产电希瓦氏工程菌株及构建方法及用途与流程

文档序号：19723713发布日期：2020-01-18 03:09阅读：163来源：国知局

本发明涉及生物能源技术领域，更具体的说是涉及一种产电希瓦氏工程菌株及构建方法及用途。

背景技术：

能源短缺和环境污染是我国现今面临的日益严峻的问题，因而能源开发和环境废物治理及过程中能源可再生利用成为了我国现代社会进行可持续发展的一大挑战。科学家们不断寻找新的技术解决方案，其中微生物燃料电池(microbialfuelcell,mfc)就是其中之一用来产生可替代能源和环境废物治理新装置，并且其重要性现今日益显现。

mfc是利用产电微生物作为阳极催化剂将有机物中的化学能转化为电能的装置。

微生物产电能力相差很大，产电微生物决定着mfc的功能及应用，希瓦氏菌(shewanellaoneidensis)属是目前发现的广泛用于mfc中产电的微生物之一，其代谢路径和胞外电子传递路径研究的比较明确。shewanellaoneidensismr-1(简称希瓦氏菌mr-1)是希瓦氏菌属中在基因组序列注释和遗传特性方面研究最广泛的菌株。该菌株能够在不添加外源媒介的情况下，将电子转移到微生物燃料电池中的阳极，成为研究微生物如何在mfcs中产生电流的模型生物之一。

研究表明微生物胞外电子传递(extracellularelectrontransfer,eet)是一个受多种细胞成分影响的复杂过程。其中生物膜的厚度直接影响胞外电子传递的强度，影响生物燃料电池的功率密度。但野生型希瓦氏菌株mr-1细胞粘附性较弱，不能形成较厚且稳定的生物膜。因此，构建易于形成生物膜的希瓦氏菌株，不仅能够弥补希瓦氏菌的一些缺陷，而且也能够提高mfc的电化学效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种产电希瓦氏工程菌株。

本发明的第二个目的是提供一种产电希瓦氏工程菌株的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种产电希瓦氏工程菌株的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种产电希瓦氏工程菌株的构建方法，包括如下步骤：敲除野生型希瓦氏菌shewanellaoneidensismr-1的目标基因exem，得到产电希瓦氏工程菌株δexem，所述基因exem的核苷酸序列如seqidno15所示。

上述方法构建的产电希瓦氏工程菌株δexem。

上述产电希瓦氏工程菌株δexem产电的用途。

本发明的优点：

本发明构建的一种产电希瓦氏工程菌株δexem为基因缺陷型菌株，该菌株能够产生更多的胞外dna(extracellulardna，edna)，edna促进细菌粘附、聚集和生物膜的形成，进而增强胞外电子传递，提高微生物燃料电池的功率密度。

附图说明

图1为引物设计与同源区基因扩增方法。

图2为希瓦氏菌mr-1与产电希瓦氏工程菌株δexemmfc产电电压对比图。

图3为电化学表征图。

具体实施方式

原始菌株野生型希瓦氏菌shewanellaoneidensismr-1简称：野生型希瓦氏菌mr-1，于2010年9月购自atcc(美国，https://www.atcc.org/)公司的atcc700550菌株。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种产电希瓦氏工程菌株的构建方法，包括如下步骤：敲除野生型希瓦氏菌mr-1的目标基因exem，得到产电希瓦氏工程菌株δexem，所述基因exem的核苷酸序列如seqidno15表示。

具体构建方法包括如下步骤：

利用att位点特异性重组和双交换删除的方法敲除野生型希瓦氏菌mr-1目标基因exem。

(1)引物设计和基因扩增：

从ncbi数据库获得希瓦氏菌mr-1的基因组序列，根据目标基因exem及其上下游基因序列设计三对引物，exem-lf(seqidno.4)和exem-lr(seqidno.5)、exem-5-o(seqidno.6)和exem-5-i(seqidno.7)、exem-3-o(seqidno.8)和exem-3-i(seqidno.9)，在体外扩增目的基因上游同源区和下游同源区，其中包含部分目的基因序列，扩增长度大约500-1000bp,再通过融合pcr把上下游同源区基因连接在一起，形成融合同源区片段。如图1所示。其中在引物exem-5-o和exem-3-o的5’端分别添加特异性位点attb1和attb2，在引物exem-5-i和exem-3-i的5’端添加一个20bp左右的同源互补序列(linker)。

上游同源区的核苷酸序列如seqidno.1所示；

下游同源区的核苷酸序列如seqidno.2所示；

融合同源区的核苷酸序列如seqidno.3所示；

特异性位点attb1和attb2的核苷酸序列分别如seqidno.10、seqidno.11所示；

同源互补序列(linker)的核苷酸序列如seqidno.12所示；

(2)将步骤(1)获得的融合片段通过att位点特异性重组整合到自杀质粒phg1.0载体(核苷酸序列如seqidno.13示)上，构建好的质粒先转入大肠杆菌wm3064(商业菌株)中，然后wm3064与希瓦氏菌mr-1结合转移，将构建好的质粒转入希瓦氏菌mr-1中。希瓦氏菌mr-1需要在lb培养基中，30℃培养，而大肠杆菌wm3064其生长需要在lb培养基中添加0.3m/mldap(2,6-二氨基庚二酸)，37℃培养。

a、att位点特异性重组反应体系(5ul)：

融合片段:1ul(～75ng)

phg1.0:1ul(～75ng)

bpclonaseiienzymemix:1ul

h2o:2ul

b、gatewaybpclonaseiienzyme反应程序：

将上述各种成分混匀，在25℃条件下反应5小时,然后降温到4℃保存；

c、wm3064化学转化步骤：

1.从-80℃冰箱中取50ulwm3064感受态细胞置于冰上10min；

2.把b中反应复合物与wm3064感受态细胞在1.5ml的离心管中混匀，冰浴30min；

3.然后在水浴锅中42℃热激90s，再次冰浴5min；

4.向上述体系中添加1ml含0.3m/mldap的lb培养基，37℃，150rpm，培养1小时；

5.取200ul培养液涂布于lb平板(含15ug/ml庆大霉素)上,30℃培养12小时；

6.挑取单菌落进行pcr验证，验证正确的wm3064与希瓦氏菌mr-1进行接合转移。

(3)将步骤(2)获得重组菌株在lb(含15ug/ml的庆大霉素)平板上培养，挑单菌落进行pcr验证，通过抗性筛选以及菌落pcr验证，获得自杀质粒整合到mr-1基因组中的重组菌株。其中菌落pcr所用引物为exem-lf(在mr-1基因组上)和fprimer(在自杀质粒phg1.0上)。引物fprimer的核苷酸序列如seqidno.14所示；

(4)将步骤(3)验证正确的菌株在lb(含15ug/ml的庆大霉素)液体培养基中过夜培养，然后以1％的比例转接到无抗lb培养基中培养至od值为0.4左右，取200ul涂布于不含nacl，含有质量浓度10％蔗糖的lb平板上，30℃培养12小时。然后挑取单菌落进行pcr验证，并且进行测序验证；通过蔗糖负筛选和菌落pcr验证，获得exem基因敲除型希瓦氏菌δexem。验证正确的重组菌株保存于-80℃冰箱，用于后续实验。

实施例2：产电希瓦氏工程菌株δexem和野生型希瓦氏菌mr-1mfc产电

1、菌株活化

将产电希瓦氏工程菌株δexem和野生型希瓦氏菌mr-1从-80℃冰箱取出，在lb培养基里30℃，200rpm，分别过夜培养。过夜培养液按1％的比例分别转接入新的lb培养基里30℃，200rpm，培养10小时，测od600，计算体积(mfc中od600＝0.5)，5000rpm离心10分钟，用阳极液重悬后，加入mfc阳极室中。

2、mfc产电

实验装置采用双室mfc,110ml阳极室(包含菌体和阳极液共110ml)和110ml阴极室，阳极碳布电极大小为1cm×1cm，阴极碳布电极大小为2.5cm×3cm，双室之间用质子交换膜隔开，质子交换膜用之前用1m盐酸水溶液过夜浸泡，并用无菌的蒸馏水冲洗三次。

阳极液包含6g/l磷酸氢二钠、3g/l磷酸二氢钾、0.5g/l氯化钠、1g/l氯化铵、1mm硫酸镁、0.1mm氯化钙、20mm乳酸钠、5％lb培养基，余量是水。阴极液包含50mm铁氰化钾、50mm磷酸氢二钾和50mm磷酸二氢钾，余量是水。mfc放在30℃培养箱中，阴阳两极连接2kω的外电阻。

3、电化学效果分析

循环伏安法(cv)以氯化银为参比电极，用多通道电化学工作站chi1000c扫描，扫速为1mv/s。线性扫描伏安法(lsv)从-0.87v扫到-0.1v，扫速为0.1mv/s，仪器为多通道电化学工作站chi1000c。

4、结果

由图2可以看出，产电重组希瓦氏菌δexemmfc产电具备较佳的产电性能，最高输出电压为120mv，相对于原始菌株野生型希瓦氏菌mr-1提高了38％；

利用生物电化学分析可以进一步研究mfc中胞外电子传递效率，图3所示是以扫速为0.1mv/s的线性扫描伏安图(lsv)即极化曲线，从图上可以看出，利用产电重组希瓦氏菌δ3171进行mfc发电的最大电流密度约为330ma/m²，最大功率密度为101.9mw/m²,相对于原始菌株野生型希瓦氏菌mr-1均得到大幅提升。

表1：本发明所涉及引物及其序列

序列表

<110>天津大学前沿技术研究院

<120>产电希瓦氏工程菌株及构建方法及用途

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>557

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcagtaaacctagtcatattaagggacttgg60

ctttattgttgtttaaatttttatttgggaacgtgattatttggttttaaaagagcaatt120

atttcaaaataattaaagactgattaagggttaaattaaccacgtatattgaatatggga180

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<210>2

<211>527

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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ggtaatagtgcaaatgggacccagctttcttgtacaaagtggtcccc527

<210>3

<211>1066

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3