的第二多肽(多肽2)是含有乳清酸性蛋白(wap)结构域的多肽或来源于含有wap结构域的多肽的氨基酸序列。这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域融合蛋白”。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域融合蛋白包括至少丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或至少来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的氨基酸序列、含有wap结构域的多肽或来源于含有wap结构域的多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域融合蛋白包括单个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap靶向多肽融合蛋白包括多于一个的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽。这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(a’)-wap结构域融合蛋白”，其中(a’)为至少2的整数。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(a’)-wap结构域融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽包括相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(a’)-细胞因子靶向多肽融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽包括具有不同氨基酸序列的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽。

这些丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域融合蛋白包括含有wap结构域的多肽或其是或来源于含有wap结构域的多肽的多肽序列。wap结构域是一种50个氨基酸的进化上保守的序列基序，含有在特有的4-二硫化物核心排列(亦称四-二硫化物核心基序)中存在的8个半胱氨酸。wap结构域序列基序是一种功能性基序，其特征在于在多种蛋白质中的丝氨酸蛋白酶抑制活性。

以非限制性实例的方式，适用于本文提供的融合蛋白的含有wap结构域的多肽包括分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(slpi)、抑弹性蛋白酶蛋白和eppin。

在一些实施方案中，融合蛋白的含有wap结构域的多肽序列包括分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(slpi)多肽序列或来源于slpi的氨基酸序列。这些实施方案在本文称为“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-slpi来源的融合蛋白”。在一些实施方案中，slpi多肽序列包含slpi蛋白的一部分，例如wap2结构域或其亚部分。在一个优选的实施方案中，slpi多肽序列或来源于slpi的氨基酸序列是或来源于人slpi多肽序列。

在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-slpi融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白的slpi序列或slpi来源的序列包括具有下列氨基酸序列的全长人slpi多肽序列：

在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-slpi融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白的slpi序列或slpi来源的序列包括与seqidno:8的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人slpi多肽序列。

在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-slpi融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白的slpi序列或slpi来源的序列包括全长人slpi多肽序列的一部分，其中该部分具有下列氨基酸序列：

在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-slpi融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白的slpi序列或slpi来源的序列包括与seqidno:9的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人slpi多肽序列。

在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-slpi融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白的slpi序列或slpi来源的序列包括全长人slpi多肽序列的wap2结构域，其中wap2结构域具有下列氨基酸序列：

在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-slpi融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白的slpi序列或slpi来源的序列包括与seqidno:10的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人slpi多肽序列。

在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-slpi融合蛋白的一些实施方案中，slpi多肽序列或来源于slpi多肽的氨基酸序列是或来源于以下genbank登录号中所显示的人slpi多肽序列中的一个或多个：caa28187.1、np_003055.1、eaw75869.1、p03973.2、aah20708.1、cab64235.1、caa28188.1、aad19661.1和/或bag35125.1。

在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-slpi融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白的slpi多肽序列或slpi来源的序列包括在甲硫氨酸(met)残基处被修饰的人slpi多肽序列。在这些met突变中，met残基可被任何氨基酸取代。例如，met残基可被具有疏水侧链的氨基酸取代，例如亮氨酸(leu，l)或缬氨酸(val，v)。不希望受理论束缚，met突变防止氧化和随后本发明融合蛋白抑制活性的失活。在一些实施方案中，met突变在slpi多肽的98位处。例如，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-slpi的修饰的slpi多肽序列包括seqidno:8中的突变m98l或m98v。

在其它实施方案中，融合蛋白的含有wap结构域的多肽序列包括抑弹性蛋白酶蛋白多肽序列或来源于抑弹性蛋白酶蛋白的氨基酸序列。这些实施方案在本文称为“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-抑弹性蛋白酶蛋白融合蛋白”。在一些实施方案中，抑弹性蛋白酶蛋白多肽序列包括抑弹性蛋白酶蛋白蛋白质的一部分，例如wap结构域或其亚部分。在一个优选的实施方案中，抑弹性蛋白酶蛋白多肽序列或来源于抑弹性蛋白酶蛋白的氨基酸序列是或来源于人抑弹性蛋白酶蛋白多肽序列。

在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-抑弹性蛋白酶蛋白融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包括具有下列氨基酸序列的全长人抑弹性蛋白酶蛋白多肽序列：

在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-抑弹性蛋白酶蛋白融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包括与seqidno:11的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人抑弹性蛋白酶蛋白多肽序列。

在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-抑弹性蛋白酶蛋白融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包括全长人抑弹性蛋白酶蛋白多肽序列的一部分，其中该部分具有下列氨基酸序列：

在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-抑弹性蛋白酶蛋白融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包括与seqidno:12的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人抑弹性蛋白酶蛋白多肽序列。

在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-抑弹性蛋白酶蛋白融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包括全长人抑弹性蛋白酶蛋白多肽序列的wap结构域，其中wap结构域具有下列氨基酸序列：

在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-抑弹性蛋白酶蛋白融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包括与seqidno:13的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人抑弹性蛋白酶蛋白多肽序列。

在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-抑弹性蛋白酶蛋白融合蛋白的一些实施方案中，抑弹性蛋白酶蛋白多肽序列或来源于抑弹性蛋白酶蛋白多肽的氨基酸序列来源于以下genbank登录号所显示的人抑弹性蛋白酶蛋白多肽序列中的一个或多个：p19957.3、np_002629.1、baa02441.1、eaw75814.1、eaw75813.1、q8iub2.1和/或np_542181.1。

在其它实施方案中，融合蛋白的含有wap结构域的多肽序列包括eppin多肽序列或来源于eppin的氨基酸序列。这些实施方案在本文称为“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(a’)–eppin融合蛋白。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-eppin融合蛋白的eppin多肽序列包括eppin蛋白的一部分，例如wap结构域或其亚部分。在一个优选的实施方案中，eppin多肽序列或来源于eppin的氨基酸序列是或来源于人eppin多肽序列。

在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-eppin融合蛋白的一些实施方案中，eppin多肽序列或来源于eppin多肽的氨基酸序列是或来源于以下genbank登录号显示的人eppin多肽序列中的一个或多个：o95925.1、np_065131.1、aah44829.2、aah53369.1、aag00548.1、aag00547.1和/或aag00546.1。

在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽至少包括aat蛋白的反应部位环部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，aat蛋白的反应部位环部分至少包括seqidno:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽至少包括aat蛋白的反应部位环部分的变体的氨基酸序列。在一些实施方案中，aat蛋白的反应部位环部分的变体至少包括seqidno:32或seqidno:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽至少包括具有seqidno:2的氨基酸序列的全长人aat多肽序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽包括与seqidno:2或32或33的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人aat多肽序列。

在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽包括其为以下genbank登录号所示的人aat多肽序列中的一个或多个的aat多肽序列，或包括其来源于以下genbank登录号所示的人aat多肽序列中的一个或多个的源自aat多肽的氨基酸序列：aab59495.1、caj15161.1、p01009.3、aab59375.1、aaa51546.1、caa25838.1、np_001002235.1、caa34982.1、np_001002236.1、np_000286.3、np_001121179.1、np_001121178.1、np_001121177.1、np_001121176.16、np_001121175.1、np_001121174.1、np_001121172.1和/或aaa51547.1。

在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域融合蛋白还可包括fc多肽或来源于fc多肽的氨基酸序列。这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc-wap结构域融合蛋白”。在这些实施方案中，该术语并不解释具体的顺序。例如，融合蛋白的顺序可以是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc-wap结构域、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域-fc或其任何变化组合。本文所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc-wap结构域融合蛋白至少包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的氨基酸序列、含有wap结构域的多肽或来源于含有wap结构域的多肽的氨基酸序列和fc多肽或来源于fc多肽的氨基酸序列。

在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域融合蛋白包括fc多肽序列的一些实施方案中，fc多肽序列可具有seqidno:3-7的氨基酸序列。在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域融合蛋白包括fc多肽序列的其它实施方案中，fc多肽序列可与seqidno:3-7的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域融合蛋白还可包括白蛋白多肽或来源于白蛋白多肽的氨基酸序列。这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-白蛋白-wap结构域融合蛋白”。在这些实施方案中，该术语并不解释具体的顺序。例如，融合蛋白的顺序可以是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-白蛋白-wap结构域、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域-白蛋白或其任何变化组合。本文所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-白蛋白-wap结构域融合蛋白至少包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的氨基酸序列、含有wap结构域的多肽或来源于含有wap结构域的多肽的氨基酸序列和白蛋白多肽或来源于白蛋白多肽的氨基酸序列。

在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域融合蛋白包括白蛋白多肽序列的一些实施方案中，白蛋白多肽序列包括本文所述seqidno:14-15的氨基酸序列。在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-wap结构域融合蛋白包括白蛋白多肽序列的其它实施方案中，白蛋白多肽序列与seqidno:14或15的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合蛋白的第二多肽(多肽2)是白蛋白多肽或来源于白蛋白多肽。这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(a’)-白蛋白融合蛋白”。本文所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-白蛋白融合蛋白至少包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的氨基酸序列和白蛋白多肽或来源于白蛋白多肽的氨基酸序列。此外，本发明涉及丝氨酸蛋白酶抑制蛋白白蛋白结合多肽融合蛋白，其中白蛋白通过中间体结合分子与丝氨酸蛋白酶抑制蛋白有效连接。在此，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与人血清白蛋白非共价或共价结合。

在本发明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的实施方案中，融合蛋白的白蛋白多肽序列是人血清白蛋白(hsa)多肽或来源于hsa的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包括具有下列氨基酸序列的hsa多肽序列：

在本发明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的实施方案中，融合蛋白的白蛋白多肽序列包括与seqidno:14的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人血清白蛋白多肽序列。

在本发明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的实施方案中，融合蛋白的白蛋白多肽序列包括具有下列氨基酸序列的人血清白蛋白多肽序列的结构域3：

在本发明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的实施方案中，融合蛋白的白蛋白多肽序列包括与seqidno:15的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人血清白蛋白多肽序列。

在本发明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的一些实施方案中，融合蛋白通过中间体白蛋白结合多肽与人血清白蛋白连接。白蛋白结合多肽可以是抗体或抗体片段或来源于抗体或抗体片段。在一个优选的实施方案中，白蛋白结合多肽或来源于抗体或抗体片段的氨基酸序列来源于嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体序列。术语抗体片段包括单链、fab片段、f(ab')2片段、scfv、scab、dab、单一结构域重链抗体和单一结构域轻链抗体。另外，白蛋白结合多肽可以是白蛋白结合肽。本发明的另一个实施方案是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白白蛋白结合多肽融合物，其中白蛋白结合多肽是链球菌蛋白g的结构域3或来源于链球菌蛋白g的结构域3的序列。

在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(a’)-白蛋白融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽至少包括aat蛋白的反应部位环部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，aat蛋白的反应部位环部分至少包括seqidno:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-白蛋白融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽至少包括aat蛋白的反应部位环部分的变体的氨基酸序列。在一些实施方案中，aat蛋白的反应部位环部分的变体至少包括seqidno:32或seqidno:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-白蛋白融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽至少包括具有seqidno:2的氨基酸序列的全长人aat多肽序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-白蛋白融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽包括与seqidno:2或32或33的氨基酸序列有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的人aat多肽序列。

在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-白蛋白融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽包括aat多肽序列或来源于aat多肽的氨基酸序列，其是或来源于以下genbank登录号所示的人aat多肽序列中的一个或多个：aab59495.1、caj15161.1、p01009.3、aab59375.1、aaa51546.1、caa25838.1、np_001002235.1、caa34982.1、np_001002236.1、np_000286.3、np_001121179.1、np_001121178.1、np_001121177.1、np_001121176.16、np_001121175.1、np_001121174.1、np_001121172.1和/或aaa51547.1。

在一些实施方案中，融合蛋白经修饰(例如通过使一个或多个蛋白水解性切割位点突变)以提高或以其它方式抑制蛋白水解性切割。在一些实施方案中，与未改变的融合蛋白相比，融合蛋白经修饰以改变或以其它方式调节融合蛋白的fc效应子功能，同时保留结合和抑制功能。以非限制性实例的方式，fc效应子功能包括fc受体结合、防止在与fc受体结合时促炎介质释放、吞噬作用、改进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、改进补体依赖性的细胞毒性(cdc)、改进fc多肽的asn297残基(kabat编号的eu指数，kabat等,1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)处的糖基化。在一些实施方案中，融合蛋白经突变或以其它方式修饰以影响fc受体结合。在一些实施方案中，fc多肽经修饰以提高fcrn结合。提高与fcrn结合的fc多肽突变的实例为met252tyr、ser254thr、thr256glu(m252y、s256t、t256e)(kabat编号，dall’acqua等,2006，j.biolchem第281卷(33)23514–23524)，或met428leu和asn434ser(m428l，n434s)(zalevsky等,2010naturebiotech，第28卷(2)157-159)。(kabat等1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest的eu指数)。在一些实施方案中，fc多肽部分经突变或以其它方式修饰，使得破坏fc介导的二聚化(ying等,2012j.biolchem287(23)：19399–19408)。在这些实施方案中，融合蛋白在性质上是单体。

本文提供的融合蛋白及其变体，例如通过抑制丝氨酸蛋白酶(例如人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(ne)，其为在炎性反应期间由嗜中性粒细胞分泌的胰凝乳蛋白酶-折叠(fold)丝氨酸蛋白酶)而显示出抑制活性。本文提供的融合蛋白在与丝氨酸蛋白酶(例如人丝氨酸蛋白酶)结合或以其它方式相互作用时，完全或部分降低或以其它方式调节丝氨酸蛋白酶表达或活性。在融合蛋白与人丝氨酸蛋白酶蛋白质、多肽和/或肽相互作用时，丝氨酸蛋白酶的生物功能的降低或调节是完全或部分的。当与不存在相互作用(例如与本文所述融合蛋白结合)的丝氨酸蛋白酶表达或活性的水平相比，在融合蛋白存在下丝氨酸蛋白酶表达或活性的水平降低至少95%，例如96%、97%、98%、99%或100%时，融合蛋白被视为完全抑制丝氨酸蛋白酶表达或活性。当与不存在相互作用(例如与本文所述融合蛋白结合)的丝氨酸蛋白酶表达或活性的水平相比，在融合蛋白存在下丝氨酸蛋白酶表达或活性的水平降低小于95%，例如10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%或90%时，融合蛋白被视为部分抑制丝氨酸蛋白酶表达或活性。

本文所述融合蛋白可用于各种治疗、诊断和预防适应症。例如，融合蛋白可用于治疗受试者的各种疾病和病症。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合蛋白，包括本文所述融合蛋白，可用于在受试者中治疗疾病或病症，减轻疾病或病症的症状，改善疾病或病症和/或延迟疾病或病症的进展，所述受试者罹患选自以下的疾病或病症，或者经鉴定处于选自以下疾病或病症的风险中：α-1-抗胰蛋白酶(aat)缺乏、气肿、慢性阻塞性肺病(copd)、急性呼吸窘迫综合征(ards)、变应性哮喘、囊性纤维化、肺癌、缺血再灌注损伤包括例如心脏移植术后缺血/再灌注损伤、心肌梗死、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病(crohn'sdisease)、银屑病、i型和/或ii型糖尿病、细菌感染、真菌感染、病毒感染、肺炎、脓毒症、移植物抗宿主病(gvhd)、伤口愈合、系统性红斑狼疮和多发性硬化。

本发明的药物组合物包含本发明的融合蛋白(包括修饰的融合蛋白和其它变体)以及合适的载体。这些药物组合物可包括在药盒(例如诊断药盒)中。

附图简述

图1a是本发明的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc融合蛋白的一些实施方案的图示。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白可位于融合蛋白内的任何位置。还显示了掺入多于一个的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc融合蛋白。图1b是显示血清来源的aat(泳道1)、aat-fc1(泳道2，人igg1fc)和aat-el-fc1(泳道3，aat内的met351glu、met358leu突变，人igg1fc)的sds-page凝胶的照片。图1c是显示通过aat-fc融合蛋白抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的曲线图。图1d是显示每个fc多肽具有2个aat多肽的四价aat-fc-aat的sds-page凝胶的照片。图1e是显示通过四价aat-fc-aat融合蛋白抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的曲线图。图1f是显示自a蛋白树脂的低ph洗脱作用的绘制图，其中以低ph洗脱的aat-fc融合蛋白的ne抑制能力大大降低。图1g是显示与野生型aat和单一突变体aat-em-fc(met351glu)相比，双重突变体aat-el-fc(met351glu、met358leu突变)抵抗h2o2灭活(浓度)的曲线图。图1h是描绘在给予10mg/kg蛋白质(3只大鼠/试验蛋白质)的大鼠中，与aat-fc相比，血清来源的aat(sdaat)的血清清除率的曲线图。aat-fc的半寿期比sdaat的明显更长。

图2a是本发明的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向融合蛋白的一些实施方案的图示。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白可与抗体的重链、轻链或两者融合。还描绘了丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子受体融合蛋白。图2b是显示d2e7抗体(泳道1)和具有与重链融合的aat的d2e7抗体(泳道2)的sds-page凝胶的照片。图2c是显示通过与aat融合的d2e7抗体抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的曲线图。显示血清来源的aat作为阳性对照，而显示仅d2e7抗体作为ne抑制的阴性对照。

图3a是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-fc-wap融合蛋白的一些实施方案的图示。图3b是显示aat-fc-抑弹性蛋白酶蛋白(泳道1)和aat-fc-slpi(泳道2)的sds-page凝胶的照片。图3c是显示通过aat-fc-抑弹性蛋白酶蛋白融合蛋白和aat-fc-slpi融合蛋白抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的曲线图。包括了aat-fc融合蛋白和血清来源的aat用作比较。

图4a是aat-hsa融合蛋白的一些实施方案的图示。图4b是显示aat-hsa融合物的sds-page凝胶的照片。图4c是显示与血清来源的aat相比，通过aat-hsa抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的曲线图。

发明详述

人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(ne)是胰凝乳蛋白酶-折叠丝氨酸蛋白酶，在炎症期间由嗜中性粒细胞分泌。ne的异常活性导致弹性蛋白组织逐步降解和肺小泡结构被慢慢破坏，这导致气肿和肺纤维化(lungarella等,2008int.j.biochemcellbiol40:1287)。通常，被误导的ne活性是由蛋白酶与其天然抑制剂α1-抗胰蛋白酶(aat)失衡所致。这种失衡可产生于嗜中性粒细胞的肺浸润升高，正如在吸烟者和囊性纤维化(cf)或急性呼吸窘迫综合征(ards)患者的肺中所观察到的一样。相反地，aat的缺乏，通常是引起att在肝中聚集和蓄积的点突变的结果，其使肺暴露于不受遏制的ne活性中。患有aat缺乏的个体存在气肿、copd、肝病和多种其它病况的风险增加。

aat缺乏影响大约100,000个美国人(按照alpha-1基金会的估计)，并且许多受害人在其30多岁和40多岁时死亡。目前仅有少量fda批准的药物用于治疗att缺乏(prolastin®、aralast™、zemaira®、glassia™)。每种药物是来源于合并人血浆的天然aat，这显得不足以满足预期的临床需要。此外，这些产品具有短的血清半寿期(t1/2约5天)，并需要高剂量(60mg/kg体重)一周一次输注。这些药物的现有市场估计约$4亿。根据多达95%的aat缺乏症患者未进行确诊的估计，以及这些药物对于在非aat缺乏(例如囊性纤维化(cf)、急性呼吸窘迫综合征(ards)、吸烟引起的气肿和/或copd)的个体中以ne活性升高为特征的病理的有效疗法具有潜力的事实，aat样药物的市场实际上可能更大。

已提出aat具有广谱抗炎活性(tilg等,1993jexpmed178:1629–1636；libert等,1996immunol157:5126–5129；pott等,journalofleukocytebiology852009；janciauskiene等,2007j.biolchem282(12):8573–8582；nita等,2007intjbiochemcellbiol39:1165–1176)。最近，除通常提出的炎性肺部病况以外，还提出了aat可用于治疗许多人类病理的证据。已显示人aat保护小鼠免于实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)的临床和组织病理学病征，这就表明它可能是例如多发性硬化或系统性红斑狼疮(sle)等自身免疫病的潜在疗法(subramanian等,2011metabbraindis26:107–113)。血清aat在移植物抗宿主病(gvhd)啮齿动物模型中显示出活性(tawara等,2011proc.natl.acad.sci.usa109：564–569；marcondes等,2011bloodnov3;118(18):5031-9)，这导致了使用aat治疗患有类固醇无反应性急性gvhd的个体的人临床试验(nct01523821)。另外，aat在i型和ii型糖尿病动物模型中是有效的，其遏制炎症，保护胰岛细胞免于细胞凋亡，并且使持久的胰岛细胞同种异体移植物成为可能(zhang等,2007diabetes56:1316–1323；lewis等,2005procnatlacadsciusa102:12153–12158；lewis等,2008procnatlacadsciusa105:16236–16241；kalis等,2010islets2:185–189)。最近，存在许多使用血清来源的aat产品的i型糖尿病的早期人临床试验(nct01183468、nct01319331、nct01304537)。

对最新的血清来源的aat产品进行了广泛纯化和测试以确保除去致病性病毒，然而，感染因子传播的风险无法完全排除。而且，血清是有限的，这就限制了血清来源的aat的生产能力。试图解决血清来源的产品和产量问题的顾虑的目标在于重组aat的表达。然而，在20年的研究后，治疗上切实可行的重组aat的生产已进入市场(karnaukhova等,2006aminoacids30：317)。像血浆来源的产品一样，aat的重组形式受血清半寿期短、产量低和肺分布差所困。

与未修饰的aat分子相比，本发明的融合蛋白的功能性提高。aat多肽与跟新生儿fc受体(fcrn)相互作用的第二多肽的融合物，用来延长血清半寿期，为患者提供了大量所需的给药益处。融合蛋白的这些fcrn相互作用多肽包括来源于人igg1、igg2、igg3、igg4或igm的免疫球蛋白(ig)fc多肽和人白蛋白的衍生物。在一些实施方案中，融合蛋白将突变掺入aat部分，这赋予分子对因氧化失活的更多抗性。例如met351glu、met358leu(aat-el-fc)，显示对因h2o2氧化而失活的抗性(图1g)。虽然aat是天然抗炎蛋白，但本发明的一些实施方案通过aat多肽和细胞因子靶向多肽的融合提供高的炎症遏制能力。来自aat和第二多肽的双重抗炎功能性的偶联，将提供比任一种多肽自身更有效的治疗性蛋白质。另外，aat的抗感染活性的偶联将减少大多数细胞因子靶向生物制剂的感染风险。一些实施方案通过aat-多肽和含wap结构域的多肽的融合，提供更有效的抗炎和抗感染蛋白质。预期本发明的融合蛋白有巨大的治疗效用，并且优于现有的血清来源的aat产品。

为了延长重组aat的半寿期，采用重组dna技术以生产与人igg1、igg2、igg3、igg4、igm的fc结构域或has的aat基因融合物，使得预期的蛋白质产物将是aat之后为fc结构域((aat-fc(igg1)、aat-fc(igg2)、aat-fc(igg3)、aat-fc(igg4)、aat-fc(igm))或aat之后为hsa。虽然已知hsa的fc结构域与一些蛋白质、蛋白质结构域或肽的融合物可延长其半寿期(参见例如jazayeri等,biodrugs22，11-26；huang等(2009)curropinbiotechnol20，692-699；kontermann等(2009)biodrugs23，93-109；schmidt等(2009)curropindrugdiscovdevel12，284-295)，但是不清楚与aat融合的fc结构域或has是否允许正确折叠并保持ne抑制活性，或是否可延长重组aat的半寿期。已表明本发明的融合蛋白是ne的有效抑制剂，具有延长的血清半寿期，并且在一些实施方案中抗氧化。在其它实施方案中，本文所述融合蛋白通过掺入其它功能性多肽(包括细胞因子靶向多肽和含有wap结构域的多肽)而具有不同的性质。

本文所述融合蛋白至少包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的氨基酸序列和第二多肽。在一些实施方案中，例如，本发明提供与人igg1-fc、igg2-fc、igg3-fc、igg4-fc、igm-fc或hsa衍生物融合的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽。预期本文所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合物可用于治疗各种适应症，以非限制性实例的方式包括α-1-抗胰蛋白酶(aat)缺乏、气肿、慢性阻塞性肺病(copd)、急性呼吸窘迫综合征(ards)、变应性哮喘、囊性纤维化、肺癌、缺血再灌注损伤包括例如心脏移植术后缺血/再灌注损伤、心肌梗死、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、银屑病、i型和/或ii型糖尿病、细菌感染、真菌感染、病毒感染、肺炎、脓毒症、移植物抗宿主病(gvhd)、伤口愈合、系统性红斑狼疮和多发性硬化。

在一些实施方案中，本文所述融合蛋白至少包括α-1-抗胰蛋白酶(aat)多肽或来源于aat的氨基酸序列和第二多肽。例如，本发明提供与人igg1-fc、igg2-fc、igg3-fc、igg4-fc、igm-fc或hsa衍生物融合的α-1-抗胰蛋白酶(aat)。

在一些实施方案中，本文所述融合蛋白至少包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列和细胞因子靶向多肽或来源于细胞因子靶向多肽的氨基酸序列。例如，本发明提供与人细胞因子受体或其衍生物融合的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的序列。本发明的另一个实施方案提供与细胞因子靶向抗体(例如抗细胞因子抗体)或来源于细胞因子靶向抗体(例如抗细胞因子抗体)的序列或来源于细胞因子靶向抗体的片段(例如抗细胞因子抗体的片段)的序列融合的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的序列。例如，本发明提供与细胞因子靶向多肽融合的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的序列，其中细胞因子靶向多肽结合下列人细胞因子的任一种：tnfα、ige、il-12、il-23、il-6、il-1α、il-1β、il-17、il-13、il-4、il-10、il-2、il-18、il-27或il-32。

例如，在一些实施方案中，细胞因子靶向多肽靶向tnfα，并包括下列tnfα-靶向多肽的任一种或来源于下列tnfα-靶向多肽的序列：remicade®、humira®、simponi®、cimiza®、enbrel®或atn-103和atn-192。

例如，在一些实施方案中，细胞因子靶向多肽靶向ige，并包括下列ige-靶向多肽的任一种或来源于下列ige-靶向多肽的序列：xolair或fcεri。

例如，在一些实施方案中，细胞因子靶向多肽靶向il-12和il-23的共有p40亚基，并包括stelara®多肽或来源于stelara®多肽的序列。

例如stelara®细胞因子靶向多肽靶向il-13，并包括cdp7766多肽或来源于cdp7766多肽的序列。

在一些实施方案中，本文所述融合蛋白至少包括α-1-抗胰蛋白酶(aat)多肽或来源于aat的氨基酸序列和细胞因子靶向多肽或来源于细胞因子靶向多肽的氨基酸序列。例如，本发明提供α-1-抗胰蛋白酶抑制剂(aat)融合的细胞因子靶向多肽，其中细胞因子靶向多肽结合下列人细胞因子的任一种：tnfα、ige、il-6、il-1α、il-1β、il-12、il-17、il-13、il-23、il-4、il-10、il-2、il-18、il-27或il-32。

在一些实施方案中，细胞因子靶向多肽结合细胞因子受体，并防止细胞因子的结合。例如，本发明包括与细胞因子受体靶向抗体融合的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白。例如，本发明提供α-1-抗胰蛋白酶抑制剂(aat)融合的细胞因子靶向多肽，其中细胞因子靶向多肽结合下列人细胞因子的任一种的受体：tnfα、ige、il-6、il-1α、il-1β、il-12、il-17、il-13、il-23、il-12和il-23的p40亚基、il-4、il-10、il-2、il-18、il-27或il-32。

例如，在一些实施方案中，细胞因子靶向多肽靶向il-6受体，并包括actemra®多肽(如专利公布ep0628639中所述)、或alx-0061多肽(如wo2010/115998所述)、或来源于actemra®多肽或alx-0061多肽的序列。

例如，actemra®细胞因子靶向多肽靶向il-6受体，并包括托珠单抗(tocilizumab)多肽或来源于托珠单抗多肽的序列。

通过蛋白质治疗剂靶向炎性细胞因子和免疫刺激剂在许多炎性病况中显示出临床上的成功。用作细胞因子靶向剂的最常见的蛋白质是可溶性细胞因子受体和单克隆抗体及其片段。靶向细胞因子的一个重大缺点是这些患者的感染风险增加，如通过tnfα靶向生物制剂remicade®、humira®、simponi®、cimiza®和enbrel®以及il-12/23p40靶向抗体stelara®所证实的一样。这可能是靶向炎性细胞因子导致患者免疫抑制的普遍问题。aat和其它丝氨酸蛋白酶抑制蛋白蛋白质是引人关注的，因为它们显示抗感染活性和抗炎活性两者。因此，本发明的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-细胞因子靶向多肽融合蛋白可减弱异常的细胞因子活性，同时降低感染风险。

在一些实施方案中，本文所述融合蛋白包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的氨基酸序列、含有wap结构域的多肽或来源于含有wap结构域的多肽的氨基酸序列和fc多肽或来源于fc多肽的氨基酸序列。例如，本发明提供以任何功能组合有效连接在一起的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽、含有wap结构域的多肽和人igg1-fc、igg2-fc、igg3-fc、igg4-fc或igm-fc衍生物。在一些实施方案中，含有wap结构域的蛋白质是人slpi或来源于人slpi。在其它实施方案中，含有wap结构域的蛋白质是人抑弹性蛋白酶蛋白或来源于人抑弹性蛋白酶蛋白。在一些实施方案中，本文所述融合蛋白至少包括α-1-抗胰蛋白酶(aat)多肽或来源于aat的氨基酸序列和slpi多肽或来源于slpi的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述融合蛋白至少包括aat多肽或来源于aat的氨基酸序列和抑弹性蛋白酶蛋白多肽或来源于抑弹性蛋白酶蛋白的氨基酸序列。

spli和抑弹性蛋白酶蛋白是显示丝氨酸蛋白酶抑制活性的含有wap结构域的蛋白质。这两种蛋白质具有抗炎功能。此外，这些蛋白质具有针对许多细菌、病毒和真菌毒株的广泛抗感染能力。

在一些实施方案中，本文所述融合蛋白至少包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的氨基酸序列和人血清白蛋白(hsa)多肽或来源于hsa多肽的氨基酸序列。本发明的其它实施方案包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-白蛋白结合多肽融合蛋白，其中白蛋白结合多肽负责丝氨酸蛋白酶抑制蛋白和has的缔合。因此本发明包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽与hsa多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或has多肽的序列的共价和非共价连接连接两者。例如，本发明提供与人hsa或hsa衍生物或hsa结合肽或多肽融合的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽。

在一些实施方案中，本文所述融合蛋白至少包括α-1-抗胰蛋白酶(aat)多肽或来源于aat的氨基酸序列和hsa多肽或来源于hsa多肽的氨基酸序列。例如，本发明提供与hsa或来源于hsa的片段或白蛋白结合多肽融合的α-1-抗胰蛋白酶(aat)。

在一些实施方案中，本文所述融合蛋白包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的氨基酸序列、hsa多肽或来源于hsa多肽的氨基酸序列和含有wap结构域的多肽或来源于含有wap结构域的多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述融合蛋白至少包括α-1-抗胰蛋白酶(aat)多肽或来源于aat的氨基酸序列和hsa多肽或来源于hsa多肽的氨基酸序列和slpi多肽或来源于slpi的氨基酸序列。在其它实施方案中，本文所述融合蛋白至少包括α-1-抗胰蛋白酶(aat)多肽或来源于aat的氨基酸序列和hsa多肽或来源于hsa多肽的氨基酸序列和抑弹性蛋白酶蛋白多肽或来源于抑弹性蛋白酶蛋白的氨基酸序列。

本发明的融合蛋白可容易地在哺乳动物细胞表达系统中生产。例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞、人胚肾(hek)293细胞、cos细胞、per.c6、ns0细胞、sp2/0、yb2/0可容易地用来表达本文所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合蛋白。重要的是，哺乳动物细胞表达系统产生通常更最适宜治疗应用的蛋白质。与基于细菌、昆虫或酵母的表达系统不同，哺乳动物细胞表达系统产生具有糖基化模式的蛋白质，其与天然人蛋白质中存在的那些类似或相同。蛋白质的适当糖基化可极大地影响血清稳定性、药代动力学、生物分布、蛋白质折叠和功能性。因此，在哺乳动物表达系统产生治疗性蛋白质的能力具有超过其它系统的截然不同的优势。此外，大部分哺乳动物细胞表达系统(例如cho、ns0、per.c6细胞)可容易地在工业制造设备中放大生产治疗性蛋白质以满足临床的需要。相对于aat的天然形式，本文所述融合蛋白的功能性提高，并且可在哺乳动物表达系统中生产以用于临床和商业供应。本发明的一些实施方案包括能够分离保持其抑制ne的能力的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合蛋白的纯化系统。重要的是，本发明的纯化方法可容易地并入现今基于哺乳动物细胞的工业制造方法中。

除非另有定义，否则与本发明有关的科学技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语将包括复数，并且复数术语将包括单数。一般而论，与本文所述细胞和组织培养、分子生物学和蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交有关的命名和它们的技术是本领域熟知并常用的那些。标准技术用于重组dna、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如电穿孔、脂转染)。酶促反应和纯化技术按照生产商说明书或按本领域通常实现的或本文描述的进行。一般按照本领域众所周知的和在整个本说明书中引用和论述的各种通用和更特定的参考文献中描述的常规方法进行在先技术和程序。参见例如sambrook等,molecularcloning：alaboratorymanual(第2版，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(1989))。与本文所述分析化学、合成有机化学及医学和药物化学有关的术语和它们的实验室程序和技术是本领域众所周知和常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者治疗。术语患者包括人和兽医受试者。

应理解，本发明治疗实体的给予将与合适的载体、缓冲剂、赋形剂和掺入制剂以提供改进的传送、递送、耐受性等的其它作用剂一起给予。大量的合适制剂可见于所有药剂师已知的处方集：remington'spharmaceuticalsciences(第15版，mackpublishingcompany，easton，pa(1975))，特别是其中blaug，seymour的第87章。这些制剂包括例如散剂、糊剂、软膏剂、胶冻剂、蜡制剂、油剂、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)囊泡(例如lipofectin™)、dna缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶剂和含有碳蜡的半固体混合物。前述混合物的任一种可适于本发明的治疗和疗法，条件是制剂中的活性成分不被制剂灭活，并且制剂与给药途径是生理上相容和耐受的。另参见baldrickp.“pharmaceuticalexcipientdevelopment:theneedforpreclinicalguidance(药用赋形剂的发展：临床前指导的需要)”.regul.toxicolpharmacol.32(2):210-8(2000)；wangw.“lyophilizationanddevelopmentofsolidproteinpharmaceuticals(固体蛋白质药物的冻干和发展)”.int.j.pharm.203(1-2):1-60(2000)；charmanwn“lipids,lipophilicdrugs,andoraldrugdelivery-someemergingconcepts(脂质、亲脂性药物和口服药物递送—一些新兴的概念)”.jpharmsci.89(8):967-78(2000)；powell等,“compendiumofexcipientsforparenteralformulations(胃肠外制剂用赋形剂概论)”pdajpharmscitechnol.52:238-311(1998)和其中与药剂师熟知的制剂、赋形剂和载体有关的其它信息的引用。

使用包括本发明融合蛋白的本发明的治疗制剂以治疗或减轻受试者中与丝氨酸蛋白酶活性异常相关疾病或病症相关的症状。本发明还提供治疗或减轻受试者中与丝氨酸蛋白酶活性异常相关疾病或病症相关的症状的方法。通过采用标准方法，包括各种临床和/或实验室程序的任一种，鉴定患有与丝氨酸蛋白酶活性异常有关的疾病或病症(或具有发生所述疾病或病症的风险)的受试者(例如人患者)，来进行治疗方案。术语患者包括人和兽医受试者。术语受试者包括人和其它哺乳动物。

与用于诊断或治疗与丝氨酸蛋白酶活性异常有关的具体疾病或病症的任何已知方法联合测定治疗的有效性。与丝氨酸蛋白酶活性异常有关的疾病或病症的一个或多个症状的缓解表明融合蛋白提供临床益处。

用于筛选具有所需特异性的融合蛋白的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定法(elisa)、酶测定法、流式细胞术和本领域内已知的其它免疫介导的技术。

本文所述融合蛋白可用于与靶(例如丝氨酸蛋白酶)的定位和/或定量相关领域内的已知方法，例如用于测量适合生理样品内这些靶的水平、用于诊断方法、用于使蛋白质成像等。术语“生理样品”和“生物样品”可互换使用，在本文意指包括分离自受试者的组织、细胞和生物流体，以及受试者内存在的组织、细胞和流体。因此，术语“生理样品”和“生物样品”的用法内包括血液和血液的级分或组分(包括血清、血浆或淋巴液)。

在给定的实施方案中，将对给定靶或其含有靶结合结构域的衍生物、片段、类似物或同源物有特异性的融合蛋白用作药理活性化合物(下文称“治疗剂”)。

可采用标准技术，例如免疫亲和、色谱法或免疫沉淀，使用本发明的融合蛋白来分离特定的靶。可通过使融合蛋白与可检测物质偶联(即物理连接)以利于检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素/生物素；合适荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白，合适放射性物质的实例包括¹²⁵i、¹³¹i、³⁵s或³h。

治疗有效量的本发明的融合蛋白一般涉及达到治疗目的所需要的量。按上文所述，这可能是融合蛋白及其靶之间的结合相互作用，在某些情况下其干扰靶的功能。此外，需要给予的量将取决于融合蛋白对其特异性靶的结合亲和力，并且还将取决于所给予的融合蛋白从其给予的自由体积其他受试者中消耗的速率。以非限制性实例的方式，本发明治疗有效剂量的融合蛋白或其片段的常见范围可为约0.1mg/kg体重-约250mg/kg体重。常见给药频率的范围可为例如每日两次至一月一次。

当使用融合蛋白片段时，优选特异性结合靶的最小抑制片段。例如，可以设计保留结合靶的能力的肽分子。可化学合成和/或通过重组dna技术产生这类肽。(参见例如marasco等，proc.natl.acad.sci.usa，90：7889-7893(1993))。制剂还可含有在治疗的具体适应症所必需的一种以上的活性化合物，优选不会不利地彼此影响的具有补充活性的活性化合物。备选地或另外地，组合物可包含提高其功能的作用剂，例如细胞毒性剂、细胞因子、化学治疗药、生长抑制剂、抗炎药或抗感染药。这类分子适宜以对预期目的是有效的量组合存在。

还可将活性成分包封在例如通过凝聚技术或界面聚合制备的微囊(例如分别为羟甲基纤维素微囊或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米粒和纳米囊)或粗乳状液中。

用于体内给予的制剂必须是无菌的。这容易通过无菌滤膜过滤实现。

可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有融合蛋白的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形制品(例如膜或微囊)的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-丙烯酸甲酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、l-谷氨酸和γ乙基-l-谷氨酸共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如luprondepot^tm(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚d-(-)-3-羟基丁酸。虽然例如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质持续较短时间。

药物组合物

本发明的融合蛋白(本文亦称为“活性化合物”)及其衍生物、片段、类似物和同源物可掺入适于给药的药物组合物中。这类组合物通常包含融合蛋白和药学上可接受的载体。本文所用术语“药学上可接受的载体”意指包括与药学上的给予相容的任何和全部的溶剂、分散介质、包衣材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体描述于remington’spharmaceuticalsciences的最新版本中，其为本领域的标准参考教科书，通过引用结合到本文中。这类载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格氏液(ringer’ssolution)、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。还可使用脂质体和非水溶媒，例如固定油。用于药学上活性物质的这类介质和作用剂的用途是本领域众所周知的。只要任何常规介质或作用剂与活性化合物相容，便考虑其用于组合物中。还可将补充性活性化合物掺入组合物中。

配制本发明的药物组合物以与其预期给药途径相容。给药途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、真皮内、皮下、口服(例如吸入)、透皮(即局部)、跨粘膜和直肠给予。用于胃肠外、真皮内或皮下施用的溶液剂或混悬剂可包括下列组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及张力调节剂，例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节ph。可将胃肠外制剂装入由玻璃或塑料制成的安瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适于注射用的药物组合物包括无菌水性溶液剂(其中是水溶性的)或分散剂和用于无菌可注射溶液剂或分散剂临时配制的无菌粉剂。对于静脉内给予，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophorel^tm(basf,parsippany,n.j.)或磷酸缓冲盐水(pbs)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应是流体至存在易于注射的程度。在生产或存储条件下必须是稳定的，必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物。可通过例如使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散剂的情况下通过保持所需要的粒度和通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)实现防止微生物的作用。在许多情况下，组合物中将优选包括等渗剂例如糖，多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇，氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的作用剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来引起可注射组合物的延迟吸收。

可通过将需要量的活性化合物与一种上文列举的成分或上文列举的成分的组合(按需要)一起掺入合适的溶剂中，接着过滤除菌，来制备无菌可注射溶液剂。一般而论，通过将活性化合物掺入含有基础分散介质和所需的来自上文列举的其它成分的无菌溶媒，来制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌散剂的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这从其之前过滤除菌的溶液中得到活性成分加任何其它所需成分的散剂。

口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可装入明胶胶囊中或压制成片剂。对于口服治疗给予的目的，活性化合物可与赋形剂一起掺入，并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物还可使用流体载体制备以用作漱口剂，其中将流体载体中的化合物口服施用和漱口并咳出或吞咽。可包括药学上相容的结合剂和/或辅料作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有下列的任一种成分或类似性质的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂例如藻酸、primogel或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或sterotes；助流剂，例如胶态二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或矫味剂，例如欧薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味料(orangeflavoring)。

对于通过吸入给予，以喷雾剂的形式，从装有合适抛射剂(例如二氧化碳等气体)的加压容器或分配器或者喷雾器中递送化合物。

全身给予也可通过跨粘膜或透皮方式。对于跨粘膜或透皮给予，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂一般是本领域已知的，并且包括例如用于跨粘膜给予的去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。跨粘膜给予可通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂实现。对于透皮给予，将活性化合物制成本领域通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。

还可以用于直肠递送的栓剂(例如与常规栓剂基质例如可可脂和其它甘油脂一起)或滞留型灌肠剂的形式制备化合物。

在一个实施方案中，活性化合物用保护化合物免于从机体快速排除的载体制备，例如控释制剂，包括植入剂和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这类制剂的方法对于本领域的技术人员将是显而易见的。所述材料还可购自alzacorporation和novapharmaceuticals,inc。脂质体混悬液也可用作药学上可接受的载体。这些可按照本领域技术人员已知方法(例如按美国专利号4,522,811所述)制备。

为了易于给予和剂量均匀性，以剂量单位形式配制口服或胃肠外组合物尤其有利。本文所用剂量单位形式是指适于作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理离散单位；各单位含有与所需药用载体联用的经计算产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本发明剂量单位形式的规格受制于并直接取决于活性化合物的特殊性质和待实现的具体治疗效果，以及在混配这类活性化合物以治疗个体的技术中的内在限制。

药物组合物可与给药说明书一起包括在容器、包装或分配器中。

下列实施例中将进一步描述本发明，所述实施例不限制随附权利要求书中描述的本发明的范围。

实施例

实施例1：aat-fc融合蛋白和变体

本发明的aat-fc融合蛋白的示例性但非限制性实施例包括下列序列。虽然这些实施例包括铰链序列和/或接头序列，但是本发明的融合蛋白可使用长度和/或柔性上合适的任何铰链序列和/或接头序列来制备。或者融合蛋白可不使用铰链和/或接头序列来制备。例如，多肽组分可以直接连接。

示例性的aat-fc融合蛋白是本文所述的aat-hfc1(人igg1fc)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:2)，铰链区用普通文本示出(seqidno:43)，融合蛋白的igg-fc多肽部分用斜体字表示(seqidno:3)。

aat-hfc1(人igg1fc)

示例性的aat-fc融合蛋白是本文所述的aat-hfc2(人igg2fc)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:2)，铰链区用普通文本示出(seqidno:44)，融合蛋白的igg-fc多肽部分用斜体字表示(seqidno:4)。

aat-hfc2(人igg2fc)

示例性的aat-fc融合蛋白是本文所述的aat-mm-el-hfc1(人igg1fc，met351glu/met358leu)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:34)，铰链区用普通文本示出(seqidno:43)，融合蛋白的igg-fc多肽部分用斜体字表示(seqidno:3)，met351glu突变用方框表示，met358leu突变用灰色阴影表示。

aat-mm-el-hfc1(人igg1fc，met351glu/met358leu)

示例性的aat-fc融合蛋白是本文所述的aat-mm-el-hfc2(人igg2fc，met351glu/met358leu)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:34)，铰链区用普通文本示出(seqidno:44)，融合蛋白的igg-fc多肽部分用斜体字表示(seqidno:4)，met351glu突变用方框表示，met358leu突变用灰色阴影表示。

aat-mm-el-hfc2(人igg2fc，met351glu/met358leu)

示例性的aat-fc融合蛋白是本文所述的aat-mm-ll-hfc1(人igg1fc，met351leu/met358leu)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:35)，铰链区用普通文本示出(seqidno:43)，融合蛋白的igg-fc多肽部分用斜体字表示(seqidno:3)，met351leu突变用黑色阴影表示，met358leu突变用灰色阴影表示。

aat-mm-ll-hfc1(人igg1fc，met351leu/met358leu)

示例性的aat-fc融合蛋白是本文所述的aat-mm:ll-hfc2(人igg2fc，met351leu/met358leu)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:35)，铰链区用普通文本示出(seqidno:44)，融合蛋白的igg-fc多肽部分用斜体字表示(seqidno:4)，met351leu突变用黑色阴影表示，met358leu突变用灰色阴影表示。

aat-mm:ll-hfc2(人igg2fc，met351leu/met358leu)

示例性的aat-fc融合蛋白是本文所述的aat-hfc1-aat(人igg1)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:2)，铰链区用普通文本示出(seqidno:43)，astgs接头用普通文本示出(seqidno:45)，融合蛋白的igg-fc多肽部分用斜体字表示(seqidno:3)。

aat-hfc1-aat(人igg1)

这些示例性的aat-fc融合蛋白采用下列技术制备。

从人肝cdna(zyagen)中pcr扩增编码人aat的基因。通过重叠pcr产生编码aat或fc区域的基因内的特异性点突变。将aat编码基因与编码铰链区的基因，接着人igg1、igg2、igg3、igg4或igm的ch2结构域和ch3结构域在框架中克隆至哺乳动物表达载体，所述载体含有在aat基因插入位点上游的哺乳动物分泌信号序列。将这些表达载体转染进入哺乳动物细胞(具体地说hek293或cho细胞)，并且在8%co2中在37℃下生长数天。通过蛋白a色谱法，从表达细胞上清液中纯化出重组aat-fc融合蛋白。重要的是，使用接近中性的ph缓冲液(gentleag/ab洗脱缓冲液，thermoscientific)，以将aat-fc融合蛋白从蛋白a树脂上洗脱出来。使用标准低ph洗脱，无法将aat-fc融合蛋白从蛋白a树脂中洗脱，因为aat抑制ne的能力在低ph处理后受损，可能是由低ph介导的aat寡聚化所致。图1f显示低ph洗脱对aat抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的能力的作用。aat-fc融合蛋白可通过a蛋白和接近中性ph洗脱缓冲液或通过captureselectα-1抗胰蛋白酶亲和基质(bacbv)来纯化。

通过测定其抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(ne)的能力，来测定纯化的aat-fc融合蛋白的活性。图1b和1d显示纯化的血清来源的aat(sdaat)和aat-fc融合蛋白的还原性sds-page凝胶(图1b-泳道1：sdaat，泳道2：aat-fc(seqidno:16)，泳道3：aat-el-fc(seqidno:18)，图1daat-fc-aat(seqidno:20))。通过用考马斯蓝染色使蛋白质显现。

为了监测人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(ne)活性，采用荧光微量板测定法。采用下列测定法，通过残余ne活性的同时降低，测量抑制活性。该测定缓冲液由100mmtrisph7.4、500mmnacl和0.0005%tritonx-100组成。以5nm的终浓度使用人ne(但也可以使用1-20nm)。在所述测定中，以100µm的终浓度使用荧光肽底物aavp-amc。使用来自moleculardevices的geminiem读板仪，分别使用370nm和440nm的激发和发射波长及420nm的截止值，读取测定动力学。在室温下每5-10秒钟扫描达10分钟来读取测定。vmax/秒相当于残余ne活性，将其对抑制剂的各个浓度作图。与x轴的截距表示使测定中起始浓度的ne完全失活所需的抑制剂浓度。在这些测定中，人血清来源的aat(sdaat)用作阳性对照。aat-fc融合蛋白显示有效的ne抑制活性，如图1c所示。其中相对于包含单一aat多肽的sdaat和aat-fc融合蛋白两者，有2个aat多肽与单一fc多肽融合的融合物(aat-fc-aat)显示效能提高(图1e)。本文提供的这些研究结果首次证实了aat可与fc区域融合，并保持其抑制ne的能力。特别令人关注的是，发现aat-fc-aat融合蛋白是更有效的ne抑制剂。

图1f表明aat-el-fc(m351e，m358l)融合蛋白抵抗氧化失活。在ne抑制测定中，将aat融合蛋白、aat-fc(wt)、aat-el-fc(m351e，m358l)和aat-em-fc(m351e)用33mmh2o2处理，并与未处理融合蛋白进行比较。与所测试的其它蛋白质相反，经aat-el-fc的ne抑制不因氧化而受损。

此外，与血清来源的aat相比，aat-fc融合蛋白在大鼠中显示更长的血清半寿期(图1h)。在这些研究中，将3只大鼠/各测试化合物用10mg/kgsdaat或aat-fc经i.v.注射。在48时间内的多个时间点采集血清样品。使用elisa测定血清att浓度。这些研究结果表明，本发明的融合蛋白具有改进的药代动力学性质，并且相对于血清来源的aat，其是用于治疗许多人类炎性病况和感染性疾病的优良治疗形式。

实施例2：aat-tnfα靶向分子融合蛋白

本文提供的研究描述了包含与抗tnfα抗体或tnfα受体的衍生物融合的人aat的重组aat衍生物的几个非限制性实施例。下面提供这些实施例以进一步说明本发明的不同特征。该实施例还说明了用于实施本发明的有用方法。这些实施例不限制并且无意限制所要求保护的发明。

下面的融合蛋白包括来自或来源于以下的细胞因子靶向多肽序列：(i)抗tnfα抗体d2e7(亦称阿达木单抗或humira®)，或(ii)2型tnfα受体的胞外域(tnfr2-ecd)。融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示，抗体恒定区(ch1-铰链-ch2-ch3，或cl)用斜体字表示，d2e7-vh、d2e7-vk和tnfr2-ecd以黑体字表示。虽然这些实施例包括铰链序列和/或接头序列，但是可以使用长度和/或柔性适合的任何铰链序列和/或接头序列来制备本发明的融合蛋白。或者在不使用铰链和/或接头序列的情况下制备融合蛋白。

示例性的aat-tnfα融合蛋白是本文所述d2e7-轻链-aat(g3s)2接头。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:2)，d2e7-vk以黑体字表示(seqidno:37)，(g3s)2接头用普通文本示出(seqidno:46)，抗体恒定区用斜体字表示(seqidno:38)。

d2e7-轻链-aat(g3s)2接头

示例性的aat-tnfα融合蛋白是本文所述的d2e7-轻链-aatastgs接头。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:2)，d2e7-vk以黑体字表示(seqidno:37)，astgs接头用普通文本示出(seqidno:45)，抗体恒定区用斜体字表示(seqidno:38)

d2e7-轻链-aatastgs接头

示例性的aat-tnfα融合蛋白是本文所述的d2e7-重链-aat(g3s)2接头。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:2)，d2e7-vh以黑体字表示(seqidno:39)，(g3s)2接头用普通文本示出(seqidno:46)，抗体恒定区用斜体字表示(seqidno:40)。

d2e7-重链-aat(g3s)2接头

示例性的aat-tnfα融合蛋白是本文所述的d2e7-重链-aatastgs接头。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:2)，d2e7-vh以黑体字表示(seqidno:39)，astgs接头用普通文本示出(seqidno:45)，抗体恒定区用斜体字表示(seqidno:40)。

d2e7-重链-aatastgs接头

示例性的aat-tnfα融合蛋白是本文所述的tnfr2-ecd-fc1-aat(g3s)2接头。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:2)，tnfr2-ecd以黑体字表示(seqidno:41)，铰链区用普通文本示出(seqidno:43)，(g3s)2接头用普通文本示出(seqidno:46)，抗体恒定区用斜体字表示(seqidno:42)。

tnfr2-ecd-fc1-aat(g3s)2接头

示例性的aat-tnfα融合蛋白是本文所述的tnfr2-ecd-fc1-aatastgs接头。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:2)，tnfr2-ecd以黑体字表示(seqidno:41)，铰链区用普通文本示出(seqidno:43)，astgs接头用普通文本示出(seqidno:45)，抗体恒定区用斜体字表示(seqidno:42)。

tnfr2-ecd-fc1-aatastgs接头

这些示例性的aat-tnfα靶向分子融合蛋白采用下列技术制备。

编码抗tnfα抗体d2e7的可变重链(vh)和可变κ(vk)区的基因通过基因合成产生。将d2e7-vh基因与编码人igg1抗体重链恒定区(由ch1结构域、铰链结构域、ch2结构域和ch3结构域组成)的基因在框架内克隆至哺乳动物表达载体中，所述载体含有vh结构域插入位点(d2e7-hc)上游的哺乳动物分泌信号序列。将d2e7-vk基因与人抗体κ轻链恒定(cl)结构域在框架内克隆至哺乳动物表达载体中，所述载体含有vk结构域插入位点(d2e7-lc)上游的哺乳动物分泌信号序列。将aat编码基因和邻接的5’接头序列在框架内克隆至上述哺乳动物表达载体中的d2e7重链基因编码序列的ch3结构域的3’端(d2e7-hc-aat)或d2e7轻链基因编码序列的cl结构域的3’端(d2e7-lc-aat)。tnfα受体2的胞外域(tnfr2-ecd)通过基因合成产生，并与编码铰链区的基因、接着人igg1(hfc1)的ch2结构域和ch3结构域在框架内克隆至哺乳动物表达载体中，所述载体含有tnfr2-ecd插入位点上游的哺乳动物分泌信号序列。将aat编码基因和邻接的5’接头序列在框架内克隆至哺乳动物表达载体上的编码tnfr2-ecd-hfc1的基因的3’端(tnfr2-ecd-hfc1-aat)。

将d2e7-hc-aat表达载体与d2e7-lc或d2e7-lc-aat表达载体一起共转染至哺乳动物细胞(具体为hek293或cho细胞)以产生具有分别与重链的c端或重链和轻链两者的c端融合的aat的d2e7抗体。将d2e7-lc-aat与d2e7-hc表达载体一起共转染至哺乳动物细胞以产生具有与轻链的c端融合的aat的d2e7抗体。将tnfr2-hfc1-aat表达载体转染至哺乳动物细胞中。使转染细胞在8%co2中在37℃下生长数天。

通过蛋白a色谱法从表达细胞上清液中纯化出重组aat-tnfα靶向融合蛋白。使用接近中性的ph缓冲液(gentleag/ab洗脱缓冲液，thermoscientific)将aat-tnfα靶向融合蛋白从蛋白a树脂中洗脱。

图2b显示仅d2e7抗体(泳道1)和其中aat与d2e7的重链融合的变体(泳道2)的sds-page凝胶。通过用考马斯蓝染色使蛋白质显现。

通过测定其抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的能力，来测定纯化的aat-tnfα靶向分子融合蛋白的活性。在这些测定中，人血清来源的aat(sdaat)用作阳性对照。ne抑制测定如上所述进行。图2c表明相对于sdaat，aat-tnfα靶向分子融合蛋白显示对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的类似抑制，这就表明aat的抑制能力不因其与抗体融合而受损。

实施例3aat-fc-slpi和aat-fc-抑弹性蛋白酶蛋白

本文提供的研究描述了包含人aat融合的含有wap结构域的蛋白质的重组aat衍生物的几个非限制性实施例。下面提供这些实施例以进一步说明本发明的不同特征。该实施例还说明了用于实施本发明的有用方法。融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示，fc部分用斜体字表示，含有wap结构域的多肽为黑体字。虽然这些实施例包括铰链序列和/或接头序列，但是可以使用长度和/或柔性适合的任何铰链序列和/或接头序列来制备本发明的融合蛋白。或者在不使用铰链和/或接头序列的情况下制备融合蛋白。例如，多肽组分可以直接连接。

示例性的aat-fc-slpi融合蛋白是本文所述的aat-hfc1-slpi(人igg1fc)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:2)，铰链区用普通文本示出(seqidno:43)，astgs接头用普通文本示出(seqidno:45)，fc部分用斜体字表示(seqidno:3)，含有wap结构域的多肽为黑体字(seqidno:9)。

aat-hfc1-slpi(人igg1fc)

示例性的aat-fc-抑弹性蛋白酶蛋白融合蛋白是本文所述的aat-hfc1-抑弹性蛋白酶蛋白(人igg1fc)。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:2)，铰链区用普通文本示出(seqidno:43)，astgs接头用普通文本示出(seqidno:45)，fc部分用斜体字表示(seqidno:3)，含有wap结构域的多肽为黑体字(seqidno:12)。

aat-hfc1-抑弹性蛋白酶蛋白(人igg1fc)

从人脾cdna(zyagen)中pcr扩增编码slpi和抑弹性蛋白酶蛋白的基因。将这些基因克隆至实施例1的哺乳动物表达载体中，其中将slpi或抑弹性蛋白酶蛋白基因与aat-fc基因在框架内插入。将这些表达载体转染至哺乳动物细胞(具体为hek293或cho细胞)中，并在8%co2中在37℃下生长数天。通过蛋白a色谱法，从表达细胞上清液中纯化重组aat-fc-wap结构域融合蛋白。使用接近中性的ph缓冲液(gentleag/ab洗脱缓冲液，thermoscientific)，将aat-fc-wap结构域融合蛋白从蛋白a树脂中洗脱。

图3b显示aat-fc-wap融合蛋白(泳道1aat-fc-抑弹性蛋白酶蛋白，泳道2aat-fc-slpi)的sds-page凝胶。通过用考马斯蓝染色使蛋白质显现。通过测定其抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的能力，测试纯化的aat-fc-wap结构域融合蛋白的活性。ne抑制测定如上所述进行。在这些测定中，人血清来源的aat(sdaat)和aat-fc融合蛋白用作阳性对照。相对于sdaat，aat-fc-wap靶向分子融合蛋白显示ne抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的效能提高(图3c)。

实施例4aat-白蛋白

本文提供的研究描述了包含人aat融合的白蛋白多肽的重组aat衍生物的几个非限制性实例。下面提供这些实施例以进一步说明本发明的不同特征。该实施例还说明了用于实施本发明的有用方法。这些实施例不限制并且无意限制所要求保护的发明。aat部分用下划线表示和白蛋白部分用斜体字表示。例如，多肽组分可以直接连接。

示例性的aat-白蛋白融合蛋白是本文所述的aat-hsa。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:2)，astgs接头用普通文本示出(seqidno:45)，白蛋白多肽用斜体字表示(seqidno:14)。

aat-hsa

示例性的aat-白蛋白融合蛋白是本文所述的aat-hsa结构域3。如下所示，融合蛋白的aat多肽部分用下划线表示(seqidno:2)，astgs接头用普通文本示出(seqidno:45)，白蛋白多肽用斜体字表示(seqidno:15)。

aat-hsa结构域3

从人肝cdna(zyagen)中pcr扩增编码人血清白蛋白(hsa)的基因。产生哺乳动物表达载体，其中将编码hsa或hsa的结构域3的基因在框架内克隆至含有aat上游的哺乳动物分泌信号序列的aat编码基因的3’端。

将这些表达载体转染至哺乳动物细胞(具体为hek293或cho细胞)，并在8%co2中在37℃下生长数天。使用captureselectα-1抗胰蛋白酶亲和基质(bacbv)，从表达细胞上清液中纯化重组aat-hsa融合蛋白，其中结合缓冲液由20mmtris、150mmnacl、ph7.4组成，洗脱缓冲液由20mmtris、2mmgcl2ph7.4组成。

图4b显示aat-hsa融合蛋白的sds-page凝胶。通过用考马斯蓝染色使蛋白质显现。通过测定其抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的能力，测试纯化的aat-hsa融合蛋白的活性。ne抑制测定如上所述进行。在这些测定中，人血清来源的aat(sdaat)用作阳性对照。相对于sdaat，aat-hs融合蛋白显示类似的ne抑制效能，这表明了与白蛋白融合不减弱aat抑制ne的能力(图4c)。

其它实施方案

虽然结合其详细描述描述了本发明，但前述描述旨在说明，并不限制本发明的范围，其通过随附权利要求书的范围限定。其它方面、优势和修改落入随附权利要求书的范围内。

本说明书还提供以下方案：

1.一种分离的融合蛋白，其包含与第二多肽有效连接的至少一个人丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽，其中所述第二多肽包含以下的至少一种：

免疫球蛋白fc多肽或来源于免疫球蛋白fc多肽的氨基酸序列；

细胞因子靶向多肽或来源于细胞因子靶向多肽的序列；

含有wap结构域的多肽或来源于含有wap结构域的多肽的序列；或

白蛋白多肽或来源于血清白蛋白多肽的氨基酸序列；

2.一种分离的融合蛋白，其包含与以下的至少一种的第二多肽有效连接的至少一个α-1抗胰蛋白酶(aat)多肽：

免疫球蛋白fc多肽；

细胞因子靶向肽；

人分泌白细胞蛋白酶抑制剂(slpi)多肽；和

免疫球蛋白fc多肽和人slpi多肽，其中slpi多肽包含人slpi的wap2结构域；或

人血清白蛋白(hsa)多肽；

3.一种分离的融合蛋白，其包含与以下的至少一种的第二多肽有效连接的至少一个α-1抗胰蛋白酶(aat)多肽：

免疫球蛋白fc多肽；

细胞因子靶向肽；

人抑弹性蛋白酶蛋白多肽；

人抑弹性蛋白酶蛋白多肽和免疫球蛋白fc多肽，其中抑弹性蛋白酶蛋白多肽包含人抑弹性蛋白酶蛋白的wap结构域；或

人血清白蛋白(hsa)多肽；

4.项1的融合蛋白，其中所述人丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽是人α-1抗胰蛋白酶(aat)多肽或来源于人aat多肽；

5.项2-4中任一项的分离融合蛋白，其中所述aat多肽包含seqidno:2的氨基酸序列；

6.项2-4中任一项的分离融合蛋白，其中所述aat多肽包含含有seqidno:1的氨基酸序列的aat的反应部位环或含有seqidno:32或33的氨基酸序列的aat的突变反应部位环；

7.项2-4中任一项的分离融合蛋白，其中所述免疫球蛋白fc多肽是人fc多肽；

8.项7的分离融合蛋白，其中所述人fc多肽是人igm多肽或人iggfc多肽；

9.项8的分离融合蛋白，其中所述人iggfc多肽是人igg1多肽、人igg2fc多肽、人igg3fc多肽或人igg4fc多肽；

10.项1-3中任一项的分离融合蛋白，其中所述免疫球蛋白fc多肽包含选自seqidno:3、4、5、6和7的氨基酸序列；

11.项1的分离融合蛋白，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽和免疫球蛋白fc多肽通过铰链区、接头区或铰链区和接头区两者有效连接；

12.项2-4中任一项的分离融合蛋白，其中所述aat多肽和免疫球蛋白fc多肽通过铰链区、接头区或铰链区和接头区两者有效连接；

13.项11或项12的分离融合蛋白，其中铰链区、接头区或铰链区和接头区两者包含肽序列；

14.项1-3中任一项的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20和seqidno:21的氨基酸序列；

15.项1-6中任一项的分离融合蛋白，其中所述细胞因子靶向多肽是人细胞因子受体多肽或人细胞因子受体多肽的衍生物、结合细胞因子受体的细胞因子靶向多肽或结合人细胞因子的细胞因子靶向多肽；

16.项15的分离融合蛋白，其中所述人细胞因子受体多肽包含多个亚基；

17.项15或项16的分离融合蛋白，其中所述人细胞因子受体是tnfα、ige、il-12、il-23、il-6、il-1α、il-1β、il-17、il-13、il-12和il-23的p40亚基、il-4、il-10、il-2、il-18、il-27或il-32的受体；

18.项17的分离融合蛋白，其中所述细胞因子受体是人tnfα的受体；

19.项15的分离融合蛋白，其中所述人细胞因子是tnfα、ige、il-12、il-23、il-6、il-1α、il-1β、il-17、il-13、il-12和il-23的p40亚基、il-4、il-10、il-2、il-18、il-27或il-32；

20.项19的分离融合蛋白，其中所述细胞因子是人tnfα；

21.项15的分离融合蛋白，其中所述细胞因子靶向多肽是抗体或抗体片段；

22.项21的分离融合蛋白，其中所述抗体或抗体片段是嵌合的、人源化的或完全人的；

23.项1-6的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26和seqidno:27的氨基酸序列；

24.项1的分离融合蛋白，其中所述含有wap结构域的多肽序列包含含有选自seqidno:8、9和10的氨基酸序列的slpi多肽序列；

25.项1的分离融合蛋白，其中所述含有wap结构域的多肽序列包含含有选自seqidno:11、12和13的氨基酸序列的抑弹性蛋白酶蛋白多肽序列；

26.项1的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽、含有wap结构域的多肽和免疫球蛋白fc多肽，使得丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽、含有wap结构域的多肽和免疫球蛋白fc多肽的至少两个通过铰链区、接头区或铰链区和接头区两者有效连接；

27.项2的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含aat多肽、slpi多肽和免疫球蛋白fc多肽，使得aat多肽、slpi多肽和免疫球蛋白fc多肽的至少两个通过铰链区、接头区或铰链区和接头区两者有效连接；

28.项3的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含aat多肽、抑弹性蛋白酶蛋白多肽和免疫球蛋白fc多肽，使得aat多肽、抑弹性蛋白酶蛋白多肽和免疫球蛋白fc多肽的至少两个通过铰链区、接头区或铰链区和接头区两者有效连接；

29.项2-4中任一项的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含两个aat多肽和一个免疫球蛋白fc多肽；

30.项29的分离融合蛋白，其中所述两个aat多肽的每一个通过铰链区、接头区或铰链区和接头区两者与免疫球蛋白fc多肽有效连接，使得融合蛋白具有如下的从n端到c端的结构排列：aat多肽-免疫球蛋白fc多肽-aat多肽；

31.项26-30中任一项的分离融合蛋白，其中所述铰链区、接头区或铰链区和接头区两者包含肽序列；

32.项2的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seqidno:28的氨基酸序列；

33.项2的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seqidno:29的氨基酸序列；

34.项1的融合蛋白，其中所述白蛋白多肽是人血清白蛋白(hsa)多肽或来源于hsa多肽；

35.项2、3或34中任一项的分离融合蛋白，其中hsa多肽包含seqidno:14的氨基酸序列或seqidno:15的氨基酸序列；

36.项2、3或34中任一项的分离融合蛋白，其中所述hsa多肽包含hsa的结构域3；

37.项34的分离融合蛋白，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白通过白蛋白结合多肽与hsa有效连接；

38.项2或项3的分离融合蛋白，其中所述aat多肽通过白蛋白结合多肽与hsa有效连接；

39.项37或38的分离融合蛋白，其中所述白蛋白结合多肽是抗体或抗体片段或来源于抗体或抗体片段；

40.项39的分离融合蛋白，其中所述抗体或抗体片段是嵌合的、人源化的或完全人的；

41.项37或38的分离融合蛋白，其中所述白蛋白结合多肽是肽；

42.项47的分离融合蛋白，其中所述白蛋白结合多肽是链球菌蛋白g的结构域3或来源于链球菌蛋白g的结构域3的序列；

43.项1的分离融合蛋白，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与hsa多肽共价连接；

44.项1的分离融合蛋白，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与hsa多肽非共价连接；

45.项1-3中任一项的分离融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seqidno:30或31的氨基酸序列；

46.项1-3中任一项的分离融合蛋白，其中所述免疫球蛋白fc多肽经修饰以提高fcrn结合；

47.项1-3中任一项的分离融合蛋白，其中所述免疫球蛋白fc多肽包含下列突变中的至少一个：met252tyr、ser254thr、thr256glu、met428leu或asn434ser；

48.一种治疗或减轻有需要的受试者中与丝氨酸蛋白酶表达或活性异常有关的疾病或病症的症状的方法，所述方法包括给予前述项中任一项的融合蛋白；

49.一种治疗或减轻有需要的受试者中炎症或炎性疾病或病症的症状同时降低感染风险的方法，所述方法包括给予前述项中任一项的融合蛋白；

50.一种降低有需要的受试者中感染风险的方法，所述方法包括给予前述项中任一项的融合蛋白；

51.项48-51中任一项的方法，其中所述受试者是人；

52.49的方法，其中所述炎性疾病或病症选自：气肿、慢性阻塞性肺病(copd)、急性呼吸窘迫综合征(ards)、变应性哮喘、囊性纤维化、肺癌、缺血再灌注损伤、心脏移植术后缺血/再灌注损伤、心肌梗死、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、银屑病、i型和/或ii型糖尿病、肺炎、脓毒症、移植物抗宿主病(gvhd)、伤口愈合、系统性红斑狼疮和多发性硬化；

53.50的方法，其中所述感染选自细菌感染、真菌感染或病毒感染。

<110>inhibrxllc

eckelman,brendanp.

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<120>丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合多肽及其使用方法

<130>inhi-002/n01cn

<150>pct/us2012/044730

<151>2012-06-28

<150>us61/502,055

<151>2011-06-28

<150>us61/570,394

<151>2011-12-14

<150>us61/577,204

<151>2011-12-19

<150>us61/638,168

<151>2012-04-25

<160>46

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>α-1抗胰蛋白酶(aat)蛋白的反应部位环部分

<400>1

glythrglualaalaglyalametpheleuglualaileprometser

151015

ileproprogluvallyspheasnlys

2025

<210>2

<211>394

<212>prt

<213>人(homosapiens)

<400>2

gluaspproglnglyaspalaalaglnlysthraspthrserhishis

151015

aspglnasphisprothrpheasnlysilethrproasnleualaglu

202530

phealapheserleutyrargglnleualahisglnserasnserthr

354045

asnilephepheserprovalserilealathralaphealametleu

505560

serleuglythrlysalaaspthrhisaspgluileleugluglyleu

65707580

asnpheasnleuthrgluileproglualaglnilehisgluglyphe

859095

glngluleuleuargthrleuasnglnproaspserglnleuglnleu

100105110

thrthrglyasnglyleupheleusergluglyleulysleuvalasp

115120125

lyspheleugluaspvallyslysleutyrhisserglualaphethr

130135140

valasnpheglyaspthrgluglualalyslysglnileasnasptyr

145150155160

valglulysglythrglnglylysilevalaspleuvallysgluleu

165170175

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aspargaspthrvalphealaleuvalasntyrilephephelysgly

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gluglylysleuglnhisleugluasngluleuthrhisaspileile

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prolysleuserilethrglythrtyraspleulysservalleugly

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glnleuglyilethrlysvalpheserasnglyalaaspleusergly

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valthrgluglualaproleulysleuserlysalavalhislysala

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valleuthrileaspglulysglythrglualaalaglyalametphe

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leuglualaileprometserileproprogluvallyspheasnlys

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151015

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202530

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65707580

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859095

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100105110

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130135140

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165170175

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210215220

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355360365

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435440445

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515520525

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565570575

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675680685

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lysala

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<212>prt

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290295300

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305310315320

valthrgluglualaproleulysleuserlysalavalhislysala

325330335

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340345350

leuglualaileprometserileproprogluvallyspheasnlys

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370375380

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proservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetile

420425430

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435440445

aspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhis

450455460

asnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrarg

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675680685

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asnilephepheserprovalserilealathralaphealametleu

505560

serleuglythrlysalaaspthrhisaspgluileleugluglyleu

65707580

asnpheasnleuthrgluileproglualaglnilehisgluglyphe

859095

glngluleuleuargthrleuasnglnproaspserglnleuglnleu

100105110

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115120125

lyspheleugluaspvallyslysleutyrhisserglualaphethr

130135140

valasnpheglyaspthrgluglualalyslysglnileasnasptyr

145150155160

valglulysglythrglnglylysilevalaspleuvallysgluleu

165170175

aspargaspthrvalphealaleuvalasntyrilephephelysgly

180185190

lystrpgluargprophegluvallysaspthrgluglugluaspphe

195200205

hisvalaspglnvalthrthrvallysvalprometmetlysargleu

210215220

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275280285

prolysleuserilethrglythrtyraspleulysservalleugly

290295300

glnleuglyilethrlysvalpheserasnglyalaaspleusergly

305310315320

valthrgluglualaproleulysleuserlysalavalhislysala

325330335

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340345350

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355360365

prophevalpheleumetilegluglnasnthrlysserproleuphe

370375380

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385390395400

alahislyssergluvalalahisargphelysaspleuglygluglu

405410415

asnphelysalaleuvalleuilealaphealaglntyrleuglngln

420425430

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435440445

alalysthrcysvalalaaspgluseralagluasncysasplysser

450455460

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500505510

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580585590

alalysglnargleulyscysalaserleuglnlyspheglygluarg

595600605

alaphelysalatrpalavalalaargleuserglnargpheprolys

610615620

alagluphealagluvalserlysleuvalthraspleuthrlysval

625630635640

histhrglucyscyshisglyaspleuleuglucysalaaspasparg

645650655

alaaspleualalystyrilecysgluasnglnaspserileserser

660665670

lysleulysglucyscysglulysproleuleuglulysserhiscys

675680685

ilealagluvalgluasnaspglumetproalaaspleuproserleu

690695700

alaalaaspphevalgluserlysaspvalcyslysasntyralaglu

705710715720

alalysaspvalpheleuglymetpheleutyrglutyralaargarg

725730735

hisproasptyrservalvalleuleuleuargleualalysthrtyr

740745750

gluthrthrleuglulyscyscysalaalaalaaspprohisglucys

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tyralalysvalpheaspgluphelysproleuvalglugluprogln

770775780

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820825830

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900905910

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930935940

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hisvalaspglnvalthrthrvallysvalprometmetlysargleu

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glymetpheasnileglnhiscyslyslysleusersertrpvalleu

225230235240

leumetlystyrleuglyasnalathralailephepheleuproasp

245250255

gluglylysleuglnhisleugluasngluleuthrhisaspileile

260265270

thrlyspheleugluasngluaspargargseralaserleuhisleu

275280285

prolysleuserilethrglythrtyraspleulysservalleugly

290295300

glnleuglyilethrlysvalpheserasnglyalaaspleusergly

305310315320

valthrgluglualaproleulysleuserlysalavalhislysala

325330335

valleuthrileaspglulysglythrglualaalaglyalametphe

340345350

leuglualaileprometserileproprogluvallyspheasnlys

355360365

prophevalpheleumetilegluglnasnthrlysserproleuphe

370375380

metglylysvalvalasnprothrglnlysalaserthrglyserglu

385390395400

gluproglnasnleuilelysglnasncysgluleuphegluglnleu

405410415

glyglutyrlyspheglnasnalaleuleuvalargtyrthrlyslys

420425430

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435440445

glylysvalglyserlyscyscyslyshisproglualalysargmet

450455460

procysalagluasptyrleuservalvalleuasnglnleucysval

465470475480

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485490495

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500505510

gluthrtyrvalprolysglupheasnalagluthrphethrphehis

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alaaspilecysthrleuserglulysgluargglnilelyslysgln

530535540

thralaleuvalgluleuvallyshislysprolysalathrlysglu

545550555560

glnleulysalavalmetaspaspphealaalaphevalglulyscys

565570575

cyslysalaaspasplysgluthrcysphealaglugluglylyslys

580585590

leuvalala

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<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>融合α-1抗胰蛋白酶多肽的变体的反应部位环

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ileproprogluvallyspheasnlys

2025

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<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>融合α-1抗胰蛋白酶多肽的变体的反应部位环

<400>33

glythrglualaalaglyalaleupheleuglualaileproleuser

151015

ileproprogluvallyspheasnlys

2025

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>aat-mm-el-hfc1融合蛋白的α-1抗胰蛋白酶多肽部分

<400>34

gluaspproglnglyaspalaalaglnlysthraspthrserhishis

151015

aspglnasphisprothrpheasnlysilethrproasnleualaglu

202530

phealapheserleutyrargglnleualahisglnserasnserthr

354045

asnilephepheserprovalserilealathralaphealametleu

505560

serleuglythrlysalaaspthrhisaspgluileleugluglyleu

65707580

asnpheasnleuthrgluileproglualaglnilehisgluglyphe

859095

glngluleuleuargthrleuasnglnproaspserglnleuglnleu

100105110

thrthrglyasnglyleupheleusergluglyleulysleuvalasp

115120125

lyspheleugluaspvallyslysleutyrhisserglualaphethr

130135140

valasnpheglyaspthrgluglualalyslysglnileasnasptyr

145150155160

valglulysglythrglnglylysilevalaspleuvallysgluleu

165170175

aspargaspthrvalphealaleuvalasntyrilephephelysgly

180185190

lystrpgluargprophegluvallysaspthrgluglugluaspphe

195200205

hisvalaspglnvalthrthrvallysvalprometmetlysargleu

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glymetpheasnileglnhiscyslyslysleusersertrpvalleu

225230235240

leumetlystyrleuglyasnalathralailephepheleuproasp

245250255

gluglylysleuglnhisleugluasngluleuthrhisaspileile

260265270

thrlyspheleugluasngluaspargargseralaserleuhisleu

275280285

prolysleuserilethrglythrtyraspleulysservalleugly

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glnleuglyilethrlysvalpheserasnglyalaaspleusergly

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valthrgluglualaproleulysleuserlysalavalhislysala

325330335

valleuthrileaspglulysglythrglualaalaglyalagluphe

340345350

leuglualaileproleuserileproprogluvallyspheasnlys

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<223>aat-mm-ll-hfc1融合蛋白的aat多肽部分

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asnpheasnleuthrgluileproglualaglnilehisgluglyphe

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glngluleuleuargthrleuasnglnproaspserglnleuglnleu

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valasnpheglyaspthrgluglualalyslysglnileasnasptyr

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valglulysglythrglnglylysilevalaspleuvallysgluleu

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245250255

gluglylysleuglnhisleugluasngluleuthrhisaspileile

260265270

thrlyspheleugluasngluaspargargseralaserleuhisleu

275280285

prolysleuserilethrglythrtyraspleulysservalleugly

290295300

glnleuglyilethrlysvalpheserasnglyalaaspleusergly

305310315320

valthrgluglualaproleulysleuserlysalavalhislysala

325330335

valleuthrileaspglulysglythrglualaalaglyalaleuphe

340345350

leuglualaileproleuserileproprogluvallyspheasnlys

355360365

prophevalpheleumetilegluglnasnthrlysserproleuphe

370375380

metglylysvalvalasnprothrglnlys

385390

<210>36

<211>626

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>aat-mm-ll-hfc1融合蛋白

<400>36

gluaspproglnglyaspalaalaglnlysthraspthrserhishis

151015

aspglnasphisprothrpheasnlysilethrproasnleualaglu

202530

phealapheserleutyrargglnleualahisglnserasnserthr

354045

asnilephepheserprovalserilealathralaphealametleu

505560

serleuglythrlysalaaspthrhisaspgluileleugluglyleu

65707580

asnpheasnleuthrgluileproglualaglnilehisgluglyphe

859095

glngluleuleuargthrleuasnglnproaspserglnleuglnleu

100105110

thrthrglyasnglyleupheleusergluglyleulysleuvalasp

115120125

lyspheleugluaspvallyslysleutyrhisserglualaphethr

130135140

valasnpheglyaspthrgluglualalyslysglnileasnasptyr

145150155160

valglulysglythrglnglylysilevalaspleuvallysgluleu

165170175

aspargaspthrvalphealaleuvalasntyrilephephelysgly

180185190

lystrpgluargprophegluvallysaspthrgluglugluaspphe

195200205

hisvalaspglnvalthrthrvallysvalprometmetlysargleu

210215220

glymetpheasnileglnhiscyslyslysleusersertrpvalleu

225230235240

leumetlystyrleuglyasnalathralailephepheleuproasp

245250255

gluglylysleuglnhisleugluasngluleuthrhisaspileile

260265270

thrlyspheleugluasngluaspargargseralaserleuhisleu

275280285

prolysleuserilethrglythrtyraspleulysservalleugly

290295300

glnleuglyilethrlysvalpheserasnglyalaaspleusergly

305310315320

valthrgluglualaproleulysleuserlysalavalhislysala

325330335

valleuthrileaspglulysglythrglualaalaglyalaleuphe

340345350

leuglualaileproleuserileproprogluvallyspheasnlys

355360365

prophevalpheleumetilegluglnasnthrlysserproleuphe

370375380

metglylysvalvalasnprothrglnlysgluprolyssercysasp

385390395400

lysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglygly

405410415

proservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetile

420425430

serargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisglu

435440445

aspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhis

450455460

asnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrarg

465470475480

valvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylys

485490495

glutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglu

500505510

lysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyr

515520525

thrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleu

530535540

thrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrp

545550555560

gluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproproval

565570575

leuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasp

580585590

lysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethis

595600605

glualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserpro

610615620

glylys

625

<210>37

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的d2e7-vk部分

<400>37

aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysargalaserglnglyileargasntyr

202530

leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile

354045

tyralaalaserthrleuglnserglyvalproserargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro

65707580

gluaspvalalathrtyrtyrcysglnargtyrasnargalaprotyr

859095

thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

100105

<210>38

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的抗体恒定区

<400>38

argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu

151015

glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe

202530

tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln

354045

serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser

505560

thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu

65707580

lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser

859095

provalthrlysserpheasnargglyglucys

100105

<210>39

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的d2e7-vh部分

<400>39

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyarg

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspasptyr

202530

alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralailethrtrpasnserglyhisileasptyralaaspserval

505560

gluglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alalysvalsertyrleuserthralaserserleuasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleu

115

<210>40

<211>335

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的抗体恒定区

<400>40

valthrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleu

151015

alaproserserlysserthrserglyglythralaalaleuglycys

202530

leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser

354045

glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser

505560

serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserser

65707580

leuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasn

859095

thrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthrhis

100105110

thrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproserval

115120125

pheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthr

130135140

progluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspproglu

145150155160

vallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalys

165170175

thrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalser

180185190

valleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlys

195200205

cyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrile

210215220

serlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleupro

225230235240

proserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleu

245250255

vallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasn

260265270

glyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspser

275280285

aspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserarg

290295300

trpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleu

305310315320

hisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

325330335

<210>41

<211>235

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的tnfr2-ecd部分

<400>41

leuproalaglnvalalaphethrprotyralaprogluproglyser

151015

thrcysargleuargglutyrtyraspglnthralaglnmetcyscys

202530

serlyscysserproglyglnhisalalysvalphecysthrlysthr

354045

seraspthrvalcysaspsercysgluaspserthrtyrthrglnleu

505560

trpasntrpvalproglucysleusercysglyserargcysserser

65707580

aspglnvalgluthrglnalacysthrarggluglnasnargilecys

859095

thrcysargproglytrptyrcysalaleuserlysglngluglycys

100105110

argleucysalaproleuarglyscysargproglypheglyvalala

115120125

argproglythrgluthrseraspvalvalcyslysprocysalapro

130135140

glythrpheserasnthrthrserserthraspilecysargprohis

145150155160

glnilecysasnvalvalalaileproglyasnalasermetaspala

165170175

valcysthrserthrserprothrargsermetalaproglyalaval

180185190

hisleuproglnprovalserthrargserglnhisthrglnprothr

195200205

progluproserthralaproserthrserpheleuleuprometgly

210215220

proserproproalagluglyserthrglyasp

225230235

<210>42

<211>232

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白的抗体恒定区

<400>42

gluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproala

151015

progluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolyspro

202530

lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval

354045

valaspvalserhisgluaspproglnvallyspheasntrptyrval

505560

aspglyvalglnvalhisasnalalysthrlysproarggluglngln

65707580

tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln

859095

asntrpleuaspglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala

100105110

leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro

115120125

arggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthr

130135140

lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser

145150155160

aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr

165170175

lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr

180185190

serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe

195200205

sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys

210215220

serleuserleuserproglylys

225230

<210>43

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>铰链区

<400>43

gluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocyspro

151015

<210>44

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>铰链区

<400>44

gluarglyscyscysvalglucysproprocyspro

1510

<210>45

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>astgs接头

<400>45

alaserthrglyser

15

<210>46

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>(g3s)2接头

<400>46

glyglyglyserglyglyglyser

15