本发明属于消毒学技术领域，涉及一种病毒灭活试验，尤指一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法。
背景技术：
随着社会经济的发展、环境的变迁、人们生活方式的改变等，一些新发和不明原因传染病(艾滋病、sars、禽流感、寨卡、手足口、埃博拉、埃可病毒等)，医院感染暴发和突发公共卫生事件频发，严重影响人们的健康及社会稳定。病毒引起的传染性疾病由于其爆发快，传染性强，极易造成严重后果，一旦发生后其传播途径与感染机制在短时间内是很难明确的，针对性预防和控制措施较难及时开展，而治疗病毒性传染病的特效药物与疫苗的研究生产需要进行大量的前期研究，一系列的原因导致在突发公共卫生事件和医院感染事件中，人类的措施存在相当大的滞后性；因此，为解决上述问题，普遍认为消毒是切断病毒的传播途径、预防和控制病毒传播的最简单、最有效的手段。
消毒工作是依靠消毒产品来实现的，《中华人民共和国传染病防治法》第29条，明确了消毒产品用于传染病防治的属性，因而消毒产品对病毒的灭活效果直接关系到人们的健康及社会稳定，我国对消毒产品病毒灭活效果的评价方法主要参照《消毒技术规范(2002版)》等法律法规及相关标准，一般选用脊髓灰质炎病毒-i型疫苗株(pv-i)作为指标病毒，该评价方法中的残留消毒剂的去除是关键，若残留消毒剂去除不彻底，则无法得到最准确、客观的病毒灭活效果的结果，导致评价结果失真。
为了准确检测、鉴定和评价消毒剂病毒灭活性能，经过一定的灭活时间后，需要去除残留消毒剂。
目前残留消毒剂的去除方法主要包括化学中和法与物理法，化学中和法利用化学物质之间的拮抗作用消除残留消毒剂，但是该方法中不同的化学中和剂以及中和后的产物都可能会对细胞产生影响。每次检测时需要去除残留消毒剂方法需鉴定合格后方可应用，但是中和剂法存在相当的不足：1、复方型消毒剂中和剂成分筛选十分繁琐且成功率十分低；2、不同的消毒剂有效物浓度不一致，常用中和剂成分的浓度不一定合理；3、中和剂成分本身不能对微生物或细胞有害。因此化学中和法需要进行足量的预备试验，耗费大量的时间和人力，而且随着消毒剂成分越来越复杂，合适的化学中和剂越来越难以寻找，已成为病毒灭活试验中难点；物理法包括稀释法，吸附柱法，分子筛柱法以及载体冲洗法，这些方法对消毒剂或者病毒有特殊要求，不能普遍性的推广。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明属于消毒学技术领域，旨在公开一种病毒灭活试验，尤指一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法，其特征在于，所述的去除方法包括以下步骤：
1)准备步骤：制备病毒悬液；
2)去除步骤：首先吸取消毒剂于试管内，水浴后进行除药处理，其次进行30～50倍稀释后超速离心，再其次弃上清液，最后加入细胞维持液进行稀释混匀，去除残留消毒剂；
3)检测步骤：吸加病毒悬液并混匀，进行病毒滴度测定。
优选地，所述步骤2)的水浴温度为20℃±1℃，时间为5min，离心条件为：转速为10000rpm～25000rpm，离心时间为1h～2.5h，温度为4℃。
优选地，所述步骤2)的加入细胞维持液进行稀释混匀后的体积为1ml～2ml。
优选地，所述步骤3)的检测步骤采用终点稀释法或噬斑法计算病毒感染滴度，以进行病毒滴度的测定。
优选地，所述步骤1)的制备病毒悬液包括以下步骤：
(1)取冻存的宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植于细胞维持液的细胞管内，吹吸4～7次，使细胞与细胞维持液混匀后高速离心，去上清液；然后加入细胞维持液，吹吸数次使混匀，再次离心后，转种于加有完全培养基的培养瓶中；
(2)取低温冻存的病毒毒种，37℃水浴融化，采用细胞维持液作10倍稀释，接种于步骤(1)的培养瓶中；然后置于37℃温箱中，以后续收获病毒；
(3)将含有病毒与宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，采用超声波法或者反复冻融法破碎宿主细胞，释放病毒；然后，离心并去除沉淀，取上清液，即病毒液；按每管1.0ml分装于体积为1.5ml的无菌离心管中，于-80℃冷冻保存；
(4)采用1支病毒液按病毒滴度测定法，测定病毒滴度；
(5)使用时，病毒液与有机干扰物1:1混合制成病毒悬液。
优选地，所述步骤(1)的离心条件为转速3000rpm，时间3min；步骤(3)的离心条件为转速6000rpm，时间15min。
本发明的有益效果体现在：本发明采用的残留消毒剂去除方法，可减少整过程中的消毒剂去除的试验时间，从传统的21～30天的工作时间缩减为4～7天，并且可以大程度提高病毒灭活试验的检测效率，由于现有的化学中和法应用时产生副作用影响，而本发明减少对化学剂的应用，可克服化学剂存在的影响，因此避免采用化学中和的方式可完全消除中和剂对病毒和细胞的不良影响；同时可适用于各类消毒剂和病毒，应用范围广。本发明可适用于消毒剂检测或消毒效果评价监测，是一种活的病毒及其细胞感染的检测技术，可用于评价各种用途的消毒因子对测试病毒的杀灭效果。
具体实施方式
下面详细说明本发明的具体实施方式：
一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法，其特征在于，所述的去除方法包括以下步骤：
1)准备步骤：制备病毒悬液；将待测消毒剂用灭菌硬水稀释至使用浓度的1.25倍；
2)去除步骤：首先吸取消毒剂于试管内，水浴后进行除药处理，其次进行30～50倍稀释后超速离心，再其次弃上清液，最后加入细胞维持液进行稀释混匀，去除残留消毒剂；本实施例中，加入细胞维持液并稀释混匀后体积为1ml～2ml，病毒悬液与消毒剂的容积比为1:4，病毒悬液为0.2ml～0.4ml；其中水浴温度为20℃±1℃，时间为5min，离心条件为：转速10000rpm～25000rpm，离心时间1h～2.5h，温度4℃；
3)检测步骤：吸加病毒悬液并混匀，吸取最终样本进行病毒滴度测定；检测步骤采用终点稀释法或噬斑法计算病毒感染滴度，以进行病毒滴度的测定；
所述步骤1)的制备病毒悬液还包括以下步骤：
(1)取冻存的宿主细胞，从液氮中取出，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植于细胞维持液的细胞管内，吹吸4～7次，使细胞与细胞维持液混匀后高速离心，去上清液；然后加入细胞维持液，吹吸数次使混匀，再次离心后，转种于加有10ml完全培养基的培养瓶中，逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒检测；离心条件为转速3000rpm，时间3min；
(2)取低温冻存的病毒毒种，37℃水浴融化，采用细胞维持液作10倍稀释，接种于步骤(1)的培养瓶中，如步骤(1)长满单层细胞的培养瓶；然后置于37℃温箱中，使细胞吸附、生长，逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒；
(3)将含有病毒与宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，采用超声波或反复冻融破碎宿主细胞，释放病毒；然后，离心并去除沉淀，沉淀主要为细胞碎片，取上清液，即病毒液；按每管1.0ml分装于体积为1.5ml的无菌离心管中，于-80℃冷冻保存；离心条件为转速6000rpm，时间15min；
(4)采用1支病毒液按病毒滴度测定法，测定病毒滴度；
(5)使用时，病毒液与有机干扰物1:1混合制成病毒悬液。
本发明在消毒产品监测的具体实施例：
一、适用范围
本实施例主要适用于消毒产品鉴定或日常监测，用具有一定代表性的、活的病毒及其细胞感染技术，评价各种用途的消毒因子对测试病毒的杀灭效果，对消毒因子的灭活病毒能力的重要方面进行验证。
二、试验器材
(1)试验用病毒株：脊髓灰质炎病毒ⅰ型(poliovirus-ⅰ，pv-ⅰ)疫苗株，肠道病毒71型(ev71)由广东省疾病预防控制中心提供；
(2)宿主细胞：hep-2细胞，作为pv-1的测试细胞；vero细胞系，作为ev71的测试细胞；两种细胞均由广东省疾病预防控制中心提供；
(3)细胞培养瓶与96孔培养板；
(4)试验设备：恒温水浴箱；二氧化碳培养箱；层流超净工作台；低温冰箱(-20℃，-80℃)；液氮罐；倒置显微镜；离心机；可调移液器及配套一次性塑料吸头；
(5)培养基：细胞维持培养基；细胞完全培养基；
(6)去离子水；
(7)使用的消毒剂为乙醇与三氯羟基二苯醚的复合消毒剂。
三、病毒悬液的制备
(1)从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀，立即离心(离心条件为3000rpm，3min)，去上清液；再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，同上离心后，转种于加有10ml完全培养基的培养瓶中；逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验；
(2)取出低温冻存的试验病毒毒种，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长；逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒；
(3)将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波或反复冻融破碎宿主细胞，释放病毒；然后尽快离心(6000rpm，15min)去除沉淀(主要为细胞碎片)，上清液即为所需的病毒悬液；按每管1.0ml分装于无菌离心管(1.5ml)中；
(4)取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度；其余均冷冻保存于-80℃备用。
四、病毒灭活滴度计算方法
病毒灭活滴度方法可采用终点稀释法或噬斑法计算病毒感染滴度，以进行病毒滴度的测定：
(一)终点稀释法病毒感染滴度的计算
以半数细胞感染剂量(tcid50)表示，tcid50的对数值计算公式如下：
tcid50对数值＝病变率高于50％组稀释度的对数值+距离比例
“病变率高于50％组”是指病变率超过50％的最低组，下简称“高于50％组”；“病变率低于50％组”是指病变率低于50％的最高组，下简称“低于50％组”；
具体计算方法如下：
1)计算细胞病变率：先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变(-)”和“细胞病变(+)”的累积总计值；计算“细胞病变(-)”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变(+)”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积；
各稀释度样本组“细胞病变(+)”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变(-)”与“细胞病变(+)”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率(％)；
2)计算距离比例：距离比例可按下式计算：
(二)噬斑法病毒感染滴度的计算
噬斑法病毒感染滴度，以噬斑形成单位数(pfu)，简称噬斑数表示；计数方法同活菌培养计数技术(参见《消毒技术规范(2002版)》2.1.1.3)；
每毫升测试样品中的病毒含量计算(pfu/ml)＝平板平均噬斑数×稀释倍数。
(3)平均灭活对数值的计算
平均灭活对数值按下式计算：设阳性(病毒)对照组平均病毒感染滴度(tcid50或pfu)的为n0，试验(消毒)组平均病毒感染滴度(tcid50或pfu)为nx；
得出：平均灭活对数值＝logno－lognx。
五、稀释法去除残留消毒剂的鉴定试验
(一)试验分组：
第1组：消毒剂+病毒悬液→接种培养
观察所试消毒剂对病毒有无灭活或抑制作用，对细胞正常生长有无影响；
第2组：(消毒剂+病毒悬液)+稀释法→接种培养
观察去除残留药物后病毒可否恢复对细胞的感染作用；
第3组：病毒悬液+稀释法→接种培养
观察除药处理对病毒滴度有无影响；
第4组：(消毒剂+稀释法)+病毒悬液→接种培养
第5组：病毒悬液→接种培养
观察病毒生长是否正常，并以该结果作为阳性对照值；
第6组：未接种病毒的细胞→培养
观察细胞生长是否正常；
(二)病毒悬液定量操作程序
病毒悬液的配置：病毒液与有机干扰物1：1混合；
按照产品说明书消毒剂为原液使用；
1)第1组：吸取消毒剂0.8ml于试管内，置20℃±1℃水浴中经5min后，吸加0.2ml病毒悬液，混匀；待作用至试验规定的灭活病毒时间，根据试验规定量，吸取该最终样液(或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液)，进行随后的病毒滴度测定；
2)第2组：吸消毒剂0.8ml于试管内，置20℃±1℃水浴中经5min后，吸加0.2ml病毒悬液，混匀；待作用至规定的时间，对此液进行除药处理，将测试样品50倍稀释后超速(25000rpm，2.5h，4℃)离心，弃上清液，再用细胞维持液稀释混匀至1ml，以去除残留消毒剂；根据试验规定量，吸取最终样本(或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液)，进行随后的病毒滴度测定；
3)第3组：吸取病毒悬液0.1ml，加0.9ml细胞基础培养液，做除药处理；将测试样品50倍稀释后超速(25000rpm，2.5h，4℃)离心，弃上清液，再用细胞维持液稀释混匀至1ml，以去除残留消毒剂；根据试验规定量，吸取最终样本(或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液)，进行随后的病毒滴度测定；
4)第4组：吸消毒剂0.8ml于试管内，置20℃±1℃水浴中经5min后，对此液进行除药处理，将测试样品50倍稀释后超速(25000rpm，2.5h，4℃)离心，弃上清液，再用细胞维持液稀释混匀至0.8ml，以去除残留消毒剂；吸加0.2ml病毒悬液，混匀，根据试验规定量，吸取最终样本(或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液)，进行随后的病毒滴度测定；
5)第5组：吸取病毒悬液0.2ml，加细胞维持液0.8ml，不加消毒剂亦不做任何除药处理；根据试验规定量，吸取该病毒悬液(或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液)，进行随后的病毒滴度测定；
6)第6组：向未接种病毒的细胞管内，加入完全细胞培养基培养。
(三)评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测物理除药法可判为合格：
1)第1组无试验病毒，或仅有少量生长；
2)第2组有远较第1组为多，但明显较第3组～第5组为少的试验病毒生长；
3)第3、4、5组试验病毒生长量相近；
4)连续3次试验取得合格评价；
5)可使用病毒载体，按同样的原理与操作步骤进行试验，判定合格标准相同。
六、病毒灭活试验
1、试验分组
1)试验组：根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设定适宜的浓度与作用时间组(不少于1个浓度，3个作用时间)，对作用时间的设计应不短于30s；
2)阳性对照组：用去离子水代替消毒剂，按试验组规定步骤加入病毒悬液进行试验和培养，观察病毒生长是否良好；
3)阴性对照组：用不含病毒的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好；
2、病毒悬液定量灭活试验操作程序
1)从液氮中取出冻存的试验宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后，转种于加有10ml完全培养基培养瓶中；逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于灭活试验；
2)取出低温冻存的病毒，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于含已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长；逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒；收获时，将培养液取出，用超声波或反复冻融破碎宿主细胞，尽快离心，并将含病毒的上清液按每管1.0ml分装于无菌离心管(1.5ml)中，冷冻保存于-80℃备用；
3)取待测消毒剂，于20℃±1℃水浴中备用；
4)取100μl有机干扰物质与100μl病毒原液混合，于20℃±1℃水浴中作用5min，加入0.8ml待检消毒剂，立即混匀并记时；作用规定时间，用经鉴定合格的除药方法处理；
5)阳性(病毒)对照组试验中，用无菌去离子水代替消毒剂；
6)各组分别进行病毒滴度测定，可采用终点稀释法或噬斑法进行；
7)试验重复3次；
8)终点稀释法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后在96孔培养板上滴定各稀释度样本中残留的病毒量，每个稀释度做4孔(各孔中应该已经长满单层的宿主细胞)，在37℃，放置1h～2h，以确保残留病毒全部吸附在细胞上；取出培养板，更换细胞维持培养液；继续放入二氧化碳培养箱中(37℃，5％co2)培养，逐日在显微镜下观察细胞病变，连续观察3d，逐孔观察并记录细胞病变情况；
终点稀释法病毒感染滴度的计算：以半数细胞感染剂量(tcid50)表示。
3、评价规定
1)病毒灭活试验，可用于评价医疗器械、食具、物体表面和皮肤用化学消毒剂对病毒的灭活效果；病毒的灭活滴度，应达到4个对数值；
2)在正常情况下，3次试验的平均灭活对数值≥4.00，可判为对病毒污染物消毒的实验室试验合格；同时，阳性对照组病毒滴度对数值应在5～7之间。
七、实验结果
pv-i灭活稀释法：
1、pv-i灭活稀释法去除残留消毒剂的鉴定试验
第(1)组平均病毒滴度(tcid50)的对数值为0.82，第(2)组平均病毒滴度(tcid50)的对数值为1.58，第(3)、(4)、(5)组平均病毒滴度(tcid50)的对数值相近，三组间误差率为3.86％，第(6)组细胞生长良好(表1)：
表1残留消毒剂中和稀释法的鉴定试验结果
2、pv-i灭活效果
经3次重复试验表明：在试验温度20℃±1℃时，该消毒剂原样，0.5min、1min、1.5min对pv-i的平均灭活对数值均为>4.00(表2)：
表2消毒剂对pv-i灭活效果试验结果
细胞对照：细胞生长良好。
ev71病毒灭活试验：
1、ev71病毒灭活试验中的中和剂鉴定试验
第(1)组平均病毒滴度(tcid50)的对数值为<0.5，第(2)组平均病毒滴度(tcid50)的对数值为1.00，第(3)、(4)、(5)组平均病毒滴度(tcid50)的对数值相近，三组间误差率为0.73％；(6)细胞生长良好(表3)：
表3残留消毒剂中和稀释法的鉴定试验结果
2、ev71病毒灭活效果
经3次重复试验表明：在试验温度19℃～21℃时，该消毒剂原样，1min、2min、3min，对ev71病毒的平均灭活对数值均为>4.00(表4)：
表4消毒剂对ev71病毒灭活效果试验结果
细胞对照：细胞生长良好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明的技术范围作任何限制，本行业的技术人员，在本技术方案的启迪下，可以做出一些变形与修改，凡是依据本发明的技术实质对以上的实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。