一种生物酶法合成乳清酸的方法

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种多酶反应催化合成乳清酸的方法及应用，属于乳清酸的酶催化制备领域。

背景技术：

乳清酸，即6-羧基尿嘧啶，酮式名称是1,2,3,6-四氢-2,6-二氧-4-嘧啶羧酸，烯醇式名称是2,6-二羟基嘧啶-4-羧酸，也称维生素b13。乳清酸主要存在于根茎类蔬菜、乳浆、酸奶或炼乳的液态部分，作为生物活体嘧啶核酸生物合成过程中的重要中间体，在生物和药物化学中发挥独特的作用(routdk,etal.macromolecules,2002,27(11):2945-2950)。

乳清酸及其衍生物在医药领域用途广泛。在60年代，乳清酸用于治疗黄胆和一般肝脏机能障碍(王玉明等营养学报，2009.31(4))，近年来虽然渐渐被新药代替，但在改善肝功能、促进肝细胞的修复以及其它方面仍然发挥作用。乳清酸基团参与的药物分子可治疗痛风病、心肌梗塞、胃溃疡、增结核杆菌。另外，乳清酸还可用于免疫辅药，作为化学品中毒的预防剂和治疗剂。在食品和饲料行业，乳清酸主要用作食品和饲料添加剂。在化妆品工业主要用作增白剂中间体。

乳清酸是合成嘧啶碱基(尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶)和嘧啶碱基结构类似物(例如5-氟尿嘧啶)的原料，而这些化合物是合成一些抗肿瘤、抗病毒药物的中间体(dong,etal.chemjchinuni,1996,17(6):973-977)。已经开发出以乳清酸为原料生产的核酸类保健食品与药物，能影响和控制许多生命代谢活动，对延缓人体衰老具有明显效果。由于乳清酸用途广泛，因而对其合成研究越来越得到重视。

目前，具有工业化前景的乳清酸合成技术主要分为化学合成法和发酵法。化学合成法近年已报到多种路线：一是从氨甲酰天冬氨酸出发，合成乙内酰脲基代醋酸，接着合成羧基甲基乙内酰脲，最终合成乳清酸(吴信等.一种乳清酸的制备方法.2015)。该方法需要高压，反应条件苛刻，收率只有56％；二是将甘脲和乙二醛在碱性溶液中先缩合，再通氯气氧化，一锅法制得乳清酸粗品，粗品经脱色精制得到乳清酸，收率达30％(石常青.一种乳清酸的合成方法.2016)；三是将马来酰脲与溴反应，再向反应体系中倒入碱性溶液，形成含乳清酸盐的混合物，再调ph至酸性，分离纯化出乳清酸，收率达48％(陈晓龙等.一种制备乳清酸的方法.2017)。日本从60年代已开始研究发酵法(kiyoshinakayama,zenrokusato.nipponnogeikagakukaishi,1965,39(3))，张等使用谷氨酸棒杆菌jsim-201的尿嘧啶营养缺陷突变菌株u-12，在最佳发酵工艺条件下，积累乳清酸最高达到8.6g/l(张一平等.无锡轻工大学学报.2003.22(3))。此外还有报道使用白色念珠菌ura3突变体，以乙酸盐为前体最高可产3g/l乳清酸(takashinezu,osamushimokawa.microbiolimmunol,2004,48(10))。但是发酵法产品收率较低。而现有的化学合成方法制得的产品中容易包含杂质，不易制备高纯度的乳清酸产品，且工业化生产中操作繁琐，通常还会产生大量环境有害的物质，不利于环境保护，也不利于生产人员的身心健康。

因此，亟需研发一种高收率、高纯度且操作简便、环境友好的乳清酸制备方法。虽然乳清酸合成的研究主要集中在化学合成上，但在生物体内，乳清酸可通过酶反应获得。目前尚无体外酶法合成乳清酸的报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种高收率、高纯度且操作简便、环境友好的生物酶法合成乳清酸的方法。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种生物酶法合成乳清酸的方法，其特征在于，以氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、二氢乳清酸合成酶、二氢乳清酸脱氢酶组成多酶催化体系，催化底物转化为乳清酸，所述底物包括谷氨酰胺和/或氨、co2和/或碳酸氢盐、天冬氨酸、atp和/或adp，和其它少量无机盐。

作为一个优选方案，催化反应为，氨甲酰磷酸合成酶催化co2和/或碳酸氢盐，谷氨酰胺和/或氨，atp和/或adp形成氨甲酰磷酸；天冬氨酸转氨甲酰酶催化氨甲酰磷酸和天冬氨酸生成氨甲酰天冬氨酸；二氢乳清酸合成酶与天冬氨酸转氨甲酰酶催化氨甲酰天冬氨酸为二氢乳清酸；随后二氢乳清酸脱氢酶催化二氢乳清酸生产乳清酸。

作为一个优选方案，所述氨甲酰磷酸合成酶的含量为5-15u/ml，所述天冬氨酸转氨甲酰酶的含量为1-3u/ml，二氢乳清酸合成酶的含量为0.4-1u/ml，二氢乳清酸脱氢酶的含量为0.7-3u/ml。

氨甲酰磷酸合成酶的含量为：每分钟生成1μmoladp所需的酶量；天冬氨酸转氨甲酰酶的含量为：每分钟生成1μmol氨甲酰天冬氨酸所需的酶量；二氢乳清酸合成酶的含量为：每分钟消耗1μmol氨甲酰天冬氨酸所需的酶量；二氢乳清酸脱氢酶的含量为：每分钟生成1μmol二氢乳清酸所需的酶量。

作为一个优选方案，催化反应温度为30-45℃，ph为8.0-6.0，反应时间2-5h。

氨甲酰磷酸合成酶(carbamylphosphatesynthetase；carbamoylphosphatesynthetase，ec6.3.5.5，简称为cps)参与生物体内嘧啶核苷酸的合成，催化谷氨酰胺、atp和碳酸根合成氨甲酰磷酸的酶。

天冬氨酸转氨甲酰酶(aspartatecarbamoyltransferase，ec2.1.3.2，简称为atcase)是嘧啶核苷酸从头合成中很重要的一个酶，它催化的是天冬氨酸与氨甲酰磷酸生成氨甲酰天冬氨酸和磷酸的反应。

二氢乳清酸合成酶(dihydroorotase，ec3.5.2.3，简称为dhoase)在嘧啶核苷酸合成过程中催化氨甲酰天冬氨酸和二氢乳清酸可逆的脱水反应。

二氢乳清酸脱氢酶(dihydroorotatedehydrogenase，ec1.3.98.1，简称为dhod)，在嘧啶生物合成过程中，催化二氢乳清酸脱氢生成乳清酸的酶。

作为一个优选方案，所述氨甲酰磷酸合成酶的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述天冬氨酸转氨甲酰酶的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述二氢乳清酸合成酶的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述二氢乳清酸脱氢酶序列如seqidno.4所示。

本发明的一个实施例中，所需的氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、二氢乳清酸合成酶、二氢乳清酸脱氢酶的制备方法如下：

(1)将seqidno.1～4所示的核苷酸序列分别连接质粒中，得到重组质粒，然后转化至rosetta(de3)，得到重组菌。

(2)培养重组菌，诱导表达重组蛋白，在利用压力破碎仪破碎收集的菌体，离心收集上清中的粗酶液，通过镍亲和层析柱纯化4种蛋白。

本发明的一种实施方式中，所述重组菌以pet-28a(+)为表达载体。

本发明的一种实施方式中，所述重组菌以rosetta为宿主菌。

本发明的一种实施方式中，所述体外催化反应以co2和氨水作为c、n供体，催化乳清酸的合成。

本发明的优点在于：(1)本发明构建的方法实现了在体外利用纯酶反应以碳酸氢盐和天冬氨酸等为原料合成乳清酸；(2)通过对反应温度、ph、酶量和底物浓度等进行优化和控制，提高了体外合成乳清酸的能力，可以避免微生物发酵法带来的副产物多，后续分离工艺等不利影响；(3)本发明可对偶联体系进行反应条件优化，确立最佳反应条件，提高乳清酸的产量；(4)体外纯酶反应可以缩短生产周期，本发明仅需要2-5h即可获得产物，而微生物发酵法则需要72h，本发明有效缩短反应时间。

附图说明

图1为酶催化体外合成乳清酸反应流程图。

图2为多酶体系各酶纯化电泳图。

图3为乳清酸标准品液相图谱。

图4为酶反应产物液相图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

以下实施例中所用的氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶来自大肠杆菌escherichiacoli，二氢乳清酸合成酶来自超嗜热菌aquifexaeolicus，二氢乳清酸脱氢酶是来自克氏锥虫trypanomacruzi。以上所用的酶，只是本发明的较佳选择，但本发明的酶不限于此来源，根据嘧啶代谢途径的性质，具有所述功能的酶均可以实现本发明之目的。将各自的基因分别连接至pet28a表达载体上，转化至大肠杆菌rosetta(de3)，得到的阳性克隆培养至od600为0.6-0.8，加入终浓度为0.2mm的iptg，18℃，220rpm诱导培养16h。

实施例1.

乳清酸体外合成相关酶的纯化，具体步骤如下：

(1)分别接四种重组菌至50ml含有50mg/l卡那霉素的lb中，37℃，220rpm培养7h，随后按2％接种量接入100ml的lb中于37℃培养，待od600达0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mm的iptg，置于18℃，220rpm诱导16h。

(2)6000rpm，4℃离心5min离心收集菌体，弃去上清，加入适量的含有10mm咪唑，500mm的nacl的ph8.0，20mm的tris-hcl重悬菌体(没过菌体即可)。提前将冷却水循环机打开，降温至5℃，随后将重悬后的菌体加入压力破碎机进行破碎，压力为600-800bar，流速35，循环30次左右，直至菌液变澄清。

(3)收集破碎后的菌体，4000rpm，4℃离心20min。配置含有梯度浓度咪唑(0mm、10mm、60mm、100mm、120mm、150mm、300mm)的ph8.0，500mm的nacl，20mm的tris-hcl洗脱液。将离心后的上清倒入镍柱中，用上述缓冲液进行洗脱，0-100mm咪唑浓度的缓冲液洗脱5倍柱体积，120mm咪唑浓度缓冲液洗脱1倍柱体积，5倍柱体积的150mm咪唑浓度下缓冲液洗脱并收集，后用含300mm咪唑的缓冲液冲洗几遍，再用纯水冲洗，最后将层析柱保存至ph8.0，500mm的nacl，20mm的tris-hcl缓冲液中。

(4)将150mm咪唑浓度下收集的洗脱液加入孔径为10000mwco的超滤膜中，4200g，4℃离心，随后加入带有0mm咪唑的缓冲液去除咪唑，待离心后剩余蛋白体积达0.5ml左右时，将蛋白转移至1.5ml离心管中，加入0.5ml的50％的分子级甘油，混匀后按100μl分装至小离心管中，随后置于-80℃保存备用。对纯化得到的蛋白进行sds-page分析，结果如图2所示。其中1号泳道为proteinmaker(high)；2号泳道为e.coli来源氨甲酰磷酸合成酶；3号泳道为proteinmaker(low)；4号泳道为e.coli来源天冬氨酸转氨甲酰酶；5号泳道为a.aeolicus来源天冬氨酸转氨甲酰酶；6号泳道为a.aeolicus来源二氢乳清酸合成酶；7号泳道为t.cruzi来源二氢乳清酸脱氢酶；8号泳道为jhaorihellathermophile来源多聚磷酸激酶。

实施例2.

乳清酸体外合成，具体步骤如下：

反应体系：氨甲酰磷酸合成酶的浓度为7.5u/ml，天冬氨酸转氨甲酰酶的浓度为2u/ml，二氢乳清酸合成酶的浓度为0.5u/ml，二氢乳清酸脱氢酶的浓度为0.8u/ml。

反应体系及反应条件：初始反应体系包括100mmkcl,24mmnahco3,24mmgln,6mmasp,48mmatp,20mmmgcl2,50mmpb缓冲液，总体积1ml，45℃，ph8.0反应1h；后12000rpm离心2min，取500μl上清液调整体系ph至6.0，加入50mmfumaricacid,0.1mmfmn,0.1mmcocl2，用水补充总体积至1ml，45℃，反应时间为1h，得到产物乳清酸。

按实施例2的体外合成体系，用高效液相色谱检测乳清酸的含量，最终产量为2.4mm，以加入的天冬氨酸计算产率为80.0％。

实施例3.

乳清酸体外合成，具体步骤如下：

反应体系：氨甲酰磷酸合成酶的浓度为9u/ml，天冬氨酸转氨甲酰酶的浓度为3u/ml，二氢乳清酸合成酶的浓度为0.8u/ml，二氢乳清酸脱氢酶的浓度为0.7u/ml。

反应体系及反应条件：初始反应体系包括20mmkcl,50mmnh4hco3,10mmasp,35mmatp,80mmmgcl2,60mmpb缓冲液。总体积1ml，30℃，ph8.3反应时间为1.5h；后用稀盐酸调整体系ph至6.5，加入60mmfumaricacid,0.2mmfmn,0.3mmcocl2,用水补充总体积至1.5ml，30℃，反应时间为2h，得到产物乳清酸。

按实施例3的体外合成体系，用高效液相色谱检测乳清酸的含量，最终产量为5.2mm，以加入的天冬氨酸计算产率为78％。

实施例4.

乳清酸体外合成，具体步骤如下：

反应体系：氨甲酰磷酸合成酶的浓度为15u/ml，天冬氨酸转氨甲酰酶的浓度为1u/ml，二氢乳清酸合成酶的浓度为0.4u/ml，二氢乳清酸脱氢酶的浓度为1u/ml，多聚磷酸激酶的浓度为3u/ml。

反应体系及反应条件：初始反应体系包括100mmkcl,150mmnh4hco3,20mmasp,2mmadp,10mmpolyp,20mmmgcl2,50mmpb缓冲液。总体积1ml，40℃，ph8.0反应时间为3h；后用稀盐酸调整体系ph至6.7，加入100mmfumaricacid,0.12mmfmn,0.1mmcocl2,用水补充至总体积1.5ml，40℃，反应时间为3h，得到产物乳清酸。

按实施例4的体外合成体系，用高效液相色谱检测乳清酸的含量，最终产量为11.2mm，以加入的天冬氨酸计算产率为84％。

实施例5.

乳清酸体外合成，具体步骤如下：

反应体系：氨甲酰磷酸合成酶的浓度为5u/ml，天冬氨酸转氨甲酰酶的浓度为1u/ml，二氢乳清酸合成酶的浓度为1u/ml，二氢乳清酸脱氢酶的浓度为2u/ml，多聚磷酸激酶的浓度为2u/ml。

反应体系及反应条件：初始反应体系包括30mmasp,3mmadp,20mmpolyp,50mmmgcl2,60mmpb缓冲液。总体积1ml，30℃，ph8.0反应时间为3h；后用稀盐酸调整体系ph至6.3，加入0.2mmfmn,0.12mmcocl2,用水补充至总体积1.5ml，45℃，反应时间为4h，得到产物乳清酸。

按实施例5的体外合成体系，用高效液相色谱检测乳清酸的含量，最终产量为14.8mm，以加入的天冬氨酸计算产率为74％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>华东理工大学

<120>一种生物酶法合成乳清酸的方法

<130>、

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4388

<212>dna

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<213>人工序列(artificialsequence)

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